Author Produced

Snabb Point-of-Care analys av enoxaparin antikoagulantia Effekt i helblod

Medicine
 

Summary

Demonstration av en snabb kvantitativ analys av inhiberingen av blodkoagulation genom den låg-molekylvikt-heparin, enoxaparin. Bidraget från enoxaparin bedöms genom att ta bort sitt inflytande genom rötning med heparinas. En närmare beskrivning av analysen beskrivs i vår publicerade papper.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Inchiosa Jr., M. A., Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood. J. Vis. Exp. (68), e3852, doi:10.3791/3852 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det är behovet av en klinisk analys för att bestämma i vilken utsträckning en patients blod effektivt antikoagulerat av låg-molekylvikt-heparin (LMWH), enoxaparin. Det finns också brådskande kliniska situationer där det skulle vara viktigt om det kunde fastställas snabbt. Föreliggande analys är utformad för att åstadkomma detta. Vi analyserade endast humana blodprov som spetsades med kända koncentrationer av enoxaparin. Det väsentliga särdraget hos föreliggande analys är kvantifieringen av effekten av enoxaparin i en patients blodprov genom nedbrytning att slutföra inaktivitet med heparinas. Två blodprover togs in Vacutainer-rör (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ) som spetsades med enoxaparin, ett prov digererades med heparinas under 5 minuter vid 37 ° C, representerade det andra provet patientens utgångsvärde antikoagulerat status. Den procentuella förkortning av koagulationstiden i heparinas-behandlade provet, jämfört med B-aseline tillstånd gav antikoagulerande bidrag enoxaparin. Vi använde den bärbara, batteridriven Hemochron 801 apparater för mätning av koagulationstider (International Technidyne Corp, Edison, NJ). Apparaten har 2 termostatreglerade (37 ° C) brunnar analysrör. Vi har utfört analyserna i två typer av analys patroner som är tillgängliga från tillverkaren av instrumentet. En patron ändrades för att öka dess känslighet. Vi bort kaolinet från FTK-ACT-patronen genom omfattande sköljning med destillerat vatten, vilket innebär att endast glasytan av röret, och kanske att upptäcka magneten, som aktivatorer. Vi kallade detta vår minimalt aktiverad analys (MAA). Användningen av en minimalt aktiverat analys har studerats av oss och andra. 2-4 Den andra patron som studerades var en aktiverad partiell tromboplastintid (aPTT) (A104). Detta användes som tillförs från tillverkaren. De termostat brunnar i instrumentet were används för både heparinas matsmältning och analyser koagulation. Analysen kan slutföras inom 10 minuter. MAA-analysen visade robusta förändringar i koagulationstid efter heparinas rötning av enoxaparin över en typisk klinisk koncentrationsområde. Vid 0,2 anti-Xa IE enoxaparin per ml blodprov, orsakade heparinas matsmältningen en genomsnittlig minskning på 9,8% (20,4 sek) i koagulationstiden, vid 1,0 IE per ml enoxaparin var det en 41,4% minskning (148,8 sek). I denna rapport redovisas endast den experimentella tillämpning av analysen, dess värde i en klinisk miljö måste ändå fastställas.

Protocol

1. Heparinas Rekonstituering

  1. Lyofiliserat heparinas I erhålles kommersiellt (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) i flaskor innehållande 1 pg av det renade proteinet. Proteinet löses i 0,25 ml saltlösning (0,9% NaCl).

2. Insamling av blodprover

  1. Två blodprover dras genom vakuum i natriumcitrat (0,3 ml 0.109M, 3,2%) buffrad Vacutainer-rör (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ), rören är både före spetsade med en känd koncentration av enoxaparin, blodvolymen som dras är 2,7 ml. Den totala halten är då 3,0 ml.

3. Heparinas Digestion

  1. Hela innehållet i den heparinas flaskan som kan aspireras in i en spruta (ca 0,2 ml, 80% av flaskan, 0,8 ^ g protein), överförs till en Vacutainer rör; 0,2 ml saltlösning (0,9% NaCl) tillsätts till det andra röret, som tjänar som baseline tillstånd före eliminering av enoxaparin effekten.
  2. Båda Vacutainer-rör placeras i den termostatreglerade brunnarna i Hemochron anordningen under en period av 5 minuter. (Bedömningen av en 5 min digestionstid med heparinas grundades vårt tidigare publicerade arbeten. 1)

4. Koagulering analyser

  1. Vid slutet av heparinas inkubering 2,0 ml blod överfördes till analysen patronen. I fallet med MAA röret, är det i förväg fylld med 0,1 ml av 250 mM CaClj 2 för att initiera koagulation. Den kommersiella aPTT-analysen patron (A104) är konstruerade för att utlösa koagulation i helblod som har dragits in Vacutainer rör innehållande natriumcitrat som antikoagulant.
  2. HEMOCHRON Anordningen signalerar slutförandet av blodkoagulation och bevarar de koagulationstiderna i sekunder. Skillnaden i koagulationstider mellan heparinas-behandlade provet och baslinjeprovet, dividerat med koagulering timig för baslinjen provet ger den procentuella minskningen till följd av eliminering av enoxaparin. Såsom diskuteras nedan, har starka linjära korrelationer erhållits för förhållandet mellan procent minskning i koagulationstid och koncentrationen av enoxaparin spetsade prover av helblod, liksom för korrelationen med uppmätta koncentrationer av enoxaparin med chromgenic analys av anti-Xa- aktivitet. Anti-Xa-analyser av enoxaparin koncentration utfördes med ett kommersiellt kit för en två-stegs kromogen analys (BIOPHEN, Aniara, Mason, OH).

Representative Results

Figur 1 visar resultaten för förhållandet mellan procent minskning i koagulationstid efter eliminering av enoxaparin med heparinas för en serie spetsade koncentrationer av enoxaparin (0,2, 0,4 och 1,0 anti-Xa IE per ml). Resultat presenteras för både MAA och APTT patroner analys. De uppmätta halterna av enoxaparin från kromogen analys av anti-Xa aktivitet ingår också i abskissan varje tomt.

Figur 2 visar diagram av samma data som procent minskning i koagulationstid jämfört kromogen mått på anti-Xa-aktivitet.

Starka linjära korrelationer med höga statistiska betydelser, hittades alla fyra relationer.

Figur 1
Figur 1. Point-of vård bestämningar av enoxaparin kontribution till koagulationstider av spetsade helblod baserade på procentuell förändring (förkortning) av koagulationstiden efter inkubering med heparinas. De spetsade enoxaparin koncentrationerna sattes till helblod och de uppmätta anti-Xa plasmakoncentrationer (medelvärde ± SE, inom parentes) är placerade i abskissan för varje graf. Alla procentuella förändringar i koagulationstider presenteras som medelvärden och SE, tillsammans med den genomsnittliga förkortning av koagulationstiden i sekunder. Data från samma patient är förbundna med streckade linjer. Data för de fyra patienterna som identifierats med asterisker i tomt A (MAA resultat) är desamma som de fyra patienterna i tomt B (APTT-analyser). Alla resultaten representerar enstaka bestämningar. Pearson korrelationskoefficienter var r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) och r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) för relationerna med MAA och aPTTassay, respektive. Återges med tillstånd från Inchiosa et al. 1


. Figur 2 Resultaten för de procentuella förändringarna i koagulationstider i point-of-care analyser visas i figurerna 1A och B är plottas mot plasma-anti-faktor Xa-koncentrationer A, MAA resultat,. B, APTT-analyser. Alla resultaten är från enstaka koagulationstid analyser och enstaka bestämningar av anti-faktor Xa-koncentrationer. Pearson korrelationskoefficienter var r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) och r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) för relationerna med MAA och aPTT-analysen, respektive Reproducerad med tillstånd från Inchiosa et al. 1

Discussion

Denna analys av enoxaparin effekt kan tjäna som ett viktigt alternativ för att bestämma den relativa säkerheten i att utföra en invasiv förfarande som har en åtföljande risk för blödning eller utveckling av en hematom. Detta skulle vara av särskild betydelse när en epidural injektion övervägs. Majoriteten av riktlinjer rekommenderar en väntetid på 12 timmar mellan injektion av enoxaparin och initiering av en invasiv procedur 5 Nedsatt njurfunktion, fetma och graviditet kan påverka dosering krav enoxaparin 6,7 Eftersom analysen kan avslutas inom 10.. - minutersperiod, kan det också användas i en klinik eller läkarmottagning, där det skulle tillhandahålla information om huruvida ett adekvat antikoagulation i patienter som löper risk för utveckling av venös tromboembolism. Omedelbara dosjusteringar kan väckas, om det behövs.

Enoxaparin koncentrationen i plasma kan mätas med en kromogen enssay av omfattningen av hämning av koagulationsfaktor, Xa. Men ger detta bara dess koncentration, inte specifikt dess antikoagulerande effekt, som varierar mycket mellan enskilda patienter. 6-8

Våra studier genomfördes endast med enoxaparin. Det kan dock förväntas att analysen kan tillämpas på varje LMWH som bryts ned av heparinas I. Denna redan är känt för att vara fallet för gruppen som fick dalteparin, nadroparin och tinzaparin. 9-11 Vi har utformat analysen i förhållande till egenskaperna hos Hemochron koagulationstiden instrumentet. Instrumentet är relativt billigt, även till de disponibla blod insamling rör, heparinas ampull och patroner analys slutföra en analys för en patient är ca $ 15. Det skulle således förväntas vara lämplig för att övervaka statusen antikoagulans i olika kliniska situationer.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Undersökningarna genomfördes endast med stöd av avdelnings och institutionella resurser. Koagulation apparater (Hemochron 801) lånades utan förpliktelse från tillverkaren. Analyspatronerna köptes till sina icke kostnader. Den inledande siffran i videon ändrades från Sanderink, et al. 12 Den andra siffran i videon (heparinas koktiden kurs) var reproducerad med tillstånd från Inchiosa et al. 1

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hepzyme Siemens AG B4240 heparinase I
"MAA" cartridge Technidyne FTK-ACT modified by kaolin removal
aPTT cartridge Technidyne A104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
  2. Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
  3. Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39 (2010).
  4. Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10 (2010).
  5. Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
  6. Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
  7. Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
  8. El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
  9. Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
  10. Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
  11. Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
  12. Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics