을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13 C - 라벨링

Biology

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Summary

13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

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You, L., Page, L., Feng, X., Berla, B., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids. J. Vis. Exp. (59), e3583, doi:10.3791/3583 (2012).

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Abstract

미생물이 생화학 및 기능 유전체학 방법을 사용하여 조사 수있는 복잡한 신진 대사 경로를했습니다. 셀 중앙 신진 대사를 검토하고 새로운 효소를 발견하는 한 가지 중요한 기술은 13 C를 이용한 대사 분석 1입니다. 이 기술은 미생물이 13 C 라벨 기판과 먹이 아르 의하여 isotopic 라벨에 따라 달라집니다. 생화학 네트워크의 metabolites 사이의 원자 전이 경로를 추적함으로써, 우리는 기능 경로를 결정하고 새로운 효소를 발견하실 수 있습니다.

transcriptomics 및 proteomics에 대한 보완 방법, 대사 경로의 isotopomer를 이용한 분석을위한 접근 방식은 세 가지 주요 단계 2를 포함하는으로. 첫째, 13 C 표시된 기판과 세포를 성장. 이 단계에서 매체와 라벨 기판의 선택의 구성은 두 가지 핵심 요소가됩니다. 영양 보충제가 아닌 레이블 탄소의 측정 잡음을 방지하려면, 단독 탄소 소스와 최소한의 매체가 필요합니다. 또한, 레이블 기판의 선택은 그것이 분석되는 경로를 명료하게하다하는 방법을 효과적으로 기반으로합니다. 소설 효소는 종종 일반적인 다른 반응 입체 또는 중간 제품을 포함하기 때문에 단독으로 표시된 탄소 기판이 소설 경로 3, 4의 검출에 대한 균일하게 표시된 것보다 소설 경로의 탐지에 대한 더 정보를 제공하고 있습니다. 둘째, 우리는 GC를 사용하여 아미노산 라벨 패턴을 분석 - MS. 아미노산은 단백질이 풍부하고 따라서 바이오 매스 가수 분해로부터 얻을 수 있습니다. 아미노산은 GC 분리하기 전에 N - (tert - butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide (TBDMS)에 의해 derivati​​zed 수 있습니다. TBDMS derivati​​zed 아미노산은 MS와 조각의 다양한 배열의 결과에 의해 조각난 수 있습니다. 조각과 조각 화되지 않은 아미노산의 요금 (M / Z) 비율 질량에 따라, 우리가 중앙 metabolites의 가능한 표시 패턴을 추론할 수아미노산의 엽 성의 전구 물질. 셋째, 우리는이 경로가 활성 2아르 여부를 확인 isotopomer 데이터를 기반으로 제안된 경로의 13C 탄소 전환을 추적합니다. 아미노산의 측정은 중앙 신진 대사에 8 중요한 전구체 metabolites에 대한 isotopic 라벨 정보를 제공합니다. 이러한 대사 주요 노드는 관련 중앙 통로의 기능을 반영하실 수 있습니다.

proteinogenic 아미노산을 통해 13 C를 이용한 대사 분석 널리 저조한 특징 미생물 대사 1 특성화 기능에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 새로운 효소 기능을 발견하기위한 표시된 탄소 기판의 사용을 설명하기 위해 모델 변형으로 Cyanothece 51142을 사용합니다.

Protocol

1. 세포 배양 (그림 1)

  1. 미량 원소, 소금, 비타민 및 경로 조사에 가장 구체적으로 표시 탄소 기판과 최소한의 매체 세포를 성장. 세포 배양에 대한 흔들림 flasks 또는 bioreactors 중 하나를 사용하십시오. 이러한 효모 추출물로 유기 영양분은 아미노산 라벨의 측정을 방해할 수 있으며 따라서 문화 매체에있는 수 없습니다.
  2. UV / VIS 분광 광도계와 함께 최적의 파장 (예 : 51,142 Cyanothece에 대한 OD 730)에서 문화의 광학 밀도에 의한 세포 성장을 모니터링합니다.
  3. 세포가 처음이 아닌 표시 매체 성장하실 수 있습니다. 중간 로그 성장 위상 세포는 레이블 매체 접종 (볼륨 접종 비율을 3 % (V / V))에 사용 선호하고 있습니다. 표시된 문화는 초기 inoculum 이외의 레이블 탄소의 도입을 피하기 위해 같은 표시된 매체 (3 % V / V 접종 비율) 하위 교양하여야한다.
  1. 원심 분리 (10 분, 8,000 × g)하여 중간 로그 성장 단계에서 수확 하위 교양 전지 (10mL).
  2. 6M HCL의 1.5mL의 펠렛을 Resuspend하고 맑은 유리, 나사 맨 GC의 약병에 전송할 수 있습니다. 튜브를 모자 아미노산으로 바이오 매스 단백질 hydrolyze 24 시간 동안 100 ° C의 오븐에 넣어. 바이오 매스 펠렛의 가수 분해는 20 일반적인 아미노산 (그림 2) 5 16를 얻을 수 있습니다. 시스테인과 트립토판가 타락하고, 글루타민과 아스파라긴는 각각, 글루 탐 산염 및 aspartate로 변환됩니다.
  3. 이 ML Eppendorf 튜브를 사용하여 5 분 20,000에서 아미노산 솔루션 × g을 원심 분리기, 새로운 GC의 튜브에 supernatants을 전송. 이 단계는 가수 분해 용액에 고체 입자를 제거합니다.
  4. GC 유리 뚜껑을 제거하고 써모 과학 Reacti - Vap 증발기 (주를 사용하여 공기의 흐름에 따라 완전히 샘플을 건조 : 동결 건조기에도 T를 사용할 수 있습니다O 건조 샘플). 이 단계는 하룻밤 사이에 할 수 있습니다.

3. 아미노산 derivati​​zation 및 GC - MS 조건

GC를 통해 아미노산 또는 유료 / 높은 극지 metabolites 분석이 metabolites는 아미노산이 휘발성이며, 가스 크로마 토그래피 2 분리될 수 있도록 derivatized 있어야합니다.

  1. tetrahydrofuran 150 μL (THF)와 N - (tert - butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide derivati​​zation 시약 150 μL로 건조 샘플을 디졸브.
  2. ° C 1 시간 65 80 사이의 오븐이나 열탕 목욕의 모든 샘플을 품어. 유리병에 metabolites가 해산되어 있는지 확인하기 위해 가끔 소용돌이.
  3. 10 분 20,000 × g에서 샘플을 원심 후 새로운 GC의 튜브에 뜨는을 전송. 뜨는은 명확하고 노란 솔루션을해야합니다. 감지기의 포화로 인해, GC - MS 측정 정확도가 높은 conce에 의해 영향을받을 수주입 TBDMS derivatized 아미노산 (이 예제는 종종 어두운 갈색 색상을 보여줍니다)의 ntration 따라서, 우리는 GC - MS 측정 6 전 THF를 사용하여 이러한 샘플을 희석한다.
  4. GC - MS (1시 5분 또는 1시 10분 분할 비율, 주입 부피 이용 = 1 μL, 캐리어 가스 헬륨 = 1.2 ML / 분).하여 샘플을 분석 다음 GC 온도 프로그램 사용 : 150에서 보류 ° 2 분 C, 3 증가 ° C 280 분 당 ° C, 20 ° C 증가 분 당 300 ° C, 그리고 5 분 만요. 솔벤트 지연이 ~ 5 분 (30m GC 열)로 설정할 수 있습니다. MS의 비율 (M / Z)를 충전하기 위해 대량의 범위는 60 500 사이에서 설정할 수 있습니다.

4. GC - MS 데이터 분석

  1. TBDMS derivati​​zed 아미노산 측정은 또한 GC 분리의 동위 원소의 차별에 의해 영향을받을 수 있습니다. 가벼운 동위 원소는 GC 열의 동위 원소을 끌어들여보다 약간 이동합니다. 잠재적인 측정 바이어스를 줄이기 위해, 우리는 전체의 질량 스펙트럼을 평균 수아미노산 피크 범위 6
  2. TBDMS derivatized metabolites의 GC와 MS 스펙트럼 7 이전에보고되었습니다. 각각의 아미노산에 대한 GC 유지 시간과 고유한 M / Z 봉우리는 그림 3에서 그림입니다.
  3. 아미노산이나 중앙 metabolites의 Derivatization 13 C (1.13 %)를 포함한 자연 - 분류 동위 원소의 상당 금액, 18 O (0.20 %), 29시 (4.70 %), 30시 (3.09 %)를 소개합니다. 원시 대량 isotopomer 스펙트럼 자연 동위 원소에서 측정 잡음은 출판 소프트웨어 5, 8을 사용하여 해결할 수 있습니다. 최종 isotopic 라벨 데이터는 대량 분수, 예를 들어, M 0, M 1, M 2, M 3 M 4로보고됩니다 (영 네 가지 13 C 표시된 탄소를 포함하는 조각을 대표).
  4. 2 - 옥소 - glutar : 아미노산의 측정 여덟 중요한 전구체 metabolites에 대한 isotopic 라벨 정보를 제공할 수3 - P - glycerate, 아세틸 - COA, erythrose - 4 - P, oxaloacetate, phosphoenolpyruvate, pyruvate, 그리고 리보 오스 - 5 - P, 먹었다. 이러한 metabolites의 라벨 패턴은 여러 중앙 신진 대사 경로 (그림 2) 9을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 라벨 실험의 결과는 더 이상 (예, RT - PCR) 다른 생화학 방법을 사용하여 확인할 수 있습니다.

5. 표시 아미노산 데이터를 사용하여 경로 분석

잘 설계된 13 C 추적 실험에서 생산 단지 몇 주요 아미노산을 조사함으로써, 우리는 전체 중앙 대사 정교한 13 C - 신진 대사 흐름 분석을 수행하지 않고도 여러 가지 독특한 경로 또는 효소 활동을 보여줄 수 있습니다.

  1. Entner - Doudoroff 경로 : [1-13 C] 포도당은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 세린 라벨은 알라닌 10 라벨보다 훨씬 낮은 것입니다.
  2. 분지 TCA 사이클 : [1-13 C]pyruvate는 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. TCA 사이클이 깨진 경우 글루 탐 산염은 하나의 탄소 11, 12으로 표시되는 동안, aspartate는 두 탄소로 표시하실 수 있습니다.
  3. mixotrophic 신진 대사에 캘빈 - 벤슨 - Bassham 사이클에 의해 CO 2 고정 : CO 2 비 - 표시 및 탄소 기판 라벨은 탄소 소스로 사용 둘. 캘빈 사이클이 작동하는 경우, 세린과 히스티딘 라벨이 크게 다른 아미노산으로 비교, 희석됩니다. 유기 탄소 소스 매체 13에있는 경우 이러한 방법은 상대적으로 CO 2 고정을 결정할 수 있습니다.
  4. 산화 pentose 인산 경로 : [1-13 C] 포도당은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면이 아닌 레이블 알라닌은> 50 % 12 수 있습니다.
  5. Anaplerotic 경로 (예 : 응원 + CO 2의 oxaloacetate) : 13 CO 2와 비 표시된 탄소 기판 (예 : 글리세롤 또는 pyruvate)은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, aspartate 라벨 13 세린 알라닌 및 비교, 훨씬 풍부합니다.
  6. 다시 구연산의 synthase : [1-13 C] pyruvate가 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 효소가 활성화되어 있으면, 글루 탐 산염은 β - 카르 복실 그룹 3, 4에 표시됩니다.
  7. Citramalate 경로 : [1-13 C] pyruvate, [2-13 C] 글리세롤, 또는 [1-13 C] 아세테이트는 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 류신 이소 류신과 라벨 금액 14 동일합니다.
  8. 세린 - isocitrate의 lyase주기 : [1-13 C] pyruvate 또는 [1-13 C] 락트 산은 탄소 소스로 사용할 수 있습니다. 통로가 활성화되어 있으면, 세린에서 세 번째 위치 탄소는 15 표시됩니다.
  9. 영양분의 활용 (즉, 외인성 아미노산) : 완전히 표시 탄소 기판이 아닌 레이블 아미노산과 문화 매체사용할 수 있습니다. 세포가 선택이 보충되지 않은 레이블 영양소를 활용하면, 우리는 바이오 매스에서 이러한 아미노산의 중요한 상표 희석을 볼 수 있습니다. 이 방법은 영양 보충은 세포 16 선호하는 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

6. 대표 결과

최근 bioenergy 연구 bioenergy 생산을위한 소설 phototrophic의 미생물을 사용하여 이익을 부흥 2 캡처를 CO있다. 중앙 신진 대사 경로의 생화 학적 지식을 잘 설립되지 않기 때문에 과거 몇 년 동안, 첨단 13C - 신진 대사 플럭스 분석 (13C - MFA)를 포함한 몇몇 13C - 대사 분석은,,, phototrophic 박테리아 중앙에 신진 대사를 조사하기 위해 적용되었습니다 이 이외의 모델 생물 10, 11, 17-20인치 여기, 우리는 Cyanothece에서 대체 이소 류신 경로의 발견 51,142 21 예제를 제시한다. 청록색이othece 51142은 전형적인 이소 류신 합성 경로에서 2 ketobutyrate로 트레오닌의 전환 catalyzes 효소 (EC 4.3.1.19, 트레오닌 암모니아 - lyase)를 포함하지 않습니다. 이소 류신 경로를 해결하기 위해, 우리는 54 MM의 글리세롤 (2 - 13C> 98%)와 ASP2 중간 22 Cyanothece 51,142 (20 ML)를 성장. Cyanothece 51142은 주요 탄소 소스로 분류 글리세롤 2 위치를 사용합니다. 우리는 이소 류신 세 탄소와 함께 표시되는 동안 트레오닌과 알라닌 하나가 탄소 라벨이 있는지 관찰합니다. 따라서, Cyanothece 51142의 합성은 대부분의 생물 (그림 4)에 의해 고용 트레오닌 경로에서 파생 수 없습니다. 한편, 류신과 이소 류신이 단편을 기반으로 동일한 상표 패턴을 가지고 (M - 15) +와 조각 (M - 159) +. 예를 들어,에서 isotopomer 데이터 [이 M - 15] +이 (조각 화되지 않은 아미노산을 포함하는) 류신에 대해 동일한 상표 (M0 = 0.01, M1 = 0.03, M2 = 0.21, M3 = 0을 표시0.69) 및 이소 류신 (M0 = 0.01, M1 = 0.03, M2 = 0.24, M3 = 0.67). 따라서 류신과 이소 류신은 같은 엽 성의 전구 물질 (즉, pyruvate 및 아세틸 - COA)에서 합성되어야합니다. 이 관찰 이소 류신 합성에 대한 citramalate 경로에 표시된 탄소 전환과 일치합니다. 이 경로를 확인하려면, 우리는 공동 게놈 연구소의 데이터베이스를 검색하고 Cyanothece에 citramalate synthase CIMA (cce_0248)의 존재를 찾으십시오.

그림 1
그림 1. 13 C를 이용한 경로 분석 단계를 반복합니다.

그림 2
그림 2. 자신의 신진 대사 엽 성의 전구 물질의 라벨 패턴을 습득에 사용되는 아미노산. ACoA, 아세틸 - COA, AKG, α - Ketoglutarate, C5P, 리보 오스 5 - 인산, CIT, 구연산, E4P, erythrose 4 인, G6P, 포도당 6 인산, OAA, oxaloacetate, 격려, phosphoenolpyruvate, PGA, 3 phosphoglycerate, PYR, pyruvate.

그림 3
그림 3. 16 아미노산에 대한 GC의 봉우리. TBDMS derivatized 아미노산은 두 조각으로 MS에 의해 금이 다음과 같습니다 (M - 57) +, 전체 아미노산을 포함하고, (M - 159) +, 어떤 아미노산의 α 카르 복실 그룹을 부족합니다. 류신과 이소 류신에 대한 (M - 57) +은 다른 대량 봉우리에 의해 overlapped했다. 우리는 전체 아미노산 라벨을 분석 조각 (M - 15) + 사용하는 것이 좋습니다. (f302) + 그룹은 아미노산 백본에서 첫 번째 (α - 카르 복실 그룹)와 두 번째 탄소를 포함하는 대부분의 아미노산에 감지됩니다. 이 MS 피크가 자주 높은 잡음 대 신호 비율을 가지고 있기 때문에 (f302) + 것은 양적 신진 대사 fluxes 7 ​​분석하지 않는 것이 좋습니다.

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그림 4. Cyanothece 51,142 (우리의 이전 논문에서 수정) 21 이소 류신 경로로 전환 레이블.

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Discussion

이 프로토콜은 표시 기판으로 세포를 먹이 및 GC - MS를 통해 아미노산의 결과 isotopic 라벨 패턴을 측정 구성되어 있습니다. MS 데이터 (M / Z 비율)는 MS 이온의 라벨의 단지 전체 금액을주고 있기 때문에, 우리는 M / Z 두 조각 화되지 않은 (M - 57) +의 비율과 조각 아미노산을 조사하여 아미노산의 isotopomer의 배포판을 평가해야 (즉, (M - 159) +과 (f302) +). 또한, 우리는 화학적으로 동일한 매체하지만 다른 라벨 패턴 (분류 1 일 위치, 라벨 2 차 위치 등)이 기판 여러 셀 문화를 수행할 수 있습니다. 이 실험에서 metabolites에 대한 레이블 정보는 중앙 신진 대사 경로를 통해 실제 탄소 전이 경로를 디코딩 통합될 수 있습니다.

경로 분석을 위해, 레이블 기판의 선택이 중요합니다. 일반적으로 단독으로 표시된 탄소 기판은 eas 아르ier이 표시된 탄소의 운명을 추적에 사용할 때 중앙 통로를 통해 13의 C percolates, 다중 탄소 기판 수 있습니다 혼란 탄소 추적을 표시하면서. 또한, 홀로 라벨이 기판은 4 예를 들어, (재) 형 구연산의 synthase 정상 구연산의 synthase 다른 반응 입체 화학을 보여줍니다. 균일하게 표시 기판보다 metabolites의 독특한 분자 구조를 명료하게하다 더 유익하고 있으며, 따라서 다른 분자 chirality을 구연산을 초래 . 한편, 기판들은 관련 경로를 검색하기 위해 적합성에 다릅니다. pyruvate 또는 아세테이트는 TCA 사이클과 일부 아미노산 경로 분석을위한 가장 좋은 반면 포도당은 해당 작용과 pentose 인산염 경로 사이의 분할 비율을 검출에 가장 적합합니다. 따라서 세포 신진 대사의 전반적인 그림을 조사하기 위해 다른 기판을 사용하는 것이 필요합니다.

13 C - 동위 원소라벨은 미생물의 기능 경로를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 그러나,이 기술은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 그것은 CO 2는 유일한 탄소 소스로 사용하는 경우 직접 autotrophic의 신진 대사에 신진 대사를 해결할 수, 유기 기판을 사용하여 탄소 대사 분석에만 적합합니다. 입력 12 CO 13분의 2 CO 2 혼합 23과 같은 범위 내에서 CO 2 라벨 모든 아미노산을 사용하여 Autotrophic 문화. 대사 분석이 다른 대사 경로에 의해 metabolites 13 C의 탄소의 다시 정리하기에서 유추하는 것처럼 이것은, 경로 분석이 어려운 있습니다. 둘째, 본 논문은 "활성화"와 "비 활성"경로 사이의 차별은 전적으로 질적 결과를 보여줍니다. 대사의 정확한 양을 정함은 정교한 모델링 접근 방식 (즉, 필요 셋째, 13 C - 대사 분석의 범위는 낮은 풍부하고 불안 정한 metabolites를 결정하는 기술적인 문제에 의해 제한됩니다. 광범위한 대사 네트워크는 아미노산 이외에도 무료 metabolites를 분석하여 탐색할 수 있습니다. 무료 metabolites의 측정은 고도로 효율적인 신진 대사 추출 방법과 매우 민감한 분석 플랫폼 모두 필요합니다. LC - MS, FT - ICR MS와 CE - MS 무료 metabolites의 라벨 패턴을 식별을 위해 사용하고, 세포 신진 대사이에 더 많은 통찰력을 제공하고 있습니다. 있기 때문에 넷째, 13 C - 지원 경로 분석이 최고 최소한의 매체 이루어집니다 비 분류 영양 보조제의 또한 거짓 낮은 라벨 농도에 이르게하고 그래서 간단하지 정량 13 C - MFA 연구를합니다. 또한, 세포는 단백질 synthesi에 대해 광범위하게 외인성 아미노산을 활용할 수S는, 그래서이 proteinogenic 아미노산 24 매우 약한 상표 신호를 제공합니다. 풍부한 매체가 아미노산의 세포, 세포 metabolites 측정하는 대신 성장을 위해 필요한 경우, 효과적으로 외인성 비 표시된 탄소 영양소에서 발생하는 데이터를 라벨에 간섭을 줄일 수 있습니다.

마지막으로, 이외의 모델은 미생물 종에 대한 게놈 시퀀스의 증가는 매년 출판되고있다. 그러나 이러한 종류의 기능 특성이 훨씬 게놈 시퀀싱의 속도 뒤에 느껴지있다. 13 C - 라벨 방식이 아닌 다양한 모델 생물의 대사 경로의 확인 및 발견에 중요한 역할을 재생할 수 있습니다. 또한, 상표 정보는 미생물 25 해독 절대 탄소 fluxes에 신진 대사 모델링 (13 C - MFA)와 통합될 수 있습니다. 따라서,이 기법이 널리 ecolog, 생물 연료에 관련된 생물 학적 시스템을 분석에 사용할 수 있습니다ICAL 및 의료 응용 프로그램입니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

이 연구는 NSF 커리어 그랜트 (MCB0954016)와 DOE Bioenergy 연구 부여 (DEFG0208ER64694)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TBDMS Sigma-Aldrich 19915 -
THF Sigma-Aldrich 34865 -
Labeled carbon substrate Cambridge Isotope Laboratories Depend on the experimental requirement Website: http://www.isotope.com
Gas chromatograph Agilent Technologies Hewlett-Packard, model 7890A -
GC Columns J&W Scientific DB5 (30m) -
Mass spectrometer Agilent Technologies 5975C -
Reacti-Vap Evaporator Thermo Fisher Scientific, Inc. TS-18825 For drying amino acid samples

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References

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