Метаболический Подтверждение пути и Discovery Через 13 C-маркировки протеиногенных Аминокислоты

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

13 С-изотопом маркировки полезным методом для определения ячейки центрального метаболизма для различных видов микроорганизмов. После клетки были культивировали с конкретными меченого субстрата, GC-MS измерение может выявить функциональные процессы обмена веществ на основе уникальных моделей маркировки в протеиногенных аминокислот.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

You, L., Page, L., Feng, X., Berla, B., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids. J. Vis. Exp. (59), e3583, doi:10.3791/3583 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Клеточные культуры (рис. 1)

  1. Рост клеток в минимальной среде с микроэлементами, солями, витаминами, и, в частности меченый углерод субстраты, которые лучше всего подходят для пути расследования. Используйте либо встряхивания колб или биореакторы для клеточной культуры. Органические питательные вещества, такие как экстракт дрожжей, может нарушать нормальное измерение аминокислоты маркировки кислоты и, следовательно, не могут присутствовать в культуральной среде.
  2. Монитор рост клеток по оптической плотности культуры на оптимальную длину волны (например, О. Д. 730 для Cyanothece 51142) с UV / Vis спектрофотометр.
  3. Клетки могут быть сначала выращивают в немеченого среды. Среднего журнал клетки фазы роста являются предпочтительными для использования для прививок (3% (объем / объем) по объему прививки) меченого среды. Помечены культура должна быть суб-культурных (3% об. / прививки отношение) в той же меченой среды, чтобы избежать введения не-меченый углерод из исходного посевного.
  1. Урожай суб-культуре клеток (10 мл) в середине журнала фазы роста путем центрифугирования (10 мин, 8000 × г).
  2. Ресуспендируют осадок в 1,5 мл 6 М HCl и перенести его на прозрачное стекло, завинчивающейся GC флаконе. Крышка флакона и поместите их в духовку 100 ° С в течение 24 часов для гидролиза биомассы белков на аминокислоты. Гидролиз биомассы гранулы могут дать 16 из 20 известных аминокислот (рис. 2) 5. Цистеин и триптофан разлагаются, и глутамин и аспарагин преобразуются в глутамата и аспартата, соответственно.
  3. Центрифуга аминокислоты раствора кислоты на 20000 х г в течение 5 мин с использованием 2 мл Eppendorf трубы, и передача супернатантах к новым ГК ампул. Этот шаг удаляет твердые частицы в гидролиза решение.
  4. Удалить GC крышки флакона и сухие образцы полностью под поток воздуха с помощью Thermo Scientific реакционном Vap испарителя (примечание: замораживание сушилка может также использоваться то сухих образцов). Этот шаг можно сделать в одночасье.

3. Амино кислоты и производных GC-MS условиях

Анализ аминокислот или обвиняемого / сильно полярных метаболитов через ГК требует, чтобы эти метаболиты быть производные, так что аминокислоты являются неустойчивыми и могут быть разделены с помощью газовой хроматографии 2.

  1. Растворите высушенных образцов с 150 мкл тетрагидрофурана (ТГФ) и 150 мкл N-(трет-бутилдиметилсилил)-N-производных methyltrifluoroacetamide реагента.
  2. Инкубируйте всех образцов в печи или на водяной бане между 65 и 80 ° С в течение 1 часа. Vortex иногда, чтобы убедиться, что метаболиты во флаконе, растворяют.
  3. Центрифуга образцов при 20000 х г в течение 10 мин, а затем передать супернатант к новым ГК ампул. Супернатант должны быть четкими и желтоватый раствор. Из-за насыщения детекторы, GC-MS точность измерения могут быть затронуты высокие concentration вводимого TBDMS производные аминокислот (эти образцы часто показывает темно-коричневого цвета), поэтому мы должны разбавлять эти образцы на основе ТГФ до GC-MS измерения 6.
  4. Анализ образцов GC-MS (используйте соотношении 1:5 или 1:10 раскол, объемом впрыска = 1 мкл, газа-носителя гелия = 1,2 мл / мин). Используйте следующие температуры GC программы: проводить при температуре 150 ° С в течение 2 минут, увеличение на 3 ° С в минуту до 280 ° С, увеличение на 20 ° С в минуту до 300 ° С, а затем, удерживая в течение 5 минут. Растворитель задержка может быть установлен как ~ 5 мин (для 30-метровая колонна GC). Диапазон массы к заряду (м / г) в MS может быть установлен между 60 и 500.

4. ГХ-МС анализа данных

  1. TBDMS производные аминокислот измерения кислота может также зависеть от изотопа дискриминации в отделение GC. Свет изотопы двигаться немного быстрее, чем бросать изотопов в колонку для ГХ. Для снижения вероятности смещения измерений, мы можем средний спектр масс целомаминокислоты диапазоне пик кислота 6
  2. GC и MS спектры TBDMS производные метаболитов были зарегистрированы до 7. GC время хранения и уникальные т / г пиков для каждой аминокислоты представлены на рисунке 3.
  3. Производных аминокислот или центрального метаболитов представляет значительные объемы естественно меченных изотопами, в том числе 13 C (1,13%), 18 O (0,20%), 29 Si (4,70%) и 30 Si (3,09%). Измерение шума от природных изотопов в сыром спектр isotopomer массу можно исправить с помощью программного обеспечения опубликовал 5, 8. Окончательный изотопные данные маркировки представлены как массовых долей, например, M 0, М 1, М 2, М 3 и М 4 (представляющих фрагменты, содержащие нуля до четырех 13 C меченых атомов углерода).
  4. Измерение аминокислот может предоставить информацию изотопного маркировки около восьми важнейших метаболитов предшественником: 2-оксо-glutarели, 3-P-глицерат, ацетил-КоА, эритроза-4-Р, оксалоацетат, фосфоенолпирувата, пируват, и рибоза-5-P. Маркировке моделей в эти метаболиты могут быть использованы для идентификации нескольких центральных метаболических путей (рис. 2) 9. Результаты экспериментов маркировки могут быть дополнительно подтверждена с помощью других методов биохимии (например, RT-PCR).

5. Путь анализа с использованием меченых аминокислот данные кислоты

Исследуя только несколько ключевых аминокислот производится из хорошо продуманных экспериментов 13 С трассирующими, мы можем выявить несколько уникальных путей или ферментативной активности, не выполняя сложные 13 C-метаболических потоков анализ всей центральной обмена веществ.

  1. Энтнер-Doudoroff пути: [1 - 13 C] глюкозы может быть использован в качестве источника углерода. Если путь является активным, серин маркировки будет значительно ниже, чем маркировка в аланин 10.
  2. Разветвленная ЦТК: [1 - 13 C]пируват может быть использован в качестве источника углерода. Если ЦТК сломан, аспартат могут быть помечены двумя атомами углерода, в то время как глутамат обозначена только с одним углеродом 11, 12.
  3. CO 2 фиксации Кальвина-Бенсона Bassham цикла в mixotrophic обмена веществ: Non-меченых CO 2 и меченый углерод подложки и используются в качестве источников углерода. Если Кальвина цикл функциональной, серина и гистидина маркировки будет значительно разбавленный, по сравнению с другими аминокислотами. Такой метод может определить относительную фиксации CO 2, когда органические источники углерода присутствуют в среду 13.
  4. Окислительный фосфата пентозы пути: [1 - 13 C] глюкозы может быть использован в качестве источника углерода. Если путь является активной, без меток аланин будет> 50% 12.
  5. Заживляющий путь (например, ПКП + CO 2 à оксалоацетат): 13 CO 2 и не меченый углерод субстратов (например, глицерин или пирuvate) может быть использован в качестве источника углерода. Если путь является активным, аспартат маркировки будет значительно обогащается, по сравнению с аланин и серин 13.
  6. Re-цитрат-синтазы: [1 - 13 C] пирувата можно использовать в качестве источника углерода. Если фермент активен, глутамат обозначена в β-карбоксильная группа 3, 4.
  7. Citramalate пути: [1 - 13 C] пирувата, [2 - 13 C] глицерина, или [1 - 13 C] ацетат может быть использован в качестве источника углерода. Если путь является активным, лейцин и изолейцин количества маркировки идентичны 14.
  8. Серин-изоцитратлиазы цикла: [1 - 13 C] пирувата или [1 - 13 C] лактат можно использовать в качестве источника углерода. Если путь является активным, третий углерода позиции в серин будут помечены 15.
  9. Использование питательных веществ (например, экзогенных аминокислот): культуральная среда с полностью меченый углерод подложки и не-меченых аминокислотмогут быть использованы. Если клетки выборочно использовать эти дополнены без меток питательные вещества, то мы увидим значительное разбавление маркировке этих аминокислот в биомассе. Этот метод может быть использован для исследования пищевых добавок которые предпочитают ячейки 16.

6. Представитель Результаты

Недавние исследования биоэнергии оживили интересы в использовании новых микроорганизмов фототрофных для производства биоэнергии и СО 2 захвата. В последние годы немало 13С-метаболизм анализов, в том числе передовые 13С-Метаболический Flux анализа (13С-MFA), были применены для исследования центрального метаболизма в фототрофных бактерий, так как биохимические знание центральной метаболических путей не обоснованными В этих не модельных организмов 10, 11, 17-20. Здесь мы приведем пример открытия альтернативный путь изолейцин в Cyanothece 51 142 21. Голубойothece 51142 не содержит фермент (EC 4.3.1.19, треонин аммиак-лиазы), которая катализирует превращение треонина в 2-ketobutyrate в типичный путь синтеза изолейцин. Для решения изолейцин пути, мы растем Cyanothece 51 142 (20 мл) в среду asp2 22 с 54 мм глицерина (2-13С,> 98%). Cyanothece 51142 использует 2-й позиции помечены глицерина в качестве основного источника углерода. Заметим, что треонина и аланина один меченый углерод, а изолейцин обозначена с тремя атомами углерода. Таким образом, синтез в Cyanothece 51142 не могут быть выведены из треонин маршрут занято большинство организмов (рис. 4). С другой стороны, лейцин и изолейцин имеют одинаковые шаблоны маркировки на основе фрагмента (М-15) + и фрагмент (М-159) +. Например, isotopomer данные из [М-15] + (содержащие нефрагментированной аминокислот) показывают идентичные маркировки лейцин (М0 = 0,01, M1 = 0,03, М2 = 0,21, М3 = 00,69) и изолейцин (М0 = 0,01, M1 = 0,03, М2 = 0,24, M3 = 0,67). Таким образом лейцин и изолейцин должны быть синтезированы из того же прекурсоры (например, пируват и ацетил-КоА). Это наблюдение согласуется с меченый углерод перехода в citramalate путь для изолейцин синтеза. Для подтверждения этого пути, мы ищем совместные генома Института базу данных и найти присутствии синтазы citramalate CIMA (cce_0248) в Cyanothece.

Рисунок 1
Рисунок 1. 13 C-помощь шагов пути анализа.

Рисунок 2
Рисунок 2. Аминокислоты используются для приобретения маркировки характер их метаболические предшественники. АКОА, ацетил-КоА, AKG, α-кетоглутарат; C5P, рибозы 5-фосфат, CIT, цитрат; E4P, эритроза 4-фосфат; G6P, глюкозо-6-фосфат; ОПД, оксалоацетат; PEP, фосфоенолпирувата; PGA, 3-фосфоглицерат; PYR, пирувата.

Рисунок 3
Рисунок 3. GC пики для 16 аминокислот. TBDMS производное аминокислоты взломан MS на два фрагмента: (М-57) +, содержащий всю аминокислоты, и (М-159) +, в котором отсутствуют α карбоксильной группой аминокислоты. Для лейцин и изолейцин, (М-57) + было перекрыто другими пиками массы. Мы рекомендуем использовать фрагмент (М-15) + проанализировать всю аминокислоты маркировки кислоты. (F302) + группы выявлены в большинстве аминокислот, который содержит только первый (α-карбоксильной группы) и второго атомов углерода в аминокислоты позвоночник кислоты. Потому что это MS пик часто имеет высокий шум-сигнал отношения, (f302) + не рекомендуется для количественного анализа метаболических потоков 7.

igure 4 "/>
Рисунок 4. Маркировка переходов в изолейцин путей в Cyanothece 51 142 (с изменениями от нашей предыдущей работе) 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол состоит из кормления ячейки с меченого субстрата и измерения в результате изотопного шаблонов маркировки в аминокислоты с помощью ГХ-МС. Поскольку MS данные (т / г соотношениях) дают только общее количество маркировки ионов MS, мы должны оценить isotopomer распределения аминокислот, исследуя т / г соотношение обоих нефрагментированной (М-57) + и фрагментарная аминокислоты (т. е. (М-159) + и (f302) +). Кроме того, мы можем выполнить несколько культур клеток с химически идентичны среде, но подложках, которые имеют различные модели маркировке (1-й позиции помечены, 2-й позиции помечены и т. д.). Маркировке информацию о метаболитов из этих экспериментов могут быть интегрированы для декодирования фактических маршрутов перехода углерода через центральные метаболические пути.

Для путь анализа, выбора меченого субстрата имеет большое значение. В общем, отдельно помечены подложках углерода EASфурье использовать в отслеживании судьбы меченый углерод при 13 С просачивается через центральные пути, в то время как несколькими углерода меченых субстратов может вносить путаницу углерода трассировки. Кроме того, отдельно помечены субстратов более информативны, чтобы выяснить уникальные структуры молекулы в метаболиты, чем равномерно меченых субстратов. 4 Например, (Re)-типа цитратсинтазы показывает различные стереохимия реакции от нормальных синтазы цитрат, и, следовательно, причины цитрат иметь различные молекулярные хиральности . С другой стороны, основаниях, отличаются по своей пригодности для выявления связанных с ними путей. Глюкоза является лучшим для обнаружения Коэффициент распределения между гликолиза и пентозы пути фосфата, а пируват или ацетата являются лучшими для анализа ЦТК и некоторые аминокислоты пути кислоты. Таким образом, необходимо использовать различные субстраты для расследования общую картину клеточного метаболизма.

13 С-изотопомМаркировка полезный метод для определения функционального пути у микроорганизмов. Тем не менее, этот метод имеет ряд ограничений. Первых, она подходит только для анализа метаболизма углерода с использованием органических субстратов, так как он не может напрямую решать обмена веществ у автотрофных метаболизм, если CO 2 используется в качестве единственного источника углерода. Автотрофные культур в CO 2, этикетки всех аминокислот в той же степени, как ввод 12 CO 2 / 13 CO 2 в смеси 23. Это делает анализ путей трудно, так как обмен веществ анализ должен быть выведен из перестройка 13 атомов углерода С в метаболитов различных метаболических путей. Во-вторых, эта статья представляет исключительно качественные результаты различия между "активными" и "неактивных" путей. Точное количественное обмена веществ требует сложного подхода моделирования (например, В-третьих, сфера 13 С-метаболизм анализ ограничивается техническими проблемами при определении низкой численности и неустойчивой метаболитов. Более широкие метаболические сети, могут быть проверены путем анализа свободных метаболитов помимо аминокислот. Измерение свободных метаболитов требует как высокоэффективных методов метаболита добычи и высокочувствительных аналитических платформ. LC-MS, FT-ICR MS, и CE-MS были использованы для идентификации маркировки модели свободных метаболитов, а также обеспечить более глубокое в ячейку метаболизма 2. В-четвертых, 13 C-помощь путем анализа лучше всего сделать в минимальной среде, потому что Добавление немеченого пищевых добавок приводит к ложно низкие концентрации маркировки и проведения количественных 13 C-МИД изучает не так просто. Кроме того, клетки могут использовать экзогенных аминокислот широко для белка synthesiс, и таким образом дают очень слабые сигналы маркировки для этих протеиногенных аминокислот 24. Если богатые среды, необходимые для роста клеток, измерения внутриклеточных метаболитов, вместо того, аминокислоты, может эффективно уменьшить помехи при маркировке данных, который возникает в результате экзогенных немеченого питательных веществ, углерода.

Наконец, все большее число геномных последовательностей для не-модельных видов микробных публикуются каждый год. Тем не менее, функциональные характеристики этих видов значительно отстает темпы геномного секвенирования. 13 C-маркировки подходы могут играть важную роль в подтверждении и открытие метаболических путей во многих не-модели организмов. Кроме того, в маркировке информация может быть интегрирована с метаболическим моделирования (13 C-МИД), чтобы расшифровать потоков углерода в абсолютном микроорганизмов 25. Таким образом, эта методика может широко использоваться при анализе биологических систем, связанные с биотопливом, Экологческих и медицинских приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Карьера NSF Grant (MCB0954016) и биоэнергетики DOE исследовательских грантов (DEFG0208ER64694).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TBDMS Sigma-Aldrich 19915 -
THF Sigma-Aldrich 34865 -
Labeled carbon substrate Cambridge Isotope Laboratories Depend on the experimental requirement Website: http://www.isotope.com
Gas chromatograph Agilent Technologies Hewlett-Packard, model 7890A -
GC Columns J&W Scientific DB5 (30m) -
Mass spectrometer Agilent Technologies 5975C -
Reacti-Vap Evaporator Thermo Fisher Scientific, Inc. TS-18825 For drying amino acid samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
  2. Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
  3. Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
  4. Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
  5. Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
  6. Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
  7. Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
  8. Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
  9. Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
  10. Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
  11. Tang, K. -H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
  12. Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
  13. Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
  14. Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
  15. Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
  16. Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. Forthcoming (2011).
  17. Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
  18. McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
  19. McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
  20. Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
  21. Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
  22. Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-fixing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
  23. Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
  24. Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
  25. Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics