パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +イメージング

Neuroscience

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Summary

ここでは、電気生理学とCa2 +イメージングに適した寒天包埋網膜スライスを調製するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは1つが、単一のシナプス前神経末端の直接パッチクランプ記録を用いて網膜マイクロ回路のリボン型シナプスを研究することができます。

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Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

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Abstract

視覚刺激は、脊椎動物の網膜の専門ニューロンによる光の強度と周波数の変化の広いダイナミックレンジにわたって検出され、搬送される。網膜神経細胞、光受容体と双極細胞の2つのクラスは、長期間にわたって持続的かつ高スループットの神経伝達物質の放出を可能にするリボン型アクティブゾーンを、使用することによってこれを実現する。光刺激に対する脱分極との混合ロッドと錐体視の入力を受け取る金魚の網膜のON型の混合双極細胞(Mb)の端末は、サイズが大きいため、両方のリボン型シナプス(〜10-12の研究に適していますμmの直径)とアマクリン細胞の樹状突起との数多くの側面と相互シナプスの接続に。パッチクランプ法と金魚網膜スライスにおけるMbの双極細胞の端末へのダイレクトアクセスは、シナプス前のCa 2 +電流、膜容量の変化、およびGABAによって仲介相互シナプスフィードバック阻害の測定を可能にする<サブ> AおよびGABA C受容体は、端末上で表明した。エキソサイトーシスのシナプス前膜の容量測定は1つが興奮性神経伝達物質の放出14,15の短期可塑性を調べることができます。さらに、アマクリン細胞から抑制性神経伝達物質放出の短期的および長期的な可塑性はまた、Mbの端子21に到達する相互フィードバック阻害の記録によって調査することができます。時間の短い期間(例えば〜10秒)以上、アマクリン細胞からのGABA作動性相互フィードバック阻害は、GABA小胞プールの枯渇11を介してペアパルスうつ病を受ける。網膜の内網状層における網膜マイクロ回路のシナプスダイナミクスは、このように直接研究することができる。

脳スライスの技術は40年以上前に導入したが、神経細胞の電気的特性の調査のためにまだ非常に便利です、両方とも単一の細胞体、単一の樹状突起や軸索、およびmにしたicrocircuitシナプスのレベル19。スライスチャンバーに直接接着するには小さすぎる組織は、多くの場合、最初寒天に埋め込 ​​む(またはろ紙上に配置)し、20、23、18、9スライスされています。このビデオでは、我々は金魚の網膜を使用してプリ埋め込み寒天法を採用しています。金魚の網膜の私達のスライスに巨大な双極細胞の一部の端子は、スライス手順の間に(軸索カット)axotomizedされています。 axotomized端子から録音が相馬樹のコンパートメントからの信号を除外するため、これは、私たちは、単一のシナプス前神経終末の入力を分離することができます。別の方法として、また、スライス作業中に切断されていない軸索に接続された端末から記録することで、無傷のMbの双極細胞から記録することができます。全体的に、この実験的なプロトコルの使用は、網膜シナプス生理学、マイクロ回路機能解析、およびリボンシナプスにおけるシナプス伝達の研究に役立ちます。

Protocol

1。外部と内部のソリューション

  1. 10 ×ストック溶液からスライスソリューション(低カルシウム)を準備し、毎日のMgCl 2、CaCl 2の 、そしてD -グルコースを加える。最後の1Xソリューションは、(mm)で構成されています:119塩化ナトリウム、2.5のKCl、3.2 MgCl 2を 、0.25のCaCl 2、12、D -グルコース、0.2 L -アスコルビン酸、12 HEPES。 7.4(NaOHで)にpHを設定し、260 mOsm(H 2 O及び10倍のストック溶液を使用)に浸透圧を調整する。
  2. 3パーセントの低ゲル化温度寒天(アガロースタイプVII -、A0701、シグマ、リーケ、2001)秤量し、ソリューションをスライスして混ぜる。 ± 2 26 °:1〜2分間電子レンジで寒天を含む溶液を加熱し、またはそれが完全に溶解するまで、そして急速凝固(ゲル転移温度を防止するために水浴(30-33℃)で寒天をインキュベートC)。
  3. 10 ×ストック溶液から記録液(通常のカルシウムを)準備とMgCl 2、CaCl 2の 、そしてD -グルコースを毎日追加。最後の1Xソリューションの一貫のTS(mMで):100のNaCl、2.5 KClを、1のMgCl 2、25のNaHCO 3、0.2 L -アスコルビン酸、2.5のCaCl 2、12、D -グルコース。 95%のソリューションをバブリングした後、5〜10分間O 2 / 5%CO 2(carbogenは)、7.4(NaOHで)にpHを設定し、260 mOsm(H 2 O及び10倍のストック溶液を使用)に浸透圧を調整する。
  4. 内部ピペット溶液のアリコート(1ミリリットルずつ)は、事前に準備し、冷凍庫(-20℃)に保存されます。つの内部ピペット溶液は、通常、双極細胞のカルシウム電流を(mMで)分離するために使用されます。
    1. 40塩化セシウム、60のCs -グルコン酸、10テトラエチルアンモニウム(TEA)- Clを、28 HEPES、3のMg - ATP、1のNa - GTP、および2 EGTA。 7.2(CsOH付き)にpHを調整し、浸透圧は250 mOsmに設定する。この高塩化物内部の溶液は、典型的には-60 mVの双極細胞の静止膜電位より低い直列抵抗の録音(より良い電圧クランプ状態)と大きな抑制性シナプス後電流(性IPSC)を提供しています。
    2. 95のCs -グルコン酸、10 TEA - Clを、25 HEPES、3のMg - ATP、0.5のNa - GTP、および0.5 EGTA。 7.2(CsOH付き)にpHを調整し、250 mOsm 22に浸透圧を設定します。この低いEGTA内部溶液は、典型的に高い膜の静電容量の変化につながるステップパルスを脱分極により誘発されるため、小胞プールの枯渇や短期的なうつ病の研究をすることができます。

2。パッチクランプピペット電極

  1. 厚肉の準備(1.5ミリメートル外径)ホウケイ酸ガラス(1B150F - 4、世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州)と垂直プラー(ナリシゲ、PP830、東京、日本)を使用して、パッチピペットを引き出します。ピペットは、内部ピペット溶液#1で満たされているときに録音ソリューションで、オープン先端のパッチピペットの抵抗7-8MΩです。
  2. 歯科用ワックス(Cavex、ウエストチェスター、ペンシルバニア州)と先端からピペットホルダーに達するシャフトのレベルに均等に塗りパッチピペットを、、。これは、ピペットの容量と電気的ノイズを最小化し、有効になりますより正確で低ノイズの静電容量測定。低ピペットの容量もEPC - 9(またはEPC - 10)パッチクランプアンプの電子的なC - FAST(高速キャパシタンス)の補償をすることができます。

3。寒天包埋網膜スライスの準備

  1. 暗順応の30分間暗い部屋で覆われたバケツでと場所、金魚(8〜16センチメートルキンギョ選択します。麻酔後、迅速に断頭し、脊髄と脳幹のダブルピッシングによる鎮静金魚を安楽死させる。その後湾曲した先端のはさみや先の曲がったピンセットで目を削除します。これらの手順は、オレゴン健康科学大学の動物実験使用委員会(IACUC)によって承認されている。
  2. 春のはさみで、目の前の周りに均等にカットすることでそれぞれの目を二等分する(15003〜08、ファイン科学ツール、はさみのヒントを穿刺することによりカットの開始)、およびチルドスライス液(低カルシウム)にアイカップを置きます。 NECE場合ssary、ピンセット(レンズは通常目の前にデタッチされる)でレンズを取り外します。完全な360 °の周りにゆっくりと進行し、離れてアイカップから網膜剥離に45 °傾斜先端微細な鉗子のペア(11251〜35、ファイン科学のツール)を使用して接続されている色素上皮と網膜を削除します。微細な鉗子や春のはさみのどちらかで視神経を切断するまたは切断。変更されたパスツールピペットまたは転送ピペット(大ヒント)から適用される角度の微細な先端の鉗子と吸引の組み合わせで軽く網膜を削除します。網膜に接続されている色素上皮の残りの部分を削除するには、斜め微細な先端の鉗子を使用してください。清浄で健康的な網膜の表面には、濃い滑らかで赤く表示されます。すべての暗い色素上皮細胞の完全な除去のために1時間(8、1992)のために網膜を暗適応させる。
  3. 室温で15〜30分間、ヒアルロニダーゼ(H6254、シグマ3);〜0.03%(1 ×スライスの溶液中で〜0.36 mg / mLの重量/体積)で孤立した網膜を扱う硝子体液を除去する温度(20〜23 ° C)。このインキュベーションの間に、氷冷スライスのソリューションを準備することができます。
  4. に接続されているカミソリの刃の小さいセグメントを曲線エッジを削除することにより、網膜の長方形の部分を(〜2 × 2ミリメートル、網膜の全層を含む)カット(Personna、両刃、70%エタノールとH 2 Oで洗浄) 1 mLのプラスチック製の注射器の本体、および寒天溶液((1.2)で調製した)で満たされた小さなコンテナに網膜の一部を譲渡する。それは、液体培地に置かれるように網膜の周囲液の量を最小限に抑えるようにしてください。寒天20、18、9を固めるために氷冷スライスソリューション((3.3)で調製)に直接浸し。私たちは、小さな、手作りのコンテナを使用してください。簡単に言えば、小さな、円筒形のチューブ(Fisherbrand、ポリエチレンのサンプルバイアル2.5ミリリットル、03から338 - 1B)は、両端で切断し、パラフィルム(PM - 996、Pechineyプラスチック包装)のパッチで密封した。
  5. 1に固体寒天ブロックをカット網膜の長方形のピースを含むx1x1 cmの立方体。
  6. スライス板の表面にそれをスライスチャンバーへのブロックを転送し、接着剤。スライスのチャンバーは、冷凍庫(-20℃)で事前に冷却される。氷冷スライスの溶液中でビブラトームスライサー(VT1000SまたはVT 1200S、ライカ)を使用して200から250μmの厚さのスライスにブロックをカット。 5〜10スライスの合計は約5〜6時間実行可能である、得ることができます。
  7. 録音室にスライスの1つを転送する。スライスの上にU字型のプラチナのフレーム19に接着されたナイロンスレッドのグリッドを配置し、そして95%O 2 / 5%CO 2(carbogenでバブリング録音ソリューションで(毎分1 - 2mLとなる率)を連続的灌流)。

トラブルシューティング:

寒天ブロックに埋め込まれた網膜片をスライス中にデタッチまたは寒天から復帰されている場合は、一つは、20μm刻みで最大300μmの200μmからスライス厚を増やすことができます。また、それがロール"キムワイプ"紙の先端で余分なソリューションを吸引して液体培地に移し、配置されるように網膜の周囲液の量を最小限に抑えるようにしてください。この問題を回避する別の方法は、最初に寒天に配置された網膜の部分のサイズを小さくすることです。硝子体は完全に網膜の一部に付着する寒天を禁止しているので、それは新鮮なヒアルロニダーゼを作るか、またはインキュベーション時間を(ステップ(3.3))を調整する必要があるかもしれません。

4。網膜スライスにおける双極細胞シナプス終末の同定

  1. 正立顕微鏡(例えばBX51WI、オリンパス)で網膜スライスを配置します。我々は60倍の水浸対物レンズ(NA 0.90、オリンパス)とCCDカメラ(XC - 75、ソニー)を介して赤外微分干渉コントラスト(IR - DIC)光学系と網膜スライスを表示します。 CCDカメラの出力はアナログソニー13"BLAC上で可視化する前にコントラスト強調のためにカメラコントローラ(C2400、浜松ホトニクス)に送信されます。kと白のモニター。顕微鏡はXY移動ステージにマウントされている、と記録チャンバーは固定ステージ14上に配置されます。
  2. その大きさ、形状、およびスライス( 図1)の位置によって識別することができるいずれかの無傷とaxotomized(軸索カット)双極細胞の端子を、見つける。 Axotomizedと無傷の端末はまた、容量性過渡電流減衰時間(それぞれ、指数関数、単一の対二重指数減衰)とCa 2 +電流(、12、14、15 図2)の検査で区別することができます。金魚の網膜の内網状層における、MB端子はsublamina bの最も近位層(神経節細胞層に隣接するON型層)に位置しています。 MB端末は、彼らの鈍い面とフラットな外観で、簡単に神経節と相明るい球状現れる避難アマクリンSOMAの、区別することができます。また、MB端子のエッジはハイで覆われているシナプス接触の密度、および神経節およびアマクリン細胞( 図1A - C)の滑らかな、クリーンな表面と比較すると粗いと不規則に表示されます。無傷の端末はしばしば網膜の内顆粒層( 図1a、b)の側に向け挟ま終わりと、楕円と伸びて表示される一方Axotomized Mbの端末は、円形と近い円形( 図1c)が表示されます。
  3. 破損または不健康な端末はしばしば腫れを見て、表面上のいくつかの小さな粒状の構造が表示されます。それは、これらの端末でGΩシールを得ることは可能ですが、しかし彼らはブレークでの後まもなく破裂する可能性があります。不健康な端末の他の徴候は中空外観、コントラストおよび/または周囲のスライス、そして時にはスライスの表面における位置と同一の明るさが含まれています。ともスライス(ADVの表面付近:スライスの深い健康な端末から(もっと無傷のシナプス回路の利点)の両方を記録することが可能ですantage:外液の灌流薬剤にすばやくアクセスできます。封印しやすい)。

5。電気生理学的記録とCa 2 +動態のイメージング

  1. 0.2μmのフィルターチップ(Nalgene)とシリンジを用いて、ピペットの背面からレベル1-2センチメートルに内部溶液とガラスのパッチピペットを埋める。先端から気泡を除去した後、ホルダー内にピペットを確保、陽圧を(1.2〜1.6 psi)を適用し、マイクロマニピュレーター(MPC - 200、サッターインストゥルメント)を使用してターゲットの端末に向かって移動する。スライス通って下方の先端を移動させながら、スライスが先端と一緒にアップされていないことを保証するために横方向の掃引方向にピペットを移動します。
  2. 膜の表面をきれいにする、端末の周囲ピペットの先端を移動します。ディンプルを(インデント)を作成し、正圧を解放するために、端末の端に下向きの先端を押してください。 GΩのシールがすぐに形成していない場合、わずかな負圧を適用します。 GΩシールした後、EPC - 9パッチクランプアンプの上にセルの録音モードに切り替え、-60または-70 mVに保持電位を変更する。 C - FAST(高速キャパシタンス)補正を適用し、細胞全体の記録の設定を確立するために口の中で適用されるシャープ、穏やかな吸引を有する膜を50〜10GΩの間で安定させるためにシールを待ってから、破裂。細胞全体の構成が正しく確立されている場合、直列抵抗はMΩ14から30の間になります。入力抵抗はそのまま端子とaxotomized端子14 1-3GΩ用MΩ200から500になります。
  3. 無傷とaxotomized双極細胞の端末を区別するために、( 図2Aおよび2C)容量性過渡電流を守ってください。無傷とaxotomized Mbの端子はそれぞれ、9-16 pFの3〜8 pFのベースラインの膜の静電容量を持っている。
  4. -70〜axotomized Mbの端子には0 mV〜200 msの期間に電圧クランプステップを適用します。これができるようになります大型の直接測定(〜200から600 PA)、内側のCa 2の電位依存性L型Ca 2 +チャネル( 図2b)の開設により活性化+電流を単離した。並行して、一つはシナプス小胞のエキソサイトーシスによって生じる静電容量のジャンプ、およびCa 2の急速な、pHを介した抑制+現在のエキソサイトーシス15次、およびGABA作動性相互フィードバック阻害(; 22 図3c)を監視することができます。 oneパッチをそのままMbの双極細胞の端末の場合、結果は、 図2cおよび2dに表示されます。に認識できるのCa 2 +電流が原因Mbの双極細胞1の樹状突起におけるギャップジャンクション結合による大規模な"リーク"電流の観察されない。
  5. 膜の静電容量の変化は、時間分解膜の容量測定6の"サイン+ DC"メソッドを使って70mVの保持電位から0 mVへのステップの脱分極によって誘発することができます。膜容量のジャンプは、形質膜とシナプス小胞の融合を示している。 2 kHzの正弦波電圧クランプコマンド(30 mVのピークツーピーク)は、70mVの保持電位に追加されました。記録電流はロックインアンプ(HEKA、ブレヒト、ドイツ)のEPC - 9パッチクランプアンプのソフトウェアエミュレーションによって2つの直交位相角度で分析した。 図2d、高い周波数(2 kHz)の正弦波刺激の範囲のままターミナルでベースラインの容量Cmを持っている端末の語尾や軸索に分析される膜の静電容量〜6.8 pFです。細胞体と双極細胞の樹状突起の膜は、このように高周波電圧クランプ正弦波13で除外されます。
  6. のCa 2 +イメージング実験のために、徹底的にのCa 2 +感受性蛍光色素(例えば、オレゴングリーン488 BAPTA - 1(100〜200μM、O - 6806、Invitrogen社))で内部パッチピペット溶液を混合し、プロトコルをから繰り返す50.1から5.5。これは1つが蛍光イメージングと電気生理学的記録を組み合わせることができるようになります。例えば、それは画像のCa 2 +過渡-70〜Mbの端末( 図3A、B)の小さなtelodendria付属器には0 mV〜200ミリ秒のステップに関連付けられたをすることが可能です。我々は、回転するディスクのレーザー共焦点顕微鏡システム(CSU - X1、横河)との直立オリンパスの顕微鏡を統合している。共焦点顕微鏡は、488nmおよび音響光学波長可変フィルタによって変調さ561 nmのレーザーラインを使用しています。 (;インテリジェントイメージング装置3iの)データがSlidebookソフトウェアを使用して取得されます。金魚網膜神経細胞を用いたカルシウムイメージング技術の詳細については、24、17、3を参照してください。

トラブルシューティング:

いずれかの頻繁に細胞全体の構成を確立するために失敗した場合は、さらに安定したGΩシールを形成した後に、それは穿刺端末を私にするために使用される負圧を低減すると便利かもしれませんmbrane。また、全細胞の構成の確立のための最適な吸引圧は膜の曲率(相馬>ターミナル)の関数として変化する場合があります。 、単独または組み合わせて負圧の急激なパルスで細胞全体の構成を入力するには、ZAPプロトコル(100μsの間::400 mVの、時間振幅)を使用することも可能です。我々は、MΩ12を超えるバス​​の抵抗とピペットチップを使用するときにブレークインする場合に特に有用であることがZAPプロトコルを発見した。

6。代表的な結果

図1
図1。金魚網膜のスライスのMbの双極細胞の端末の識別。 Mbの双極細胞の端末の(AC)IR - DIC画像。我々は、IR - DIC画像の可能性axotomized(軸索カット)と無傷の端末を識別することができます。 Cに示すようにaxotomizedターミナルは、円形と円形が表示されますそのままターミナルには、a bに示すように、楕円に表示される可能性が高くなりますしながら。この分類は、過渡容量法(図2参照)により、または染料充填方法( - F D)によって確認することができます。赤い矢印はa bでそのまま端末用の軸索と軸索の端末との間の交点の位置を示した。赤い点線は、Mbの双極細胞の端末の輪郭を示した。 (DF)。無傷の軸索(d)は、部分的にカット軸索(E)、または完全に削除された軸索(F)とMbの双極細胞の端末の蛍光画像。アレクサ555(A20501MP、Invitrogen)を蛍光色素は、記録前の内部の溶液を充填した。すぐにパッチクランプ記録後、網膜スライスをリン酸緩衝液中4%(wt / vol)のパラホルムアルデヒド(P6148、シグマ)(70013、GIBCO)に移し、30秒間インキュベートした分。スライスは、退色防​​止剤(Biomedaコープ)と、水性封入剤でSuperfrostスライド(フィッシャーサイエンティフィック)にマウントされました。アレクサ555を含むMbの双極細胞の端子は、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM 710、カールツァイス)の40倍の水浸対物レンズを用いて555nmのレーザー線(赤)で表示された。軸索末端(青矢印)から突き出ている小さなtelodendria付属の存在に注意してください。スケールバーは10μmを( - fのa)に示す。 INL:内顆粒層、IPL:内網状層、GCL:神経節細胞層。

図2
図2。axotomizedと無傷のMbの双極細胞の端子の電気的特性。 -70 mVの〜-60 mVの保持電位からの電圧クランプステップの過分極によって活性化(、c)の過渡電流応答。 -10 mVの電圧クランプのステップへの短絡電流応答が発生することがある:1)単一の高速指数現在axotomizedの端末を示す-70 mVの(での高入力抵抗と減衰、パネル)、または2)を-70 mVに(の指標で、低い入力抵抗との二重指数関数的減衰そのままターミナル、パネルCは 、)12、14、15も参照してください。 (B、D) のCa 2 +電流と膜容量のジャンプは-70から0 mVのステップの脱分極によって誘発された。時間分解膜の容量測定は-70 mVの6の安静保持電位に重畳2 kHzの正弦波刺激を使用してください。赤のトレースは、静電容量のデータポイントの平均値です。図2bと2dの静電容量のジャンプは、両方とも約200 FFに等しいことに注意してください。

図3
図3のCa 2の直接測定+イメージング信号、エキソサイトーシス、およびMの抑制フィードバックB双極細胞端子。 (A)のCa 2の一時的上昇は、MB端子のtelodendriaの+濃度は、200ミリ秒(矢印)を-70から0 mVに電圧クランプステップの脱分極によって活性化させた。オレゴングリーン488 BAPTA - 1(100μM)は、Ca 2 +指示薬色素は、パッチピペットに含まれていた。 Mbのtelodendria(赤い点線で示された関心領域)の(b)に対応する蛍光像。神経伝達物質放出(エキソサイトーシス)の(c)の短期シナプス抑制。は0 mV(; 200ミリ秒パルス間の間隔上のトレース)から20 msの脱分極のペアによって喚起されるのCa 2 +電流(真ん中のトレース)と膜キャパシタンス(下のトレース)。矢印は、Ca 2 exocytosedプロトンの効果+近隣のアマクリン細胞15、21からの電流ともGABA作動性相互フィードバック阻害を示しています。 Ca 2 +のプロトンを介する抑制に注意+現在ともGABAergic相互フィードバック阻害だけでも静電容量は、シナプス小胞のエキソサイトーシスのためにジャンプした最初の脱分極応答、中に存在する。

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Discussion

我々のプロトコルで重要かつ困難なステップは、寒天溶液(プロトコル3.4)への網膜の一部の移転です。それは慎重に網膜の部分から硝子体液と残留スライスの溶液を除去し、歪みや曲がりなく、それを転送する必要があります。これを達成するために、我々は先端が網膜の位置を斜めに先端の鉗子(11251〜35、ファイン科学のツール)、と一緒に、90 °の角度を形成するために曲がって小さなヘラを(21 - 401 - 25B、Fisherbrand)使用スライスのソリューションで転送処理を通して作品。網膜のスライスとヘラの残留スライスのソリューションは、折り畳まれたまたは巻きキムワイプ(キンバリークラーク)の角で表面の軽くたたくように注意して除去することができます。

横網膜スライスを準備する別の一般的な方法は、フィルター紙ベースのプロトコル23です。簡単に言えば、全体の網膜の反転部分は、ミリポアフィルターのディスク(神経節細胞は、レイアウトの長方形の部分に接続されていますERろ紙、上向きに光受容体層)に対してと手動垂直"親指"スライサー(例えばナリシゲST - 20)で250μmの厚切りにする。我々は、フィルター、紙ベースのプロトコルの利点は、健康的な光受容体と無傷のMbの端子にaxotomizedの増加率を含めることがわかります。そこで我々は、網膜のスライスに埋め込まれた単一のMbの端末からの光誘発反応を誘発するために、このろ紙のメソッドを使用します。

フィルター紙ベースのプロトコルを介して私たちの寒天ベースのプロトコルの利点は、1)生成される網膜のスライスでも、平坦であること、およびすべての内部核層または網膜網状層でのパッチ適用を可能にする網膜層、間の明確な分離と相対的に無傷の望まれている、2)免疫組織化学、以下の電気生理学的記録が原因でスライスの無傷とフラット形状及び上記(1)号に掲げる要因をより容易に実行されるセル。光反応を記録するためのプロトコル寒天ベースの準備の網膜神経細胞のSは、以前はJoveの2に掲載されました。寒天やろ紙の技術を組み合わせて使用される水平網膜スライス標本は、以前にJoveの5に掲載されました。我々は、異なる技術を比較するために私たち自身との組み合わせでこれらのビデオを見てお勧めします。

脊椎動物の網膜スライスにおけるリボン型シナプス前終末へのダイレクトアクセスは、私たちは、リボン型のアクティブゾーンでシナプス伝達を調査することができます。それはまた私達が直接網膜マイクロ回路のシナプス生理学を勉強することができます。この手法は、抑制性アマクリン細胞を含むと神経節細胞1、16、10をスパイクシナプス後パートナーと、プリおよびポストシナプス信号のペア録音のために特に有用となります。ラット蝸牛内有毛細胞と求心性樹状突起間のリボン型シナプスにおけるペアレコーディングが可能であり、7で記載されている。カルシウム想像力Mbの双極細胞の端末のNGは8と網膜のスライス17、および3金魚アマクリン細胞における急性解離細胞で行われている。最近の研究では、 インビボおよびトランスジェニックゼブラフィッシュの網膜4体外 optogeneticのアプローチための大きな改善を示している。今後の方向性は、おそらく私たちは行動研究に最終的につながる、in vitroでのスライスの録音および in vivoイメージング間のギャップを埋めることを可能にする電気生理学的手法、と一緒に、これらのトランスジェニック技術を伴うでしょう。

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Disclosures

我々は、開示することは競合する利害関係はありません。

Acknowledgments

私たちがラボでプロトコルを使用して起動するときに我々は、寒天包埋網膜スライス標本の彼の種類の説明については、博士フレッドリーケに感謝。我々はまた、回路図の概要と博士の図については、ローリVaskalisに感謝。テキストとビデオでの有益なコ​​メントVeeramuthuバラクリシュナンとSoyounチョ。この作品は、NEI - NIH RO1の助成金によって支えられて、そしてまた、部分的に韓国政府の資金による韓国学術振興財団の助成金によって支えられている[KRF - 2008 - 357 - E00032]。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma-Aldrich A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments, Inc. 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige International PP830
Dental wax Cavex
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35
Razor blade Personna Medical Care Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisher Scientific 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H6254
Vibratome slicer Leica Microsystems VT1000S or VT1200S
Upright microscope Olympus Corporation BX51WI
60x water-immersion objective Olympus Corporation LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony Corporation XC-75
Camera controller Hamamatsu Corp. C2400
Monitor Sony Corporation 13” black and white monitor
Syringe filter Nalge Nunc international 0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument Co. MPC-200
Lock-in amplifier HEKA Instruments EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i) Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Phosphate buffer solution GIBCO, by Life Technologies 70013
Superfrost slide Fisher Scientific Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisher Scientific 21-401-25B
Manuel vertical slicer Narishige International ST-20
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

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References

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