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Rapid Point-of-Care Test de l'efficacité anticoagulante énoxaparine dans le sang total

Medicine
 

Summary

La démonstration d'une analyse quantitative rapide de l'inhibition de la coagulation sanguine par le bas poids moléculaire, l'héparine, l'énoxaparine. La contribution de l'énoxaparine est évaluée en retirant son influence à travers la digestion avec de l'héparinase. Une description plus complète de l'analyse est détaillée dans notre article publié.

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Inchiosa Jr., M. A., Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood. J. Vis. Exp. (68), e3852, doi:10.3791/3852 (2012).

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Abstract

Il est nécessaire pour un dosage clinique pour déterminer la mesure dans laquelle le sang d'un patient est effectivement anticoagulé par le bas poids moléculaire, l'héparine (HBPM), l'énoxaparine. Il ya aussi urgence des situations cliniques où il serait important si cela pouvait être déterminé rapidement. Le présent essai est conçu pour accomplir cette tâche. Nous avons seulement analysé des échantillons de sang de l'homme qui ont été dopés avec des concentrations connues de l'énoxaparine. La caractéristique essentielle de l'analyse actuelle est la quantification de l'efficacité de l'énoxaparine dans un échantillon de sang d'un patient en le dégradant à une inactivité complète avec de l'héparinase. Deux échantillons de sang ont été prélevés dans des tubes Vacutainer (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ) qui ont été enrichis avec l'énoxaparine, un échantillon a été digéré avec l'héparinase pendant 5 min à 37 ° C, l'autre échantillon représenté l'état de base du patient sous anticoagulant. Le raccourcissement du temps de coagulation pour cent de l'échantillon traité à l'héparinase, par rapport à la bEtat aseline, a donné la contribution anticoagulant de l'énoxaparine. Nous avons utilisé le portatif fonctionnant sur piles Hemochron 801 appareils pour la mesure des temps de coagulation (International Technidyne Corp, Edison, NJ). L'appareil dispose de 2 thermostatiques (37 ° C) de puits tubulaires dosage. Nous avons effectué les tests dans deux types de cartouches d'essai qui sont disponibles auprès du fabricant de l'instrument. Une cartouche a été modifié pour augmenter sa sensibilité. Nous avons enlevé le kaolin de la cartouche FTK-ACT par une vaste rinçage à l'eau distillée, ne laissant que la surface en verre du tube, et peut-être l'aimant de détection, comme activateurs. Nous avons appelé ce test minimalement activé notre (MAA). L'utilisation d'un test peu actif a été étudié par nous et les autres. 2-4 La deuxième cartouche qui a été étudiée était un temps de céphaline activée (TCA) test (A104). Il a été utilisé tel que fourni par le fabricant. Les puits thermostatés de l'instrument were utilisé à la fois pour la digestion héparinase et les tests de coagulation. L'essai peut être terminé dans les 10 min. Le test a montré des changements MAA robustes dans le temps de coagulation après digestion héparinase de l'énoxaparine sur une gamme de concentration clinique typique. À 0,2 UI anti-Xa de l'énoxaparine par ml d'échantillon de sang, la digestion héparinase provoqué une baisse moyenne de 9,8% (20,4 secondes) du temps de coagulation; à 1,0 UI par ml d'énoxaparine il y avait une diminution de 41,4% (148,8 sec). Ce rapport ne présente que l'application expérimentale de l'essai, sa valeur dans un contexte clinique doit encore être établi.

Protocol

1. Reconstitution Héparinase

  1. Lyophilisé héparinase I est obtenu commercialement (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) dans des flacons contenant 1 ug de la protéine purifiée. La protéine est dissous dans 0,25 ml de solution saline (0,9% NaCl).

2. Prélèvement des échantillons de sang

  1. Deux échantillons de sang sont attirés par le vide dans du citrate de sodium (0,3 ml 0,109 M; 3,2%) tamponné Vacutainer tubes (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ), les tubes sont à la fois pré-pointes avec une concentration connue de l'énoxaparine, le volume de sang qui est établi est de 2,7 ml. La teneur totale est ensuite 3,0 ml.

3. Digestion Héparinase

  1. La totalité du contenu du flacon héparinase qui peut être aspiré dans une seringue (environ 0,2 ml, 80% de la fiole, 0,8 g de protéine), est transféré dans un tube Vacutainer, 0,2 ml de solution saline (0,9% NaCl) est ajouté à le second tube, qui sert de BâleEtat ine avant élimination de l'effet de l'énoxaparine.
  2. Les deux tubes Vacutainer sont placés dans les puits de l'appareil thermostaté Hemochron pendant une période de 5 min. (L'adéquation d'un temps de digestion 5 min avec de l'héparinase a été créé dans notre travail déjà publié. 1)

4. Les dosages de coagulation

  1. À la fin de l'incubation héparinase, 2,0 ml de sang est transféré dans la cartouche d'analyse. Dans le cas du tube MAA, il est pré-rempli avec 0,1 ml de 250 mM de CaCl 2 pour initier la coagulation. L'analyse commerciale TCA cartouche (A104) est conçu pour initier la coagulation dans le sang total qui a été établi dans des tubes Vacutainer contenant du citrate de sodium comme anticoagulant.
  2. L'appareil signale la fin Hemochron de la coagulation sanguine et préserve les temps de coagulation en secondes. La différence entre les temps de coagulation de l'échantillon traité à l'héparinase et l'échantillon de référence, divisée par la coagulation timoi pour l'échantillon de référence, on obtient le pour cent de diminution résultant de l'élimination de l'énoxaparine. Comme on le verra ci-dessous, de fortes corrélations linéaires ont été obtenues pour la relation entre la diminution pour cent du temps de coagulation et la concentration de l'énoxaparine dans les échantillons dopés de sang entier, ainsi que pour la corrélation avec les concentrations mesurées de l'énoxaparine par le test chromgenic d'anti-Xa activité. Anti-Xa tests de concentration énoxaparine ont été réalisées avec un kit commercial pour un dosage chromogénique en deux étapes (BIOPHEN; Aniara, Mason, OH).

Representative Results

La figure 1 présente les résultats pour les relations entre la diminution du temps de coagulation pour cent après l'élimination de l'énoxaparine à l'héparinase pour une série de concentrations dopés de l'énoxaparine (0,2, 0,4 et 1,0 UI anti-Xa par ml). Les résultats sont présentés à la fois pour le MAA et cartouches d'essai TCA. Les concentrations mesurées de l'énoxaparine à partir du dosage chromogénique activité anti-Xa sont également inclus dans l'abscisse de chaque parcelle.

La figure 2 présente les parcelles des mêmes données que pour cent de diminution dans le temps de coagulation vs chromogène mesure de l'activité anti-Xa.

De fortes corrélations linéaires, avec des hauts significations statistiques, ont été trouvées pour les quatre relations.

Figure 1
Figure 1. Point de déterminations de soins de contr énoxaparineibution au temps de coagulation du sang total à pointes basées sur le changement pour cent (raccourcissement) du temps de coagulation après incubation avec de l'héparinase. Les concentrations énoxaparine pointes ajouté au sang total et les mesure anti-Xa plasmatique (moyenne ± écart type entre parenthèses) sont placés dans l'axe des abscisses de chaque graphique. Toutes les variations exprimées en temps de coagulation sont présentés comme des moyennes et SE, ainsi que le raccourcissement du temps de coagulation moyenne en secondes. Les données provenant du même patient sont reliés par des lignes pointillées. Les données pour les quatre patients identifiés par des astérisques sur la parcelle A sont (résultats MAA) de même que les quatre patients sur la parcelle B (tests TCA). Tous les résultats représentent une détermination unique. Les coefficients de corrélation de Pearson ont été r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) et r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) pour les relations avec le MAA et aPTTassay, respectivement. Reproduit avec la permission de Inchiosa et al 1.


. Figure 2 Les résultats pour les variations en pourcentage du temps de coagulation dans les essais au point de soins indiquées dans les figures 1A et B sont tracées en fonction des concentrations plasmatiques anti-Xa facteur A, les résultats MAA;. B, TCA essais. Tous les résultats sont de simples temps de coagulation et des déterminations individuelles de concentrations Xa anti-facteur. Les coefficients de corrélation de Pearson ont été r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) et r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) pour les relations avec le MAA et le dosage du TCA, respectivement Reproduit avec la permission de Inchiosa et al 1.

Discussion

Ce test d'efficacité énoxaparine peut servir comme une option importante pour déterminer la sécurité relative de l'exécution d'une procédure invasive qui présente un risque de saignement ou d'agent de développement d'un hématome. Ce serait particulièrement important quand une injection péridurale est envisagée. La majorité des lignes directrices recommandent une période d'attente de 12 heures entre l'injection d'énoxaparine et l'ouverture d'une procédure invasive 5 Insuffisance rénale, l'obésité et la grossesse peut influencer les exigences de dosage de l'énoxaparine 6,7 Depuis le dosage peut être effectué dans un 10.. - période min, il pourrait également être utilisé dans une clinique ou un cabinet de médecin, où il serait de fournir des informations sur l'adéquation du traitement anticoagulant chez les patients qui présentent un risque de développement de la maladie thromboembolique veineuse. Ajustements posologiques immédiates pourraient être mis en place, selon les besoins.

La concentration dans le plasma énoxaparine peut être mesurée par un développement chromogène d'unssay de l'étendue de l'inhibition du facteur de coagulation, Xa. Toutefois, cela ne donne sa concentration, ne sont pas spécifiquement son efficacité anticoagulante, qui varie considérablement d'un patient 6-8.

Nos études ont été réalisées uniquement avec l'énoxaparine. Cependant, il peut être prévu que l'essai pourrait être appliquée à n'importe quel HBPM qui est dégradé par l'héparinase I. Cela est déjà connu pour être le cas pour la daltéparine, tinzaparine nadroparine et 9-11. Nous avons conçu le test en ce qui concerne les caractéristiques de l'instrument le temps de coagulation Hemochron. L'instrument est relativement peu coûteux; aussi, les tubes jetables de collecte de sang, ampoule héparinase et cartouches de dosage pour effectuer une analyse pour un patient est d'environ 15 dollars américains. Ainsi, on pourrait s'attendre à être approprié pour surveiller l'état de l'anticoagulant dans divers contextes cliniques.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les enquêtes ont été menées uniquement avec l'aide de ressources ministérielles et institutionnelles. L'appareil de coagulation (Hemochron 801) a été prêté sans obligation auprès du fabricant. Les cartouches d'essai ont été achetées à leur prix de détail. Le chiffre d'initiation à la vidéo a été modifiée à partir Sanderink, et al. 12 La deuxième figure dans la vidéo (évolution dans le temps héparinase digestion) a été reproduite avec la permission de Inchiosa et al 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hepzyme Siemens AG B4240 heparinase I
"MAA" cartridge Technidyne FTK-ACT modified by kaolin removal
aPTT cartridge Technidyne A104

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References

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