高活性酵母核糖体的色谱分离纯化

Biology

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Summary

准备用传统的方法,纯化共同净化核酸酶和蛋白酶的真核细胞的核糖体的污染造成了消极影响下游的生化和结构分析。一个快速和简单的色谱的净化方法是用来解决这个问题作为一个模型系统中使用的酵母核糖体。

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Meskauskas, A., Leshin, J. A., Dinman, J. D. Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes. J. Vis. Exp. (56), e3214, doi:10.3791/3214 (2011).

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Abstract

真核生物核糖体相比,他们真细菌和archael更加不稳定,从而构成了重大挑战,研究人员。特别麻烦的是,细胞溶解释放大量的蛋白酶和核酸,这可以降低核糖体。因此,重要的是尽可能快地从这些酶中分离出来的核糖体。不幸的是,传统的差分离心方法叶时间不可接受的长期接触这些酶的核糖体,影响其结构的完整性和功能。为了解决这个问题,我们利用一个色谱法使用收费Sulfolink树脂半胱氨酸。这个简单,快速的应用显着降低水解蛋白和nucleolytic活动,共同净化生产完好,高度生化活性酵母核糖体的高产量。我们建议,这种方法也应适用于哺乳动物的核糖体。简约的方法,增强的纯度和色谱纯化的核糖体的活动的一个显著的技术进步,为真核细胞的核糖体的研究。

Protocol

1。半胱氨酸负责筹备Sulfolink树脂

  1. 准备Sulfolink树脂(皮尔斯)在室温下。
  2. 广场共10毫升50%的Sulfolink耦合两个10毫升的塑料瓶制造商提供的凝胶浆,分发到每个小瓶5毫升。
  3. 短暂离心瓶850 XG,小心取出上清液。
  4. 耦合缓冲冲洗凝胶3次(50毫米三,pH值8.5,5毫米EDTA)resuspending在5毫升的珠子,离心850简要XG和消除吸取上清液。
  5. 每管添加50毫米的L -半胱氨酸耦合缓冲溶液5毫升,混合浆料1小时25 ° C。
  6. 删除残留洗涤步骤1.4以上所述的L -半胱氨酸。
  7. 10毫升结合缓冲液重悬凝胶[20毫米的HEPES,pH值7.6,5毫米镁(OAC)2,60毫米NH 4 CL,2毫米的数码地面电视],和平衡的结合缓冲液10毫升冲洗树脂中所述的步骤1.4的3倍。倒出树脂到10 ml离心柱,帽和保存在4 ° C。为RNA结合树脂能力是〜20每毫升260个单位。

2。使用半胱氨酸核糖体的色谱净化收取Sulfolink树脂

注:如果与蛋白酶的活性,证明是一个问题的应变工作,可在随后的所有缓冲区使用蛋白酶抑制鸡尾酒。

  1. 保持冰的所有组件,并准备使用无RNase水和无菌过滤所有的解决方案。
  2. 一夜之间日志中期阶段(外径595 ​​= 0.6 - 1.2),在适当的媒体成长的酵母细胞。离心沉淀细胞,并洗为5分钟1克细胞结合缓冲液,并在3700 XG离心机在4 ° C。
  3. 悬浮细胞在结合缓冲液1毫升约2毫升的总量,并扰乱使用0.5毫米的玻璃珠等体积冷却到4 ° C U唱一个Biospec迷你珠打浆机(巴特尔斯维尔,确定)。样品可以根据需要分割成多个管。
  4. 在离心30分钟,在一个贝克曼 - 库尔特舰最大发送超速离心机(富勒顿,加利福尼亚州)30,000 XG取出完整的细胞,细胞器和细胞碎片。
  5. 使用前一分钟,颗粒树脂在1000 XG删除的存储解决方案。两个毫升树脂是用​​于一克的每一个细胞。
  6. 删除从30,000 XG自旋(S30)的细胞裂解液上清,直接将收取的Sulfolink浆照顾,以尽量减少污染脂质的一小部分的顶部或在管底部的细胞碎片,并将其放置。脂质层,可避免通过去除或推从吸管尖后上清液越过。
  7. 在冰上孵育S30/Sulfolink混合搅拌15分钟。
  8. 放入15 m​​l锥形管列在1000 XG离心机v一个分钟。
  9. 入列,用手拌匀,并孵化了15分钟在冰上将流出液组分。
  10. 放入15 m​​l锥形管的列,并在1000 XG离心一分钟。舍弃流出液。
  11. 第列和结合缓冲液中添加5毫升。手工混合列至重悬,取下镜头盖,并在一分钟1000 XG列离心机离心机。重复此洗涤协议两次。
  12. 洗脱缓冲液1.5毫升(20毫米HEPES - KOH,pH值7.6,10毫米MG(OAC)2,氯化钾500毫米,2mm的数码地面电视,0.5毫克/毫升肝素),每一列。手工混合的泥浆,并在冰上孵育2分钟
  13. 进入新的15 ml锥形管和离心机的地点列在1000 1分钟XG。收集洗脱液。重复洗脱步骤,再次使最终合并后的样品量〜3毫升。的树脂可与洗脱缓冲液洗涤,无肝素和平衡约束力buffeR,并存储在10毫升卷的结合缓冲液在4 ° C,再以后使用。

3。嘌呤霉素治疗

注:另一种方法,以消除污染tRNA的物种是从富含葡萄糖葡萄糖耗尽的媒体,以促进核糖体径流开关。然而,这并不改变的酵母细胞,这可能会影响核糖体的功能和浓度的代谢状态。

为了地带核糖体从内源性肽酰- tRNA,与治疗嘌呤霉素进行。

  1. 中性pH值7.5 100毫米嘌呤的解决方案,在室温下加入1M氢氧化钾滴加。
  2. 新增瓦解嘌呤解决〜1mm的终浓度洗脱液。
  3. 100毫米的GTP到终浓度为1毫米。
  4. 孵育30分钟,30 ° C。

4。通过甘油垫子沉淀净化核糖体

  1. 放置一个毫升缓冲垫成4毫升量聚碳酸酯超速离心机管(20毫米的HEPES,pH值7.6,10毫米镁(OAC)2,500毫米氯化钾,2毫米数码地面电视,25%甘油)。
  2. 轻轻层嘌呤霉素治疗垫顶部,洗脱组分离心样品在10万XG 4℃过夜° C。
  3. 删除离心机转子管,吸出上清液。
  4. 两次纯化的核糖体含有1毫升缓冲液洗颗粒。
  5. 在100温柔中断使用玻璃棒的气垫缓冲液重悬核糖体。
  6. 中断后,用封口膜管,并在一个适中的速度在寒冷的房间涡旋摇一小时。
  7. 离心管,离心5分钟以最大的速度在4 ° C,传输的内容和新鲜管去除上清。
  8. 重复步骤4.1至4.7 2毫升的缓冲垫,除了存储缓冲区100μL(50毫米的HEPES - KOH pH值7.6,50 mM的NH 4 CL,5毫米镁(OAC)2,1毫米DTT,25%的甘油)是用来代替气垫缓冲步骤4.4和4.5 。
  9. 量化纯化的核糖体分光光度计(1一260 = 20 pmoles酵母核糖体),并储存于-80 ° C。从酵母1克的典型结果是300-400核糖体pmoles。

5。代表性的成果:

从每个协议的三个主要步骤提取的RNA物种的一个例子是如图2所示。虽然rRNAs的主要品种目前在总细胞裂解物(T)的这些还含有大量的其他RNA物种。从Sulfolink列(SL)纯化的核糖体,也包含了这些物种的高柱床的亲和力以及由于大量的tRNA。从核糖体治疗,这在从肽酰- tRNA的多肽水解嘌呤结果的一小部分,并促进这些物种的解离。嘌呤霉素治疗的样本(下午)缺乏合作purifyin克tRNA的物种,从而代表完全纯净的核糖体。据此前报道8,这些核糖体是高度完整和生化活跃,使他们详细的功能和结构分析的理想衬底。

图1
图1。层析纯化方法的流程图。使用挂钩sulfolink树脂的半胱氨酸核糖体描绘。

图2
图2。代表分析核糖体的筹备工作。总RNA的物种分别提取总细胞裂解物(T)Sulfolink纯化的核糖体(SL),并随后与嘌呤霉素治疗Sulfolink纯化的核糖体,并通过甘油垫(下午)沉淀。巷M代表RNA的大小标记。乐队代表25S和18S rRNAs,以及tRNA基因和其他RNA物种表示。所有车道装有2微克的RNA。

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Discussion

核糖体净化协议主要涉及裂解细胞,收获一个细胞质分数从低转速旋转,然后造粒核糖体由高速离心1。虽然提出了一些新颖的方法已被用于净化细菌核糖体,同样没有被真正的真核生物2-4。虽然这些年来,例如盐清洗和甘油垫子(如看到5)增加额外的步骤,酵母核糖体的生化和结构的研究已阻碍了他们的倾向,成为在净化过程中的内源性降解酶降解,最有可能由于长期的时间在离心过程中接触到这些酶6类核糖体的步骤。

与传统的协议相关的主要问题是与核糖体的蛋白酶和核酸的净化。这个结果在其降解纯化过程中,造成产量降低生化活跃的核糖体。目前在临床分离的致病菌蛋白酶和核酸含量高,导致了核糖体的使用收取Sulfolink 树脂 7半胱氨酸的净化色谱法的发展。 rRNAs和使用此方法分离出的细菌核糖体的蛋白质出现退化的水平要低得多,和显著更能够绑定红霉素和合成蛋白质纯化的核糖体。核糖体结合Sulfolink树脂的具体化学是未知的,但是据推测,它涉及的疏水相互作用。这些意见建议,收取Sulfolink树脂色谱法半胱氨酸也可能适用于酵母核糖体,如果是这样,它可以解决许多问题上面描述。因此,我们适应完好,高活性酵母核糖体的隔离协议somes。柱层析法快速,高效地在一个在素净的核糖体,更多的生化活动,增强的生化和结构特性,尺度以及更高数量核糖体8核糖体准备污染核酸酶和蛋白酶的显著部分分离的结果。无显着性差异,表明这些核糖体包含所有相同的传统纯化的核糖体核糖体元素之间的传统纯化的核糖体,并通过柱层析纯化的变性蛋白凝胶。

协议中有一些步骤需要特别注意的。关于酵母细胞的破坏,一个精确的细胞悬液,按1:1的比例,以玻璃珠(体积/体积)是至关重要的。通常情况下,在2分钟〜80%的细胞被破坏。重要的是,应避免过度破坏,以防止细胞器降解酶的释放。虽然从Sulfolink列直接获得的核糖体被证明是几乎完全的蛋白酶和核酸污染,这个分数高的水平,在tRNA的观察表明,树脂结合 tRNA以及7,8。我们发现,tRNA的物种的存在干扰了下游的生化检测,如核糖体/配体结合,peptidyltransferase活动的分析和rRNA的结构分析。嘌呤霉素治疗9一起10-14 deacylated tRNA的色谱分离出核糖体肽,嘌呤霉素,这是从核糖体释放,生产的结果。通过甘油垫样品最后隔夜高速离心删除其余自由的tRNA从核糖体样品的关键。如果需要单独的亚基,他们可能会获得通过沉淀,通过高盐蔗糖梯度15

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

我们衷心感谢Dinman实验室的所有成员,包括阿什顿Belew,莫文蔚杰克,Sharmishtha Musalga,谢尔盖Sulima,Shivani雷迪,他们的帮助和在这个项目上的投入和Michael Rhodin。这项工作得到了补助金,上午由美国心脏协会(AHA 0630163N)和开发部的国立卫生研究院(5R01 GM058859 - 12)。日航是支持美国再投资和恢复法案2009年补充父补助金(3R01GM058859 11S1)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sulfolink Coupling resin Pierce, Thermo Scientific 20402
Mini bead-beater 16 Biospec Products 607
Optima Max E ultracentrifuge Beckman Coulter Inc.
Legend RT Sorvall, Thermo Scientific
0.5 mm Glass beads Biospec Products 11079105
Tris Sigma-Aldrich 252859
EDTA Sigma-Aldrich E9884
DTT Sigma-Aldrich 43815
HEPES Sigma-Aldrich 54459
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434
KCl Sigma-Aldrich 60128
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661
KOH Sigma-Aldrich 221473
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Puromycin Sigma-Aldrich P7255
GTP Fermentas R0461

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References

  1. Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
  2. Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
  3. Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
  4. Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
  5. Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
  6. Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
  8. Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
  9. Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
  12. Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
  13. Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
  14. Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
  15. Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).

Comments

2 Comments

  1. Could you please add the following two products to the material list, or provide the details here so I can repeat the protocol without guessing what you precisely used:

    L-cysteine
    heparin

    Reply
    Posted by: Kim v.
    March 31, 2013 - 8:43 PM
  2. L-cysteine: Acros Organics Cat. #173600²50;
    heparin: Sigma Cat. #H4784.

    Reply
    Posted by: Arturas M.
    April 4, 2013 - 10:49 AM

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