Non-invasiv Imaging af dissemineret candidiasis hos zebrafisk Larver

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den hastige udvikling, lille størrelse og gennemsigtighed i zebrafisk er enorme fordele for studiet af medfødte immunsystem kontrol af infektion

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051, doi:10.3791/4051 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dissemineret candidiasis forårsaget af patogenet Candida albicans er en klinisk vigtigt problem indlagte individer og er forbundet med en 30 til 40% kan tilskrives mortalitet 6. Systemisk candidiasis normalt styres af medfødte immunitet, og individer med genetiske defekter i medfødte immunsystem cellekomponenter, såsom fagocyt NADPH-oxidase er mere modtagelige for candidemia 7-9. Meget lidt er kendt om dynamikken i C. albicans interaktion med medfødte immunsystem-celler in vivo. omfattende in vitro-undersøgelser har fastslået, at uden for værten C. albicans spirer indersiden af makrofager og hurtigt ødelægges af neutrofiler 10-14. In vitro-undersøgelser, men nyttige ikke rekapitulere komplekset in vivo-miljø, der omfatter tidsafhængige dynamik cytokinniveauer, ekstracellulære matrixproteiner vedhæftede filer og intercellulære kontakter 10, 15-18

Zebrafisken larve giver en unik og alsidig vertebrat vært til undersøgelse af infektion. I de første 30 dage af udviklingen zebrafisk larver kun har medfødte immunforsvar 2, 19-21, forenkle undersøgelse af sygdomme, såsom dissemineret candidiasis, der er stærkt afhængige af medfødte immunitet. Den lille størrelse og gennemsigtighed i zebrafisk larver muliggøre scanning af infektion dynamik på det cellulære niveau for både vært og patogen. Transgene larver med fluorescerende medfødte immunsystem-celler kan anvendes til at identificere specifikke celletyper involveret i infektionen 22-24. Modificerede antisense-oligonukleotider (Morpholinos) kan anvendes til at vælte forskellige immun komponenter såsom fagocyt NADPH-oxidase og studere ændringer som reaktion på fungal infektion 5. Ud over de etiske og praktiske fordele ved at bruge en lille lavere hvirveldyr, tilbyder zebrafisk larverne unik mulighed for at billedet af slag mellem patogen og vært både intravitally og i farver.

Den Zebrafisken er blevet brugt til model-infektion for en række af de menneskelige sygdomsfremkaldende bakterier, og har været medvirkende til store fremskridt i vores forståelse af mycobakteriel infektion 3, 25. Men først for nylig har meget større patogener, såsom svampe blevet brugt til at inficere larve 5, 23, 26, og til dato har der ikke været en detaljeret visuel beskrivelse af infektionen metode. Her præsenterer vi vores teknikker til baghjerne ventrikel mikroinjektion af Prim 25 zebrafisk, herunder vores ændringer til tidligere protokoller. Vores resultater ved hjælp af larve zebrafisk model for svampeinfektion afvige fra in vitro undersøgelser og forstærke behovet for at undersøge vært-patogen vekselvirkningIndsatsen i komplekset miljø værten i stedet for en forenklet af petriskålen 5.

Protocol

Alle zebrafisk pleje protokoller og eksperimenter blev udført under Institutional Animal Care og Use Committee (IACUC) protokol A2009-11-01.

1. Morpholino og larver Injection Dishes

Eksperimentel varighed: * (10-15 minutter)

Sværhedsgrad: *

  1. For æg injektioner, udarbejde en 2% agarose-opløsning i sterilt vand og mikroovn. Når opløsningen er afkølet hælde noget af det til en ekstra dyb petriskål (Fisher Scientific), indtil den er halvt fuld. Cool på is, og sørg for, at pladen er i vater.
  2. Når skålen er blevet afkølet, hældes en 15 ml toplag 2% agarose. Sprøjt et æg indsprøjtning rillet plast skimmel (Adaptive Science Tools) med sterilt vand fra en sprayflaske. Omhyggeligt placere formen rillen nedad i den varme agarose. Når agarosen er afkølet, anvendes et metal flad spatel (VWR Scientific) at adskille formen fra AGAsteg. Langsomt fjerne gitteret fra agarose. Wrap embryo injektion retter i Parafilm (VWR Scientific) og gemme inverteret ved 4 ° C.
  3. For fisk larver injektioner fremstilles en 2% agarose-opløsning som beskrevet. Hæld opløsningen i en standard størrelse petriskål (VWR Scientific), og der er afsat, indtil det størkner. Wrap larver injektion retter i Parafilm og opbevar inverteret ved 4 ° C.

2. Fungal Culture Forberedelse

Eksperimentel varighed: ** (30 minutter)

Sværhedsgrad: **

  1. Fremstille gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD) agarplader: 10 g / l gærekstrakt, 20 g / liter pepton, 20 g / l dextrose og 20 g / liter agar til og autoklaven. For YPD væskeformigt fremstilling 10 g / l gærekstrakt, 20 g / liter pepton, 20 g / l dextrose og autoklaver 20-30 minutter ved 121 ° C.
  2. To dage før fisk infektioner forberede en stribe plade fra frossenbestande af Candida albicans kulturer over på YPD-agar til opnåelse af enkeltkolonier.
  3. Inkuber ved 37 ° C natten over.
  4. Sættes 5 ml YPD-medium i 16 x 150 mm dyrkningsrør (VWR Scientific).
  5. Dagen før fisk infektioner samle 1 lille koloni på YPD agar med et træ dyvel (VWR Scientific). Sæt pinden i kulturen røret og slyng rundt for at re-suspendere koloni i YPD væske.
  6. Vokse natten over ved 37 ° C på et TC-7 Tissue Culture Roller tromle er udstyret med en 14-tommers reagensglas hjul (New Brunswick Scientific).
  7. Den næste dag vågeblus 1 ml af kulturen ved 14000x g i 1 minut i en 1,7 ml rør (Axygen). Fjernes supernatanten og resuspender pelleten i restvæsken ved hvirvelblanding (VWR Scientific).
  8. Tilsæt 1 ml 1X phosphatpufret saltvand (VWR Scientific) og spin som tidligere beskrevet.
  9. Gentage PBS vask 3 gange.
  10. Fortyndet 1:100 fortynding i 1 x PBS (10 uL af vaskede C. albicans i 990 uL 1x PBS).
  11. Regn med en hæmocytometer (VWR Scientific).
  12. Fortynd til 10 7 celler / ml.

3. Zebrafisk Infektioner

Eksperimentel varighed: **** (1-3 timer)

Sværhedsgrad: ****

  1. Saml embryoner i henhold til § 5 og opbevar det i æg-vand, 60 mg / L Instant Ocean salte (Fisher Scientific) i sterilt demineraliseret vand.
  2. Anvendelse af et dissektionsmikroskop såsom Olympus SZ61 (Olympus), dechorionate embryoer på infektion dage. Anvende Dumont Dumoxel pincet (VWR Scientific) for at trække chorion 27 fra hinanden som åbning af en pose chips eller forsigtigt stikke pincetten i den lukkede position i chorion og derefter langsomt at åbne dem. Fiskene skal springe lige ud af chorion.
  3. Swirl den ekstra dybe petriskål med låg på for at flytte fisk i midten af ​​fadet. Overfør fisk låget af fadet. Fjern æg-vand ogudskiftes med friske medier. Tilføj fisk til medierne.
  4. Varme larver injektion retter i en inkubator ved 28 ° C. Forberede tricainmethansulfonat sulfonat (Western Chemical Inc.) fortynding ved 200 ug / ml for bedøvelse fisk.
  5. Tælle det ønskede antal af larver for infektion (20-50 fisk). Læg fisken i tricainmethansulfonat sulfonat løsning og vent 1-2 minutter, indtil de holder op med at bevæge sig.
  6. Tænd for MPPI-3 injektion enhed (Applied Scientific Instruments). Sørg for, at pressostaten er på "puls" og "impulsvarighed" er indstillet til 9 med 3 PSI til modtryk enhed. Åbne ventilen til nitrogenet beholderen, indtil trykket på injektionsstedet læser enheden 30 PSI.
  7. Indlæse en trukket mikropipette 28 med 5 pi vortexet Candida albicans ved en koncentration på 1x10 7 celler / ml. Placer mikropipette i mikropipetten holderen (Applied Scientific Instruments). Fyld en tom ekstra dyb petriskål med vand. Flyt mikropipette, indtil spidsen is inden for synsvidde netop rører overfladen af ​​vand via dissektionsmikroskop og anvendelse Dumont Dumoxel pincet (VWR Scientific) at klippe nålen omkring 3 mm fra spidsen af ​​trukket pipette.
  8. Tryk på fodkontakten (Applied Scientific Instruments) til at kontrollere nålen er blevet klippet. Du bør se væsken spredes, hvis du var en succes. Diameteren af væsken bolus bør ikke være større end diameteren af pupillen af pri 25 zebrafisk larve (0,21 mm, hvilket giver en kugle med 4,9 nL volumen). Juster trykket overensstemmelse hermed, hvis væsken bolus er for stor eller for lille.
  9. Bedøve fisk i tricainmethansulfonat sulfonat (200 ug / ml). Når fisken er stoppet bevæger sig, hvirvle skål med låg på indtil fisken er i centrum. Saml 50 fisk ved hjælp af en overførsel pipette (Fisher Scientific). Tryk på siden af ​​pipetten at afvikle fisken mod spidsen. Forsigtigt pipettere fisk på larvestadiet agarose skålen anvende så lidt væske som muligt.
  10. Linje fisken op med en glat glasstav (pas på ikke at knuse dem!). Aspirere så meget væske som muligt ud af skålen. Brug en Kimwipe til at væge væk fugt.
  11. Placer Larvetilstand agarosen fad med fisk under mikroskop, indtil du får et godt overblik over fisken og nålen på samme tid. Flyt glasset nålen mod fisken. Zoom ind på både fisk og nålen, som du placerer nålen mod fisken. Omhyggeligt bevæge glasset nålen ind i øret vesikel 27, 29 (øre) af den første fisk. Du ved, når du har flyttet nålen ind i fisken, fordi når du trykker på fodkontakten (Applied Scientific Instruments), vil baghjerne ventrikel løftes lidt op.
  12. Tryk på fodkontakten (Applied Scientific Instruments) og se væsken spredes inde i fiskens baghjerne ventrikel 27. Træk nålen ud af fisk og flytte til den næste fisk. Gentag proceduren, indtil du har injiceret alle fisk på pladen. Fjern alle dEAD fisk og injicere udskiftninger at holde antallet korrekte (50 fisk). For hver gruppe af 50 fisk injiceres en ny mikroinjektion nål skal udarbejdes, eller C. albicans sig i bunden af kanylen og tilstopper den eller kaster det injicerede koncentration.
  13. Vask fisken ud af skålen ved at vinkle fadet og sprøjtning æg vand på fisken i en ren ekstra dyb petriskål indeholdende 60 ml æg-vand. Det er vigtigt ikke at lade fisk på agarose længere end 15-20 minutter, eller de vil tørre ud og dø.
  14. Gentage hele injektion, indtil færdig. Glem ikke PBS og ikke-sygdomsfremkaldende injiceret kontrol.
  15. Når du er færdig, holder fiskene ved 28 ° C.
  16. Lukke nitrogentanken ventilen. Bevæge injektionsenheden overgangen fra "puls" til "kontinuerlig" for at lette trykket i tanken linie, skal trykket falder til nul ved dette punkt. Skift injektion enhed tilbage til "puls". Sluk injektionen enhed og rydde op i arbejdsområdet.
  17. 4. Klargøring af Fisk til Imaging

    Eksperimentel varighed: ** (30 minutter)

    Sværhedsgrad: **

    1. Forberede tricainmethansulfonat sulfonat opløsning som ovenfor (200 ug / ml). Få ud inficerede fisk, og overføre dem til tricaine.
    2. Forberede 47,9 ml 0,4% lavt-smeltende agarose (VWR Scientific) i æg-vand. Opløsningen opvarmes ved mikrobølgebehandling. Afkøles til 37 ° C og tilsættes tricainmethansulfonat sulfonat (200 ug / mL) til blandingen
    3. Når fisken er immobiliseret i tricainmethansulfonat sulfonat, pipette fisk i en petriskål (VWR Scientific) indeholdende 0,4% lavtsmeltende agarose (VWR Scientific).
    4. Dernæst bevæger fisken fra lavtsmeltende agarose i individuelle brønde i en glasbund skål (Mattek Corporation) til billeddannelse. Anvende så lidt lavtsmeltende agarose som muligt, så fisken ligger fladt på bunden af ​​skålen. Brug kun nok af tricaine-agarose at fylde iNER cirkler af glasset nederste skaal.

    5. Ændringer relateret til Jupiter protokoller

    Mikropipetter Mikroinjektion

    Eksperimentel varighed: * (10-15 minutter)

    Sværhedsgrad: *

    1. Træk hule glasstænger BF120-69-10 (Sutter Instruments) ved anvendelse af en brændende Brown Mikropipette Puller Model P-97 (Sutter Instruments) ifølge Yuan et al. 30. Vælg program # 7 med følgende betingelser Heat = 470, Hastighed = 120, Time = 200. Den resulterende Nålen er 8 mm fra facet til spids, og når først klippet ved 3 mm over spidsen har en diameter på cirka 10 um.
    2. Læg et glas mikropipette i de kantede parenteser. Vælg "Træk". Opvarmningen filament vil opvarme nål ifølge programparametrene og glasstangen vil separere i to trukket mikropipetter. Opbevar mikropipetter i en pipette opbevaringsboks (SuttER instrumenter).

    Embryonindsamling, Morpholino Injection og vedligeholdelse

    Eksperimentel varighed: *** (1-2 timer)

    Sværhedsgrad: ***

    1. Indsamle embryoer ifølge fremgangsmåderne ifølge Rosen et al. 31. Brug en plastik sigte (bagværk af Knutsford) at indsamle æg fra gyde-tanken (akvatiske habitater). Hold sigten hovedet ned over en ekstra dyb petriskål og skyl med tank vand til at indsamle æg.
    2. For morpholino præparat, tilsættes 300 pi sterilt vand til 300 nanomol morpholino (GeneTools, LLC). Dette giver en arbejdslager på 1,0 mM.
    3. Kontrollere koncentrationen af ​​morpholino ved hjælp af en Nanodrop (Thermo Scientific). Vælge "nukleinsyre og ændre prøvetype til" andre "og bølgelængde til 265. Indtast konstant ved at multiplicere molekylvægten af ​​morpholino med 1000 divideret med absorptivity koefficient anført i morfolino oligo egenskabsark.
    4. Tomme på nanodrop med 2 pi 0,1 N HCI. Fortyndet 5 pi af morpholino opløsningen i 95 pi af 0,1 N HCI (20x fortynding). Placer 2 pi af fortynding på nanodrop piedestal og klik foranstaltning. Multiplicere koncentrationen af ​​fortyndingsfaktoren (20). Dette giver en arbejdskoncentration på morpholino. At beregne millimolær koncentration opdele den koncentration opnået ved molekylvægten af ​​morpholino.
    5. Fremstil en arbejdsopløsning lager af morpholino i Danieau buffer (58 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca (NO3) 2, 5,0 mM HEPES, pH 7,6) og 0,01% phenolrødt (VWR Scientific).
    6. For morpholino injektion arbejde følge protokollen ifølge Rosen et al. 31 og Yuan et al. 30. Skylle morpholino injektion skåle med æg-vand og varmt ved 28 ° C i 15 minutter. Fjern vand fra injektion retter og line-up one-cell embryoer i rillerne injektion skålen (fremstillet ud fra afsnit 1) med en overførsel pipette. Hver plade vil indeholde ca 250 æg. Injicer 1-2 celle embryoer med morpholino. Æggene vil forblive i en celle stadiet i 15 minutter 27.
    7. Skyl injicerede æg med æg-vand når du er færdig (sterilt afioniseret vand med 60 mg / L Instant Ocean salte) og anbring i 60 ml æg-vand i ekstra dybe petriskåle. Morpholinogrupper injektion retter kan genbruges. Skyl med æg-vand når du er færdig og opbevar inverteret ved 4 ° C.
    8. Til opbevaring af embryoner tilsættes 60 ml æg-vand til fadet. Tæl 110 fostre med en overførsel pipette i separate ekstra dybe petriskåle med 60 ml æg-vand. Tilsættes 0,00003% methylenblåt for at forhindre mikrobiel vækst og inkuberes embryoner ved 28 ° C.
    9. For at fremskynde udviklingen af embryoner holde embryo retter ved 33 ° C i 24 timer og fase efter Kimmel et al. 27, så embryoner til at udvikle sig til et hovedstamme vinkel på 75 ° (Prim 25 trin 27).
    10. For larver infektion arbejde holde embryoer ved 28 ° C efter injektion med C. albicans.
    11. Hver dag vil erstatte embryonindsamlingsteam retter med 60 ml frisk æg-vand.

    Imaging

    Eksperimentel varighed: ***** (1-5 timer)

    Sværhedsgrad: ***

    1. Forbered fisk i lavtsmeltende agarose (i henhold til afsnit 4.2) med tricaine i glasbund imaging retter (Mattek Corporation), som beskrevet tidligere. Sæt fadet på et Olympus IX-81 (Olympus) inverteret mikroskop scenen. Bring fisken i fokus under 4x forstørrelse under forskellen interferens kontrast (DIC) lys. Billederne kan gemmes på 4x, 20x og 40x forstørrelse i DIC, TRITC (tetramethyl rhodaminisothiocyanat), og FITC (fluoresceinisothiocyanat) filter indstillinger.
    2. Brug et Olympus IX-81 omvendt mikroskop med en FV-1000 laserscannings konfokalt ifølge Ariga et al. 32. Gennemføre tidsforløbene ved 40x forstørrelse ved at sætte Z-stakke med 1-1,5 um skiver i timen for infektion.
    3. I lang tid under billeddannelse af 2 timer eller mere, placere et lag af lavtsmeltende agarose oven på fisk i det billeddannende skålen hver 2-3 timer. Dette forhindrer agarose mod udtørring og knusning af den fisk, mens den bliver afbildet. For lange tidsforløb med et lille antal fisk, skal du bruge en opvarmet etape (Bioptechs Inc.) for at opretholde 28 ° C i løbet af infektioner.

    6. Repræsentative resultater

    Et eksempel på en succesfuld baghjerne ventrikel C. albicans-infektion hos en zebrafisk larve i 5 timer efter infektion (HPI) og 24 HPI er vist i (figur 1). Makrofag-lignende celler med omsluttet C. albicans ses i baghjerne ventriklen ved 5 HPI. Ved 24 HPI, C. albicans er inde makrofag-lignende cellers i den dorsale hale vævet tegn på dissemineret candidiasis. Denne infektion resultat er meget afhængig af en nøjagtig injektion 10-15 gær-form C. albicans ind i baghjerne ventrikel. Screening af inficerede fisk umiddelbart efter injektion kan sikre.

    Figur 1
    Figur 1 Transgen fli1. EGFP 22, 33 larver inficeret med CaF2-yCherry Candida albicans og afbildes intravitally ved konfokal mikroskopi. (AC) 5 timer efter infektion (A) Infected larve med EGFP-udtrykkende makrofag-lignende celler på stedet for infektion (baghjerne ventrikel) Målestok = 100 um. (B og C) Højere forstørrelse billeder af samme fisk, viser C. albicans i fagocytter. Målestokken = 100 um B og 10 um for C. (DF) 24 timer efter infektion (D) Infected larve med dissemineret candidiasis med CaF2-yCherry C. albicans inde EGFP macrophage-lignende celler i den dorsale hale væv. Målestokken = 100 um. (E og F) Højere forstørrelse billeder af samme fisk, viser C. albicans i hale væv. Målestokken = 100 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den Zebrafisken mikroinjektion, der præsenteres her, adskiller sig fra Gutzman et al. 34 i dette her, vi viser injektion gennem otiske vesikel i baghjerne ventrikel 36 til 48 HPF larver. Metoden beskriver vi giver mulighed for konsekvent injektion af 10-15 gær i baghjerne ventrikel med reduceret vævsskader. Denne protokol giver en indledningsvis lokal infektion, der spredes i hele kroppen ved 24 HPI (figur 1) og resulterer i betydelig dødelighed / morbiditet 5. Den baghjerne ventrikel er ikke helt lukket, indtil 48 HPF 27, 29. I denne tidlige fase af udviklingen makrofager og neutrofiler migrere til stedet for infektion, fagocytere C. albicans, og kan flyttes til andre dele af legemet 5.

Den sande magt dette system kommer fra evnen til at kombinere zebrafisk transgener med fluorescerende protein-udtrykkende mikrober. Vi har dagineered vildtype-og mutant stammer af C. albicans til konstitutivt udtrykker mCherry, dTomato og eqFP650. Kombination af disse ekspressionskonstruktioner med oxidativt stress-responsive promotorer tillader ratiometrisk kvantificering af oxidativt stress i levende zebrafisk larver 5. Dobbelt in vivo-billeddannelse af fluorescerende svampe og fluorescerende medfødte immunsystem-celler i forbindelse med en mutant svamp eller fisk morphant kan også anvendes til at robust kvantificere ændrede immunresponser såsom migration til stedet for infektion, fagocytose af patogenet, forebyggelse af fungal spiring , og dræbte 5.

Der er flere teknik-relaterede spørgsmål, som kan være problematiske for en novice bruger af denne protokol. Først, er det vigtigt, at nålen er klippet passende og indsprøjtningstrykket er indstillet korrekt, således at 5 nL C. albicans suspension mikroinjiceres. For at sikre dette kan man kontrollere, at bolus kommer ud afnålen er størrelsen af pupillen af et prim 25 zebrafisk larve, som beskrevet i afsnit 3,8. Det er vigtigt, at zebrafisk larverne modtager den samme mængde injektionsstoffet, som kan bekræftes ved screening umiddelbart efter infektion ved epifluorescens at kontrollere, at der er 10-15 gær stede i baghjerne ventrikel. Indsprøjtet fisk kan også homogeniseres og belagt for verifikation af første kolonidannende enheder 5. Sekund, er det vigtigt at undgå at punktere blodkar i baghjerne ventrikel, som dette forårsager for tidlig død af larver. Det er vigtigt at tilføre den otiske vesikel med en omtrentlig 45 graders vinkel, som sikrer direkte mikroinjektion i baghjerne ventrikel. For det tredje, tage ekstra forsigtig med ikke at rive eller beskadige øret vesikel væv, hvilket kan resultere i øget inflammation til infektionen websted, der er uafhængig af patogen infektion. For det fjerde skal injektioner udføres hurtigt, når larver er anbragt på agarose injectipå fad. Larverne lov at sidde for længe på fadet vil tørre ud, og hvis dette sker vil der være dødelighed i PBS-injicerede fisk. Udfyldelse af infektioner inden for 15 minutter og efterlader en restmængde af vand på fadet, mens inficere fisk kan både hjælpe med at forbedre dette problem. Imidlertid kan efterlader for meget vand på skålen gøre injektionerne vanskeligere med drivende larver. En alternativ fremgangsmåde til indsprøjtning beskrevet for ældre (4 dpf) fisk, der er mere kompliceret, men undgår at udsætte larver for luft er tilvejebragt ved Cosentino og kolleger 28.

Den Zebrafisken larve har hidtil været anvendt til at modellere medfødte immunrespons for bakterielle, svampe og virale patogener 5, 26, 35-46. Disse banebrydende undersøgelser har etableret nytten af ​​denne model for at opdage nye cellulære og molekylære mekanismer i både vært og patogen. Taget sammen med dette beskrevet protokol, disse andre udgivne værker give et grundlag for andre laboratorierRies at undersøge vært-svampe interaktion i forbindelse med en intakt vært.

Skønt anvendelig i disse eksperimenter, at fli1: EGFP transgen linje beskrevet her har sine begrænsninger. Den fli1 genet udtrykkes i endothelial vaskulatur foruden makrofag-lignende celler 22. Ofte EGFP fluorescens vaskulaturen kan gøre det svært at opdage C. albicans i makrofag-lignende celler. Desuden bliver EGFP ekspression i makrofag-lignende celler reduceres omkring 18-24 timer efter infektion gør det vanskeligt at detektere. En nyligt offentliggjort makrofag-specifik transgene zebrafisk linje har mange fordele som en model for makrofagkulturer undersøgelser 23.

Den beskrevne infektion teknik tilvejebringer en entrée til en række stærke genetiske og fluorescensmikroskopi værktøjer i zebrafisk. Det kan kombineres med passende transgene fisk og manipuleret C. albicans C. albicans, frekvensen af C. albicans fordøjelsen, og opdelingen af C. albicans i medfødte immunceller 5. Man kan også kombinere denne protokol under anvendelse af morpholino antisense oligonucleotider til at teste rollen af individuelle medfødte immunsystem gener i infektion 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke laboratorium Dr. Carol Kim for mikroinjektion uddannelse, Clarissa Henry for at få råd om fremskyndelse embryo udvikling og anvendelse af udstyr, og Nathan Lawson for at bidrage fli1: EGFP fisk. Vi takker medlemmerne af Wheeler laboratoriet og Shawn Vægge til kritisk læsning af manuskriptet. Vi vil også gerne takke Mark Nilan for fisk pleje og rådgivning, og Ryan Phennicie og Kristin Gabor for teknisk rådgivning om dette projekt. Dette arbejde blev finansieret af en MAFES forskning assistentopholdet til K. Brothers, en MAFES Hatch tilskud E08913-08, og en NIH NCRR pris P20RR016463 til R. Wheeler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spawning tanks Aquatic habitats 2L
1.7 mL tubes Axygen MCT-175-C
Instant Ocean Fisher Scientific S17957C
Extra deep Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11Z
Standard Petri dishes VWR Scientific 25384-302
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
Yeast Extract VWR Scientific 90000-726
Peptone VWR Scientific 90000-264
Dextrose Fisher Scientific D16-1
Agar VWR Scientific 90000-760
Disposable Hemocytometer VWR Scientific 82030-468
Phosphate Buffered Saline VWR Scientific 12001-986
Dumont Dumoxel Tweezers VWR Scientific 100501-806
Wooden Dowels VWR Scientific 10805-018
KimWipes VWR Scientific 300053-964
Low Melt Agarose VWR Scientific 12001-722
Agarose for injection dishes VWR Scientific 12002-102
Flaming Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Hollow glass rods Sutter Instruments BF120-69-10 For glass rods smooth glass by heating over bunsen burner
Pipette Storage Box Sutter Instruments BX10
MPPI-3 Injection system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back Pressure Unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette Holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot Switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic Base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Tricaine methane sulfonate Western Chemical Inc. MS-222
Dissecting Scope Olympus SZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Confocal Microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
TC-7 Tissue Culture Roller drum with 14 inch test tube wheel New Brunswick Scientific TC-7
Imaging Dishes MatTek Corporation P24G-1.0-10-F
Pipette tips for loading needles Eppendorf 930001007
Plate pouring grids Adaptive Science Tools TU-1
Heated Stage Bioptechs Inc. Delta T-5
Flat Spatula VWR Scientific 82027-486
Plastic Sieves Wares of Knutsford Online 12 cm
Parafilm VWR Scientific 52858-000
Vortex Genie VWR Scientific 14216-184
16 x 150 mm Culture tubes VWR Scientific 60825-435
Nanodrop Thermo Scientific ND 2000
Phenol Red VWR Scientific 97062-478
HCl VWR Scientific 87003-216
NaCl VWR Scientific BDH4534-500GP
KCl VWR Scientific BDH4532-500GP
MgSO4 VWR Scientific BDH0246-500GP
Ca(NO3)2 VWR Scientific BDH0226-500GP
HEPES VWR Scientific BDH4520-500GP
Morpholinos GeneTools, LLC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
  2. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  3. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Dev Comp Immunol. 32, 745-757 (2008).
  4. Tobin, D., May, R. C., Wheeler, R. T. Zebrafish: a see-through host and fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction. PLoS Pathog. (2011).
  5. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  6. Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin. Microbiol. Rev. 20, 133-163 (2007).
  7. Ashman, R. B. Innate versus adaptive immunity in Candida albicans infection. Immunol. Cell Biol. 82, 196-204 (2004).
  8. de Repentigny, L. Animal models in the analysis of Candida host-pathogen interactions. Curr. Opin. Microbiol. 7, 324-329 (2004).
  9. Rogers, T. J., Balish, E. Immunity to Candida albicans. Microbiol. Rev. 44, 660-682 (1980).
  10. Calderone, R., Sturtevant, J. Macrophage interactions with Candida. Immunol. Ser. 60, 505-515 (1994).
  11. Frohner, I. E., Bourgeois, C., Yatsyk, K., Majer, O., Kuchler, K. Candida albicans cell surface superoxide dismutases degrade host-derived reactive oxygen species to escape innate immune surveillance. Mol. Microbiol. 71, 240-252 (2009).
  12. Kumamoto, C. A., Vinces, M. D. Contributions of hyphae and hypha-co-regulated genes to Candida albicans virulence. Cell Microbiol. 7, 1546-1554 (2005).
  13. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryot. Cell. 3, 1076-1087 (2004).
  14. Rubin-Bejerano, I., Fraser, I., Grisafi, P., Fink, G. R. Phagocytosis by neutrophils induces an amino acid deprivation response in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11007-11012 (2003).
  15. Behnsen, J. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathog. 3, e13 (2007).
  16. Lavigne, L. M. Integrin engagement mediates the human polymorphonuclear leukocyte response to a fungal pathogen-associated molecular pattern. J. Immunol. 178, 7276-7282 (2007).
  17. Newman, S. L., Bhugra, B., Holly, A., Morris, R. E. Enhanced killing of Candida albicans by human macrophages adherent to type 1 collagen matrices via induction of phagolysosomal fusion. Infect. Immun. 73, 770-777 (2005).
  18. Netea, M. G., Brown, G. D., Kullberg, B. J., Gow, N. A. An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nat. Rev. Microbiol. 6, 67-78 (2008).
  19. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28, 9-28 (2004).
  20. Magnadottir, B. Innate immunity of fish (overview). Fish Shellfish Immunol. 20, 137-151 (2006).
  21. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25, 341-350 (2008).
  22. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).
  23. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-e56 (2011).
  24. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  25. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin. Microbiol. 11, 277-283 (2008).
  26. Chao, C. C. Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infect. Immun. 78, 2512-2521 (2010).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203-253 (1995).
  28. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
  29. Haddon, C., Lewis, J. Early ear development in the embryo of the zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  30. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  31. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  32. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation. J. Vis. Exp. (43), e2093 (2010).
  33. Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
  34. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
  35. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  36. Meijer, A. H. Identification and real-time imaging of a myc-expressing neutrophil population involved in inflammation and mycobacterial granuloma formation in zebrafish. Dev. Comp. Immunol. 32, 36-49 (2008).
  37. Mathias, J. R. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J. Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  38. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
  39. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O'Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infect Immun. 78, 1495-1508 (2010).
  40. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  41. Clatworthy, A. E. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infect. Immun. 77, 1293-1303 (2009).
  42. Brannon, M. K. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cell Microbiol. 11, 755-768 (2009).
  43. Levraud, J. P. Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).
  44. van der Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  45. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infect Immun. 78, 4542-4550 (2010).
  46. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).

Comments

1 Comment

  1. That's really useful.

    Reply
    Posted by: Kane R.
    December 18, 2013 - 2:01 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics