Патч-зажим измерения емкости и Са 2 + Изображений на Одноместный нервных окончаний в сетчатке глаза Ломтики

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы опишем протокол для подготовки агара встраиваемый сетчатки ломтиками, которые подходят для электрофизиологии и Ca 2 + изображения. Этот метод позволяет исследовать ленточного типа синапсов в сетчатке микросхем с использованием прямых патч-зажим записи одного пресинаптических нервных окончаний.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Внешние и внутренние решения

  1. Подготовка нарезки решение (низкое содержание кальция) с 10-кратным маточного раствора и добавить MgCl 2, CaCl 2 и D-глюкозы ежедневно. Окончательный 1x решение состоит из (в мм): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-глюкозы, 0,2 L-аскорбиновой кислоты, 12 HEPES. Установить рН до 7,4 (с NaOH), а также настроить осмолярности до 260 мОсм (с помощью H 2 O и 10-кратным маточного раствора).
  2. Отвешивать 3% низкая температура гелеобразования-агара (агарозы типа VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001) и смешать с нарезки решение. Тепло агара, содержащего решение в микроволновой печи в течение 1-2 минут, или пока он полностью растворяется, и инкубировать агара в водяной бане (30-33 ° C), чтобы предотвратить быстрое затвердевание (гель температуры перехода: 26 ± 2 ° С).
  3. Подготовка записи решения (нормальные кальция) с 10-кратным маточного раствора и добавить MgCl 2, CaCl 2 и D-глюкозы ежедневно. Окончательный 1x последовательный решениеТС (в мм): 100 NaCl, 2,5 KCl, 1 2 MgCl, 25 NaHCO 3, 0,2 L-аскорбиновой кислоты, 2,5 2 CaCl, 12 D-глюкозы. После восходящей решение в 95% O 2 / 5% СО 2 (карбогена) в течение 5-10 минут, установить рН до 7,4 (с NaOH), а также настроить осмолярности до 260 мОсм (с помощью H 2 O и 10-кратным маточного раствора).
  4. Аликвоты (1 мл) внутренних решений пипетки готовятся заранее и хранить в морозильной камере (-20 ° С). Два внутренних решений пипетки, как правило, используются для изоляции биполярные ячейки кальция токов (в мм):
    1. 40 CsCl, 60 Cs-глюконат, 10 тетраэтиламмония (TEA)-Cl, 28 HEPES, 3 Mg-АТФ, 1 Na-ГТФ, и 2 EGTA. Отрегулируйте рН до 7,2 (с CsOH) и осмолярности установлена ​​в 250 мОсм. Такая высокая хлорида внутреннее решение как правило, обеспечивает более низкий последовательное сопротивление записей (лучше напряжение условия зажим) и больших тормозных постсинаптических токов (IPSCs) в ячейке биполярного мембранный потенциал покоя до -60 мВ.
    2. 95 Cs-глюконат, 10 ЧАЙ-Cl, 25 HEPES, 3 Mg-АТФ, 0,5 Na-ГТФ, и 0,5 EGTA. Отрегулируйте рН до 7,2 (с CsOH), и установите осмолярности до 250 мОсм 22. Такой низкий EGTA внутреннее решение обычно приводит к повышению мембранной емкости изменения вызваны деполяризующего шаг импульсов и таким образом позволяет исследования пузырьков истощения бассейном и краткосрочное депрессии.

2. Патч-зажим электродов пипетки

  1. Подготовка толстостенные (1,5 мм наружный диаметр) боросиликатного стекла (1B150F-4; инструменты Всемирного Precision, Sarasota, FL) и тянуть патч пипетки использованием вертикальных съемник (Narishige, PP830, Токио, Япония). Открытого кончика пипетки патч сопротивления в записи решения 7-8 МОм при пипетки заполняют внутреннее решение пипеткой № 1.
  2. Пальто патч-пипетки равномерно, от кончика до уровня вала, который достигает пипетки держатель, с помощью стоматологического воска (Cavex, Уэст-Честер, штат Пенсильвания). Это сведет к минимуму емкость пипетки и электрических помех и позволяетболее точные и низким уровнем шума измерения емкости. Низкая емкость пипетки также помогает электронный С-быстро (быстро емкость) компенсации EPC-9 (или EPC-10) усилитель патч зажим.

3. Подготовка агара встраиваемый сетчатки ломтиками

  1. Выберите золотую рыбку (Carassius рыбки; 8-16 см) и поместите в ведро покрыты в темной комнате в течение 30 мин темновой адаптации. После анестезии, эвтаназии седативные золотая рыбка быстрым обезглавливание и дважды pithing спинного мозга и ствола мозга. Затем удалите глаза с изогнутыми ножницами кончик и изогнутым кончиком пинцета. Эти процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) в Oregon Health & Science University.
  2. Hemisect каждый глаз, сокращая равномерно вокруг передней части глаза ножницами весной (15003-08, Изысканные инструменты науки; инициировать сокращены на прокалывание с ножницами советов), и место наглазники в охлажденном решение ломтик (низкое содержание кальция). Если Несеssary, снимите линзы с помощью пинцета (линзы, как правило, отделяться с передней части глаза). Удалить сетчатки с пигментным эпителием прилагается с помощью пара 45 ° угловой наконечник тонкой щипцы (11251-35, Изысканные инструменты Наука) чистить сетчатку от наглазник, продвигается медленно около 360 °. Север или вырезать зрительного нерва или с тонкой щипцов или весной ножницами. Удалить сетчатки осторожно сочетание тонкой угловой наконечник щипцами и всасывающий применяется с изменение пипетки Пастера или передачи пипетки (большой совет). Используйте пинцет угловой штраф наконечник для удаления оставшейся части пигментного эпителия прилагается к сетчатке. Поверхность очищается и здоровой сетчатки должны появиться темные, гладкие и красного цвета. Для полного удаления всех темных клетках пигментного эпителия темно-адаптация сетчатки в течение 1 часа (8, 1992).
  3. Лечить изолированной сетчатки с ~ 0,03% (вес / объем; ~ 0,36 мг / мл в 1x часть раствора) гиалуронидазы (3; H6254, Sigma) в течение 15-30 мин при комнатнойтемпературы (20-23 ° С) для удаления стекловидного тела. Во время этой инкубации, можно подготовить ледяной срез раствором.
  4. Отрежьте прямоугольный кусок сетчатки (~ 2х2 мм, содержащий полную толщину сетчатки) путем удаления с изогнутыми краями небольшой сегмент лезвия бритвы (Personna, обоюдоострый, очищено 70% этанолом и H 2 O), подключенных к Тело 1 мл пластиковый шприц, и передача части сетчатки в небольшой контейнер, заполненный агар решение (подготовлен в (1.2)). Постарайтесь свести к минимуму количество раствора вокруг сетчатки, как он будет помещен в жидкий агар. Погрузитесь прямо в ледяной срез раствором (подготовлен в (3.3)), чтобы укрепить агар 20, 18, ​​9. Мы используем маленький, ручной работы контейнера. Короче говоря, небольшая, цилиндрической трубы (Fisherbrand, полиэтиленовые флаконы образца 2,5 мл, 03-338-1B) был сокращен с двух сторон и скрепляется парафильмом (ПМ-996, Pechiney пластиковая упаковка) пятна.
  5. Вырезать твердого блока агара в 1x1x1 см куб, содержащий прямоугольный кусок сетчатки.
  6. Передача блока камеры срез и приклейте ее к поверхности среза пластины. Часть камеры предварительно охлажденные в морозильной камере (-20 ° С). Вырезать блок в 200-250 мкм, толстые ломтики использованием Vibratome слайсер (VT1000S или VT 1200S, Leica) в ледяной решение срез. В общей сложности от 5 до 10 ломтиков может быть получен, которые являются жизнеспособными в течение приблизительно 5 до 6 часов.
  7. Трансфер одного из ломтиков для записи камеры. Место сетка из нейлона темы приклеены к П-образные платины кадров 19 в верхней части среза, и заливать непрерывно (скоростью 1-2 мл в минуту) с записью решения пропускают с 95% О 2 / 5% СО 2 (карбогена ).

Поиск и устранение неисправностей:

Если часть сетчатки, встроенные в агар блок отделяется или выходит из агара во время нарезки, можно увеличить ломтик толщиной от 200 мкм до 300 мкм с шагом 20 мкм. Кроме того, старайтесь свести к минимуму количество раствора вокруг сетчатки, как он передается и помещены в жидкий агар, высасывая до дополнительного решения с проката "Kimwipe" бумажный наконечник. Еще один способ избежать этой проблемы, чтобы уменьшить размер сетчатки кусок изначально помещены в агар. Потому что стекловидного тела запрещает агара из полностью присоединения к сетчатке глаза кусок, это может быть необходимо сделать свежий гиалуронидазы или отрегулировать время инкубации (стадия (3.3)).

4. Определение ячейке биполярного синаптических терминала в сетчатке ломтик

  1. Позиция сетчатки срез под прямой микроскоп (например BX51WI, Olympus). Мы рассматриваем сетчатки срез с инфракрасным дифференциального интерференционного контраста (IR-DIC) Оптика через 60x воде погружения цель (NA 0,90, Olympus) и ПЗС-камеры (XC-75, Sony). Выход ПЗС-камеры передается на камеру контроллер (C2400, Хамамацу) для повышения контрастности до визуализации на аналоговый Sony 13 "Blacк и белый монитор. Микроскоп установлен на стадии перевода XY, и запись камеры помещается на фиксированные 14 этап.
  2. Найти либо неповрежденной и axotomized (аксон-срез) биполярные ячейки терминалы, которые могут быть идентифицированы по их размер, форму и положение в срезе (рис. 1). Axotomized и неповрежденного терминалов также можно отличить от рассмотрения их емкостной переходного тока раза распада (одной экспонентой в сравнении с двойным экспоненциальным распадов, соответственно) и Са 2 + токов (рис. 2, 12, 14, 15). Mb терминалы расположены в наиболее проксимальных слой sublamina б (ON-слой, прилегающей к ганглия слоя клеток) во внутреннем слое плексиформные из золотой рыбки сетчатки. Mb терминалы, с их скучным поверхности и плоский вид, можно легко отличить от ганглия и перемещенных amacrine РРОС, которые появляются фазы яркий и сферические. Кроме того, края терминалах Mb покрыта высокойплотность синаптических контактов, и, кажется грубым и нерегулярно, по сравнению с гладкой, чистой поверхности ганглиев и amacrine клетки (рис. 1а-в). Axotomized Mb терминалы появляются круглые и вблизи круговой (рис. 1в), в то время нетронутыми терминалы появляются эллиптические и напряжены, часто с ущипнул концом в сторону внутреннего ядерного слоя сетчатки (рис. 1а, б).
  3. Поврежденные или нездоровые терминалы часто выглядят опухшими и отображать несколько небольших зернистых структур на поверхности. В некоторых случаях можно получить ГОм печать на эти терминалы, но они, вероятно, вскоре после разрыва взлома. Другие признаки нездоровой терминалы включают полые внешний вид, контрастность и / или яркости идентичны окружающих ломтик, а иногда и расположение на поверхности среза. Это позволяет записывать от здоровых терминалов в глубине среза (преимущество: более целых синаптических схемы), а также вблизи поверхности среза (АДВantage: более быстрый доступ к перфузии препаратов во внешнем растворе; легче уплотнения).

5. Электрофизиологические записей и Са 2 + изображений

  1. Использование шприц с 0,2 мкм наконечник (Nalgene), заполните пипетки стеклянные патч с внутренним решением на уровне 1-2 сантиметров от задней части пипетки. После удаления пузырьков воздуха из кончика, безопасной пипеткой в ​​держателе, применять положительным давлением (1,2-1,6 МПа), и переместить его в сторону целевого терминала, используя микроманипулятора (MPC-200, Саттер инструмент). Во время движения кончика вниз через срез, перенести пипеткой в ​​боковом направлении широкие для того, чтобы срез не тянул вместе с наконечником.
  2. Перемещение пипетки вокруг терминала для очистки поверхности мембраны. Нажмите на кончик вниз по краю терминал для создания ямочка (абзац), и отпустите положительным давлением. Если уплотнение ГОм не образуется сразу, нанесите небольшое отрицательное давление. После уплотнения ГОм, переключитесь на-клеточной режим записи по EPC-9 патч зажим усилителя и изменении прижимающего потенциала до -60 или -70 мВ. Применение С-быстро (быстро емкость) коррекция, ждать печать по стабилизации между 5-10 ГОм, а затем разрыв мембраны с острыми, нежные всасывающие применяются в рот установить цельноклеточная записи конфигурации. Если цельноклеточная конфигурация была правильно установлена, последовательное сопротивление будет между 14-30 МОм. Входное сопротивление будет 200-500 МОм для интактных терминалов и 1-3 ГОм для axotomized терминалов 14.
  3. Соблюдайте емкостного тока переходных (рис. 2а и 2в), провести различие между неповрежденной и axotomized терминалы биполярных клеток. Неповрежденными и axotomized терминалы Mb иметь емкость базовой оболочки 9-16 пФ пФ и 3-8, соответственно.
  4. Применить 200 мс напряжение зажим шаге от -70 до 0 мВ до axotomized терминал Мб. Это позволитпрямого измерения больших (~ 200-600 мкА), изолированных внутрь Са 2 + токов активируются открытием потенциал-зависимые L-типа Ca 2 +-каналов (рис. 2б). Параллельно с этим, каждый в состоянии контролировать емкость скачок вызван экзоцитоза синаптических везикул и быстрое, рН-опосредованного ингибирования Са 2 + ток, который следует экзоцитоза 15, и ГАМК-реципрокного торможения обратной связи (рис. 3, 22). Если патчи нетронутыми Mb биполярной ячейке терминал будет результат, как показано на рисунке 2, и 2-й. Никаких заметных Са 2 + токов наблюдаются из-за большой "утечки" тока из-за разрыва спая связи в дендритов биполярных клеток Mb 1.
  5. Изменения мембранного емкость может быть вызвана шаг деполяризации от проведения потенциал -70 мВ до 0 мВ использовании "синус + DC» метод с временным разрешением измерений мембраны емкость 6. Мембранные скачки емкости указывают слияние синаптических пузырьков с плазматической мембраной. 2 кГц синусоидального напряжения зажим команды (30 мВ от пика до пика) был добавлен в холдинг потенциал -70 мВ. Тока записи были проанализированы на двух ортогональных углов фазы EPC-9 патч-зажим усилителя программной эмуляции синхронный усилитель (хека, Ламбрехт, Германия). В нетронутыми терминал рис 2d, высокой частоты (2 кГц) синусоидальной пределах стимул мембраны емкость, которая анализируется для терминала окончаний и аксона, которые См базовой емкости ~ 6,8 пФ. Мембраны клеток организма и дендритов биполярных ячейки, таким образом, отфильтровываются высокой частоты напряжения синусоида зажим 13.
  6. Для Ca 2 +-изображений эксперименты, тщательно перемешать внутреннее решение пипетки патч с Ca 2 +-чувствительного флуоресцентного красителя (например, штат Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 (100-200 мкМ; O-6806, Invitrogen)) и повторить протокол от 50,1 до 5,5. Это позволит объединить один флуоресценции и электрофизиологические записи. Например, можно изображений Са 2 + переходных связанные с шагом 200 мс от -70 до 0 мВ в небольших придатков telodendria из Mb терминала (рис. 3а, б). Мы интегрировали наши прямой микроскоп Olympus с вращающимся диском лазерной конфокальной микроскопии системы (ХСС-X1, Yokogawa). Конфокальной микроскопии использует 488 нм и 561 нм линии, которые модулируются акустооптического перестраиваемого фильтра. Данные получены с помощью Slidebook программное обеспечение (3i; Интеллектуальные инструменты Imaging). Более подробную информацию о кальция методов визуализации использованием золотой рыбки нейронов сетчатки см. 24, 17, 3.

Поиск и устранение неисправностей:

Если часто не может установить цельноклеточная конфигурации, даже после формирования стабильного уплотнения ГОм, это может быть полезным для уменьшения отрицательного давления используется для прокола терминал мнеmbrane. Он также может быть так, что оптимальное давление всасывания для создания целых клеток конфигурация меняется в зависимости от кривизны мембраны (сомы> терминал). Кроме того, можно использовать Зап протокол (Амплитуда: 400 мВ, продолжительность: 100 мкс), чтобы войти в цельноклеточной конфигурации, либо самостоятельно, либо в сочетании с резким импульсом отрицательного давления. Мы нашли Зап протокол, который будет особенно полезно для взлома при использовании пипетки с ванной сопротивлением свыше 12 МОм.

6. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Определение Mb биполярные ячейки терминалов в золотую рыбку сетчатки ломтиками. (Ас) IR-DIC изображений терминалов Mb биполярные клетки. Мы можем определить вероятность axotomized (аксон-вырезать) и нетронутыми терминалы в IR-DIC изображение. Axotomized терминала появляется круглый и круглые, как показано на св то время как нетронутыми терминал, скорее всего, появляются эллиптические, как показано на б. Эта классификация может быть подтверждено переходных измерения емкости (см. рисунок 2) или краситель метод заполнения - е). Красными стрелками указаны места пересечения между аксонов и аксон терминал для нетронутыми терминалов в а и б. Красной пунктирной линией указано контур терминалы Mb биполярных клеток. (DF). Флуоресценция образы Mb биполярной ячейки терминалы с нетронутыми аксона (г), частично сократить аксонов (е), или полностью удалена аксона (е). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) флуоресцентный краситель был наполнен внутренним решением, перед записью. Сразу же после патч-зажим записи, сетчатки срез был переведен на 4% (вес / объем) параформальдегида (P6148, Sigma) в фосфатном буферном растворе (70013, GIBCO) и инкубировали в течение 30минута Фрагменты были установлены на предметные стекла SuperFrost (Fisher Scientific) в водной среде с монтажа против выцветания агентов (Biomeda корпорации). Alexa 555 Мб содержащих терминалы биполярных клеток относятся с 555 нм лазера (красный) с помощью 40x воде погружения цели по конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM 710, объективом Carl Zeiss). Обратите внимание на наличие небольших придатков telodendria торчащих из аксонов терминалов (синие стрелки). Шкала строке показывают 10 мкм (- е). INL: внутренний ядерный слой, IPL: внутренний слой плексиформные, GCL: ганглиозных клеток слоя.

Рисунок 2
Рисунок 2. Электрические свойства axotomized и неповрежденного терминалы Mb биполярные клетки. (А, с) переходного тока ответ активируется напряжения зажим шаг гиперполяризации от проведения потенциал -60 мВ до -70 мВ. Ток короткого ответа на -10 мВ напряжение зажим шагможет привести к: 1) один быстрый экспоненциальный затухания тока с высоким входным сопротивлением при -70 мВ (указывает на axotomized терминала; панель), или 2) дважды экспоненциальный спад с низким входным сопротивлением при -70 мВ (указывает на нетронутым терминала; панели с, см. также 12, 14, 15). (Б, г) Са 2 + токи и прыжки мембраны емкость была вызвана шаг деполяризации от -70 до 0 мВ. С временным разрешением измерений мембраны емкость использования 2-кГц синусоиды стимул накладываются на потенциал покоя проведение -70 мВ 6. След красный усредненное значение емкости точек данных. Обратите внимание, что емкость прыгать на рисунке 2b и 2d одинаковы и равны примерно 200 FF.

Рисунок 3
Рисунок 3. Прямые измерения Са 2 + визуализация сигналов, экзоцитоз, и тормозные обратной связи в Мб биполярные ячейки терминала. (А) переходные рост концентрации Са 2 + в telodendria из Mb терминал был активирован напряжения зажим шаг деполяризации от -70 до 0 мВ до 200 мс (стрелка). Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 (100 мкМ), Ca 2 + индикатор краситель, был включен в патч пипетки. (Б) корреспондент флуоресценции образ Mb telodendria (область интереса указывает красный пунктир). (С) Краткосрочные синаптической депрессии нейромедиатора релиз (экзоцитоз). Са 2 + токов (средняя линия) и мембранные емкости (нижний луч) вызвана пара 20 деполяризаций мс до 0 мВ (верхний луч, 200 мс между импульсов интервал). Стрелка указывает влияние exocytosed протонов на Са 2 +, а также текущие ГАМКергических взаимное подавление обратной связи с соседними клетками amacrine 15, 21. Обратите внимание, что протон-опосредованного ингибирования Са 2 +, а также текущие GABAergic взаимное подавление обратной связи присутствует только в первом деполяризующего ответ, который также имеет емкость прыгать из-за экзоцитоза синаптических везикул.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критический и трудный шаг в нашем протокол передачи части сетчатки в агар решение (протокол 3.4). Необходимо тщательно удалить стекловидного тела и остаточной решение ломтик от сетчатки части и передать ее без искажений или изгиба. Для того, чтобы достичь этого, мы используем небольшой шпатель (21-401-25B, Fisherbrand) с наконечником наклонился, чтобы форма углом 90 °, наряду с угловым наконечником щипцы (11251-35, Изысканные инструменты наук), в положение сетчатки кусок протяжении процесса передачи в ломтик решение. Остаточное решение слайс сетчатки нарезать и шпателя можно удалить осторожно вытирать поверхности с углом сложенные или свернутые Kimwipes (Kimberly-Clark).

Другой распространенный способ приготовления поперечных срезов сетчатки фильтровальную бумагу-протоколу 23. Короче говоря, перевернутый кусок целом сетчатки придается прямоугольник кусок диска Millipore фильтр (ганглиозных клеток лежалиэр против фильтровальную бумагу, слой фоторецепторов вверх) и нарезать 250 мкм ломтики толщиной с ручным вертикальным "пальца" слайсер (например Narishige ST-20). Мы считаем, что преимущества фильтров бумажных протоколов включают здоровые фоторецепторы и увеличения отношения axotomized с интактными терминалы Мб. Таким образом, мы использовать этот фильтр, метод бумаги, чтобы вызвать световых вызвали ответы от одного терминалы Mb встроенной в сетчатке ломтиками.

Преимущества нашего агар-протоколу через бумажный фильтр-протоколу в том, что 1) часть сетчатки производится плоский, даже и относительно неповрежденными с четким разделением между слоев сетчатки, которая позволяет исправлений в любой внутренний ядерный слой или слой сетчатки плексиформные ячейке, желательно, и 2) иммуногистохимии следующие электрофизиологические запись выполняется легче из-за целости и плоской геометрии среза и факторы, упомянутые в пункте (1) выше. Протокол для записи свет ответх нейронов сетчатки в агар препарата на основе ранее опубликованной в Юпитер 2. Горизонтального среза сетчатки подготовки, которые использовали сочетание агар и приемы фильтрации документ был также ранее опубликованные в Юпитер 5. Мы рекомендуем смотреть эти видео в сочетании с нашими собственными сравнить различные методы.

Прямой доступ к ленточного типа пресинаптических окончаний в сетчатке позвоночных ломтиками позволяет исследовать синаптической передачи в ленточного типа активных зон. Это также позволяет нам непосредственно изучать физиологию в синаптической сетчатки микросхем. Эта технология будет особенно полезно для парных записи пред-и пост-синаптические сигналы, с постсинаптической партнеров, включая тормозные amacrine клеток и пики ганглиозные клетки 1, 16, 10. Парные записи на ленту типа синапсов между крысой кохлеарной внутренние волосковые клетки и дендриты афферентных возможны и были описаны 7. Кальций воображениенг терминалы Mb биполярные ячейки была выполнена в резко диссоциированных клетки 8 и в сетчатке глаза ломтиками 17, а также в золотую рыбку amacrine клетки 3. Недавние исследования показали значительные улучшения для в естественных условиях и в пробирке optogenetic подходов в трансгенных сетчатки данио 4. Будущие направления, скорее всего, вовлечения этих трансгенных методов, а также электрофизиологические методы, которые позволят нам преодолеть разрыв между записями в пробирке срез и в естественных изображений, что приводит в конечном счете, поведенческих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас нет конкурирующих интересов раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Фред Rieke за его любезное объяснение агар встраиваемый сетчатки подготовки срез, когда мы начали использовать протокол в нашей лаборатории. Мы также благодарим Лори Vaskalis для иллюстрации схематический обзор и д-ра. Veeramuthu Балакришнан и Soyoun Чо за полезные замечания по тексту и видео. Эта работа была поддержана NEI-NIH RO1 гранта, а также был частично поддержан Корейский исследовательский грант Фонда финансируемый правительством Кореи [KRF-2008-357-E00032].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma-Aldrich A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments, Inc. 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige International PP830
Dental wax Cavex
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35
Razor blade Personna Medical Care Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisher Scientific 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H6254
Vibratome slicer Leica Microsystems VT1000S or VT1200S
Upright microscope Olympus Corporation BX51WI
60x water-immersion objective Olympus Corporation LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony Corporation XC-75
Camera controller Hamamatsu Corp. C2400
Monitor Sony Corporation 13” black and white monitor
Syringe filter Nalge Nunc international 0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument Co. MPC-200
Lock-in amplifier HEKA Instruments EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i) Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffer solution GIBCO, by Life Technologies 70013
Superfrost slide Fisher Scientific Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisher Scientific 21-401-25B
Manuel vertical slicer Narishige International ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  3. Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
  4. WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . Active ageing: a policy framework. (2002).
  5. Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).
  6. Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).
  7. Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
  8. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
  9. Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. (2011).
  10. Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
  11. Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).
  12. Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
  13. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
  14. Deininger, S. -O. Imaging Mass Spectrometry. Setou, M. Springer. Japan. 199-208 (2010).
  15. Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
  16. Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
  17. Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. Mass Spectrometry Binning Software GAB. (2012).
  18. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  19. Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
  20. Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
  21. Falth, M. a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics