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Cambio de la dirección y la orientación del campo eléctrico durante la aplicación pulsos eléctricos Mejora la transferencia de genes plásmido In vitro

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Summary

Transfección de genes mediante electroporación se mejora aproximadamente dos veces en la orientación del campo eléctrico se modifica durante la aplicación de pulsos, mientras que la viabilidad celular no se ve afectada. El aumento de la transfección de genes es causada por el aumento de la superficie de membrana que se hace competente para la entrada de ADN en la célula.

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Pavlin, M., Haberl, S., Reberšek, M., Miklavčič, D., Kandušer, M. Changing the Direction and Orientation of Electric Field During Electric Pulses Application Improves Plasmid Gene Transfer in vitro. J. Vis. Exp. (55), e3309, doi:10.3791/3309 (2011).

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Abstract

Gene electrotransferencia es un método físico utilizado para introducir genes en las células mediante la aplicación de pulsos eléctricos cortos e intensos, que provocan la desestabilización de la membrana celular, por lo que es permeable a pequeñas moléculas y permite la transferencia de moléculas grandes como el ADN. Representa una alternativa a los vectores virales, debido a su seguridad, eficacia y facilidad de aplicación. Para el gen de electrotransferencia diferentes protocolos de impulsos eléctricos se utilizan con el fin de lograr la máxima transfección de genes, uno de ellos es cambiar la dirección del campo eléctrico y la orientación durante la entrega de pulso. Cambio de la dirección del campo eléctrico y la orientación de aumentar la superficie de la membrana competente para la entrada de ADN en la célula. En este video, se demuestra la diferencia en la eficacia del gen electrotransferencia cuando todos los pulsos son entregados en la misma dirección y, cuando las leguminosas son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación. Para este propósito la punta con electrodos integrados y de alta tensión del generador prototipo, que permite cambiar de campo eléctrico en diferentes direcciones durante la aplicación de pulsos eléctricos, fueron utilizados. Gene eficacia electrotransferencia se determina 24 horas después de la aplicación de pulsos como el número de células que expresan la proteína verde fluorescente dividido por el número de todas las células. Los resultados muestran que la transfección de genes se incrementa cuando la orientación del campo eléctrico durante la entrega de impulsos eléctricos se cambia.

Protocol

1. Cultivo de células, plásmido y la preparación de amortiguamiento para el experimento

  1. En este experimento células ováricas de hámster chino (CHO-K1) se utilizan. Las células se cultivan en una mezcla de nutrientes HAM-F12 (PAA) suplementado con 2 mM L-glutamina, un 10% de suero fetal bovino, 400 l / l de gentamicina (todos de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemania), y 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Croacia). Las células se mantuvieron a 37 º C en un humidificado 5% de CO2 la atmósfera en la incubadora durante 24 horas.
  2. Amplificar plásmido pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, EE.UU.) que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) en la cepa de Escherichia coli DH5a y aislarlo con Kit Hi-Speed ​​Maxi plásmido (Qiagen, Hilden, Alemania). Concentración de ADN plásmido (plásmido disuelto en buffer TE) debe ser determinado por espectrofotometría a 260 nm y se confirmó por electroforesis en gel.
  3. Prepare el buffer de isoosmolar fosfato de sodio (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 250 mM de sacarosa, pH 7,4).
  4. En el día del experimento de preparar la suspensión de células por tripsinización con 0,25% de tripsina / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemania). Las células se centrifuga durante 5 min a 1000 rpm (180 xg) a 4 ° C (Sigma, Alemania) y resuspender el sedimento celular en tampón fosfato de sodio isoosmolar a una densidad celular de 5 x 10 6 células / ml.

2. Equipo de hardware

  1. Las células son expuestas a campos eléctricos en la punta de la pipeta (Figura 1) con electrodos integrados conectados a un generador prototipo de alta tensión. La punta y la geometría de los electrodos permite la aplicación de campo eléctrico relativamente homogénea y el generador permite el envío de pulsos eléctricos en diferentes direcciones. La punta y el generador se desarrollaron en el Laboratorio de Biocibernética, Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Ljubljana 1.

Figura 1
Figura 1. Vertical y horizontal (a) sección transversal y la fotografía (b) de la punta de la pipeta con electrodos integrados. En la sección transversal de color gris se utiliza para la carcasa de plástico y el negro para los electrodos. La punta de la pipeta con electrodos integrados consta de cuatro electrodos de barra cilíndrica. Los electrodos son de acero inoxidable, su diámetro es de 1,4 mm, electrodos adyacentes son 1 mm, y los electrodos opuestos son 2 mm. Los electrodos se pegan en la punta de plástico en paralelo y su longitud de aplicación es de 30 mm 2.

3. Gene electrotransferencia protocolo

  1. Añadir plásmido pEGFP-N1 a una suspensión celular en la concentración de 10 ug / ml.
  2. Incubar la mezcla durante 2-3 minutos a temperatura ambiente, antes de la aplicación de pulsos eléctricos.
  3. Aspire 100 l de suspensión de células en la punta de la pipeta con electrodos integrados.
  4. Para lograr la mejor eficacia de electrotransferencia gen y mantener la viabilidad celular, los parámetros óptimos de los impulsos eléctricos se debe utilizar. En este experimento, un tren de 8 pulsos rectangulares (cada uno con duración de 1 ms, la amplitud de 225 V a una frecuencia de repetición Hz) se aplica a cada muestra, utilizando alta tensión del generador prototipo. Dos diferentes protocolos de campo eléctrico (Figura 2) se utilizan: en el primer protocolo de todos los pulsos son entregados en la misma dirección, mientras que en los pulsos de segundo protocolo se entregan al cambiar alternativamente la dirección del campo eléctrico y la orientación. El segundo protocolo sólo se puede usar con generador de impulsos adecuados, lo que permite la aplicación de pulsos eléctricos en diferentes direcciones.
  5. Inmediatamente después de la aplicación de pulsos de transferencia de las células de la punta de la pipeta en 6 pocillos y añadir suero fetal bovino (FCS-Sigma, EE.UU.) (25% del volumen de la muestra).
  6. Se incuban las células durante 5 min a 37 ° C para permitir que el resellado de la membrana celular.
  7. Añadir 2 ml de HAM-F12 para cada muestra en 6 pocillo e incubar las células durante 24 horas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO2 la atmósfera en la incubadora.

Figura 2
. Figura 2 protocolos de campo eléctrico: (a) todos los pulsos son entregados en la misma dirección, (b) Los pulsos son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación.

4. De adquisición de imágenes y la determinación de la eficacia del gen electrotransferencia

  1. La eficacia del gen electrotransferencia se determina como el porcentaje de células que expresan GFP 24 horas después de la aplicación de pulsos.
  2. Las células se observan con un microscopio de fluorescencia (en nuestro caso Zeiss 200, Axiovert, ZR Alemania) con luz de excitación a 488 nm generada por un sistema monocromador (policroma IV, Visitron, Alemania) y la emisión se detecta a 507 nm. Las imágenes se graban mediante imágenes de sistema (sistema de imagen MetaMorph, Visitren, Alemania), pero otro software de adquisición similar también se puede utilizar.
  3. Adquirir al menos cinco imágenes (contraste de fases y fluorescencia verde) en el aumento del objetivo de 20x.
  4. Recuento de células en la imagen de contraste de fase y las células que expresan GFP en la imagen de fluorescencia verde. Determinar el porcentaje de eficacia del gen electrotransferencia dividiendo el número de células que expresan GFP con el número de todas las células en cada imagen correspondiente (Figura 3).

5. Los resultados representativos:

Figura 3
Figura 3. El porcentaje de células que expresan GFP cuando todos los pulsos son entregados en la misma dirección y, cuando las leguminosas son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación se presenta. Las células fueron expuestas a un tren de ocho pulsos con amplitud de 225 V, la duración de 1 ms y la frecuencia de repetición de 1 Hz. Los resultados fueron obtenidos por medio de microscopía de fluorescencia. Cada valor en el gráfico representan la media de tres experimentos independientes ± desviación estándar. Al cambiar la dirección del campo eléctrico y la orientación que el porcentaje de células que expresan GFP aumenta.

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Discussion

Gene electrotransferencia es una técnica versátil que la biotecnología permite la transferencia de ADN en las células mediante la aplicación de pulsos cortos, de alta tensión eléctrica 3 y representa una alternativa más segura a los vectores virales, debido a su seguridad, eficacia y facilidad de aplicación. Aunque hoy en día electrotransferencia gen es ampliamente utilizado para transfectar todos los tipos de células y la primera fase I de ensayos clínicos con este método se ha reportado 4, los mecanismos subyacentes todavía no están completamente entendidos. Se sabe, que la aplicación de pulsos eléctricos de fuerza suficiente para el celular causa un aumento en el potencial de membrana, lo que induce a la desestabilización de la membrana 5. La permeabilidad de la membrana celular se incrementa y las moléculas de otro modo nonpermeant entrar en la célula. Muchos parámetros se han descrito 6.9, que influyen en la eficacia del gen electrotransferencia, especialmente la aplicación de parámetros de pulso diferentes fueron estudiadas para permitir una mejor transferencia de genes 10-12. Cambio de la dirección del campo eléctrico y la orientación durante la entrega del pulso aumenta el área de las 13 de la membrana celular por lo tanto aumenta permeabilized área competente para la transferencia de moléculas de ADN. Se ha demostrado, que el porcentaje de células que expresan el gen transferido aumenta cuando la dirección del campo eléctrico y la orientación se cambia durante la aplicación 14. Para este propósito generador de impulsos eléctricos, que permite la aplicación de pulsos eléctricos en diferentes direcciones tiene que utilizar uno. Estamos utilizando como generador de impulsos y punta de la pipeta con electrodos integrados con el fin de demostrar la diferencia en el gen de la eficacia de electrotransferencia, cuando todos los pulsos son entregados en la misma dirección o cuando las leguminosas son entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación. El porcentaje de células que expresan el gen GFP transferidos se evaluó 24 horas después de la aplicación de pulsos, y cuando el aumento de las células transfectadas con éxito cuando los pulsos fueron entregados por el cambio, alternativamente, la dirección del campo eléctrico y la orientación (tasa de supervivencia de 80,8% ± std 12%) en comparación todos los pulsos fueron entregados en la misma dirección (la tasa de supervivencia del 76% ± std 16,2%) se obtuvo.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Investigación de Eslovenia (proyecto J2-9770, IP-0510 centro de la infraestructura y el programa P2-0249). Este video representa el material complementario para la "base de electroporación, tecnologías y tratamientos" taller científico y postgrado, organizado por la Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Ljubljana, en Eslovenia. Los autores agradecen también Dusa Hodzic por la amabilidad de proporcionar el ADN del plásmido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HAM-F12 PAA Laboratories E15-016 culture medium
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
fetal bovine serum PAA Laboratories A15-151
gentamicin Sigma-Aldrich G1397 antibiotic
crystacilin Pliva 625110 antibiotic
pEGFP-N1 Clontech Laboratories 6085-1 plasmid DNA
HiSpeed Plasmid Maxi Kit Qiagen 12662
Na2HPO4 Merck & Co., Inc. F640786 933
NaH2PO4 TKI Hrastnik 0795
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
sucrose Sigma-Aldrich 16104
trypsin/EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
pipette tip Custom Made
electric pulse generator Custom Made
6 well plate Techno Plastic Products 92406
15 ml centrifuge tube Techno Plastic Products 91015
75 cm2 culture flask Techno Plastic Products 90076

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References

  1. Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
  2. Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
  3. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
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