غير البلازما من الربط PDMS للصناعات رخيصة من أجهزة ميكروفلويديك

Biology
 

Summary

نحن في هذا الفيديو لشرح كيفية استخدام الجهاز بدون ارتباط الخلايا العصبية ميكروفلويديك البلازما.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (9), e410, doi:10.3791/410 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية استخدام الجهاز بدون ارتباط الخلايا العصبية ميكروفلويديك البلازما. في بعض الحالات قد يكون من المرغوب فيه الأجهزة السندات عكسية على الزجاج رقم كورنينج تغطية 1. قد يكون هذا الواجب ، ربما ، إلى نظافة البلازما والتي لا تتوفر. في حالات أخرى ، قد يكون من المستحسن إزالة الجهاز من الزجاج بعد زراعة الخلايا العصبية لأنواع معينة من المجهري أو immunostaining ، على الرغم من أنه ليس من الضروري إزالة الجهاز لimmunostaining حيث يمكن ملطخة الخلايا العصبية في الجهاز. بعض الباحثين ، ومع ذلك ، لا تزال تفضل لإزالة الجهاز. في هذه الحالة ، والترابط عكسها الجهاز على الزجاج غطاء يجعل ذلك ممكنا. هناك بعض العيوب لغير البلازما الرابطة من الأجهزة التي يتم تشكيلها ليس ضيقا كما من الختم. في بعض الحالات قد المحاور تنمو تحت الأخاديد بدلا من خلالهم. أيضا ، لأن الزجاج وPDMS هي مسعور ، والسوائل لا تدخل بسهولة في الجهاز مما يجعل من الضروري في بعض الأحيان لقوة وسائل الإعلام والكواشف الأخرى في الجهاز. وسوف تدخل سوائل الجهاز عبر عمل شعري ، لكنه يأخذ فترة أطول كثيرا بالمقارنة مع الأجهزة التي تم البلازما المستعبدين. نظافة البلازما المائية يخلق رسوم مؤقتة على الزجاج والأجهزة التي تسهل تدفق السوائل عن طريق الجهاز بعد الربط في غضون ثوان. لغير ملزمة أجهزة البلازما ، وتدفق السائل من خلال أجهزة تستغرق عدة دقائق. من المهم أيضا أن نلاحظ أن ليتم استخدامها مع أجهزة البلازما عدم الربط يجب أن يتم تعقيمها الأولى ، في حين أن أجهزة البلازما المعالجة لا بد من تعقيمها قبل استخدامها لأن نظافة البلازما وتعقيم لهم.

Protocol

إعداد أجهزة ميكروفلويديك للثقافة الخلية العصبية

1) النظافة كورنينج NO.1 24 مم X 40 مم الشرائح الزجاجية

  • يصوتن الشرائح الزجاجية في المياه sonicator حمام لمدة 30 دقيقة
  • شطف شرائح الزجاج مع EtOH 70 ٪
  • يغسل ثلاث مرات مع الشرائح درهم 2 O
  • الجافة الشرائح في نسيج الثقافة غطاء لعدة ساعات ، ويفضل بين عشية وضحاها

ملاحظة : لقد صواني معدنية خاصة أننا مع تحميل الشرائح. يتم فصل على حدة وتوضع الشرائح في فتحات في هذا رف معدني. يمكن أن نضع هذه الصواني ثم تحميل المعدنية في طبق زجاج أننا مع ملء مكان ، والماء في الماء sonicator الحمام ، ويصوتن لمدة 30 دقيقة. وتنفذ يغسل اللاحقة في هذا الطبق.

2) إعداد الأجهزة PDMS

  • قطع القالب PDMS من رقاقة السيليكون ، والثقوب لكمة في المدلى بها والربع PDSM أنها
  • تنظيف الأجهزة التي تهب PDMS أول شحنة من الغاز الخامل (الأرجون أو النيتروجين) عبرها. ثم استخدام العلامة التجارية 3M سكوتش 471 الشريط لرفع الحطام قبالة أي المتبقية

ملاحظة : من المهم للحفاظ على مواجهة الأجهزة. في البداية ، ونحن عندما قطع PDMS بعيدا عن رقاقة السيليكون ، وجنبا إلى جنب في اتصال مع رقاقة هو الجانب نظيف : أنه يحتوي على قنوات ميكروفلويديك. ونحن نحاول أن نكون حذرين ما في وسعنا حتى لا يسبب ضررا للجهاز ، والحفاظ على وجهه الجانب نظيفة حتى أننا مستعدون للارتباط البلازما.

  • الأوتوكلاف الأجهزة في حاويات من البلاستيك
  • بعد التعقيم ونظيفة رقم (1) والشرائح الزجاجية كورنينج البلازما أجهزة علاج باستخدام العلامة التجارية Harrick البلازما الأنظف ، www.harrickplasma.com
  • وضع أجهزة تنظيف الجانب السلبي على شريحة زجاجية.

الجهاز الآن البلازما المستعبدين إلى الشريحة الزجاجية.

3) الأجهزة مع طلاء بولي L - يسين (PLL)

  • يضاف إلى PLL جيدا على كل جانب من الجهاز ، ويسمح لتدفق في البئر خلال المقبل

=> 150 ميكرولتر من PLL لآبار كبيرة و 30 μ ل PLL لأصغر الآبار. فإنه ليس من الضروري أن يكون بالضبط ما دامت هي آبار كاملة.

ملاحظة : اذا نظرتم الى جهاز سترى 4 آبار : يتم توصيل كل اثنين. تريد وضع PLL في واحدة حتى جيدا أنه سوف تتدفق من خلال الجهاز في البئر المقبل.

  • السماح لتدفق PLL من خلال الجهاز لمدة 10 دقائق ثم إضافة المزيد من PLL إلى الآبار لملء لهم حتى
  • وضع الأجهزة التي تحتوي على PLL في حاضنة على 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات (يتم بين عشية وضحاها من الأفضل)
  • فراغ خارج PLL الزائدة بعد العلاج ، ولكن يجب الحرص على عدم تمتص جميع السائل خارج الجهاز

ملاحظة : لا أريد أن أعرض فقاعات الهواء إلى قنوات أو الغرفة. مجرد فراغ خارج PLL الزائدة في الآبار.

  • إضافة تعقيمها درهم 2 O إلى كل بئر على جانبي الجهاز ، والسماح لتدفق البئر غيرها من عمل شعري

الرقم 1 هو رسم تخطيطي لجهاز ميكروفلويديك. لاحظ كيف يتم توصيل الأزرق (سوما الجانب) ، وترتبط الأحمر (الجانب محواري). عندما نقول وضع PLL ، أو المياه أو وسائل الإعلام ، على بئر واحدة على كل جانب من الجهاز ، ما نقصده ، على سبيل المثال ، هو : 150 مكان المجاهدين من 2 تعقيمها O درهم في أحد الأزرق ميكرولتر حسنا 150 درهم من المكان ثم تعقيمها 2 0 في واحدة الأحمر حسنا. فإن الماء (أو PLL ، أو وسائل الإعلام ، أو خلايا) تتدفق من خلال الجهاز إلى جانب المقابلة الأخرى.

الشكل 1

الشكل 1

ملاحظة : يرجى ملاحظة أنه سيتم من الآن فصاعدا ، عندما أقول "وسائل الاعلام مكان ، والخلايا ، والمياه أو الآبار PLL في القمة" ، وأنا أشير إلى الرسم البياني أعلاه حيث سوما سيكون على اليسار وعلى محاور عصبية تنمو إلى الحق.

  • نضح المياه قبالة (مرة أخرى والحرص على عدم إزالة الكامل لجميع السائل من الجهاز) ، ثم إضافة أخرى ميكرولتر 150 من تعقيمها O 2 درهم واحد لكل اتصال جيد والسماح لها بالتدفق من خلال المقابلة الى جيدا.
  • وضع الجهاز يحتوي درهم 2 O في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم كرر الخطوة يغسل مرة أخرى. يغسل ثلاث مرات مع الأجهزة درهم 2 O لمدة ساعة واحدة لكل منهما ، والذي هو مجموع.

ملاحظة : نظرا لاحتمال أن بورات من PLL يمكن أن تمتص في PDMS ، وبعض في مختبر جون يوصي تفرخ بين عشية وضحاها مع الأجهزة تعقيمها O 2 درهم بعد بضع طيشطف nitial سريعة. وهذا التأكد من أن جميع بورات الإرادة الحرة ليتش من PDMS قبل التحميل من الخلايا. إذا لم يتم ذلك ، قد يكون هناك اطلاق سراح بورات في وسائل الإعلام على مر الزمن ، والتي يمكن أن تؤدي إلى السمسة.

  • إضافة الوسائط العصبية القاعدية (NBM) مع العوامل الضرورية (glutamax ، B27 ، PenStrep) إلى أعلى الآبار

ملاحظة : يمكن المحتضنة الأجهزة بين عشية وضحاها ، ومطلي مع الخلايا في اليوم التالي ، أو المحتضنة لا تقل عن 3 ساعات مع عوامل + NMB الطلاء قبل الخلايا.

إعداد الخلايا العصبية للتحميل في أجهزة

نحن نستخدم 18 يوما القديمة القشرة الفئران الجنينية التي نشتريها إما من شركة تدعى بت الدماغ أو مستعدة ذلك هنا في الحرم الجامعي بالنسبة لنا. نحن نفضل الحصول على أنسجة جديدة.

  1. 1 الحصول على الجنين قشرة الدماغ (2 قطعة من النسيج) المخزنة في البريد إسبات
  2. يستغرق 3 ماصات زجاجية طويلة واطلاق النار عليهم في كل الأحجام الصغيرة تباعا باستخدام مصباح الكحول
  3. إزالة الأنسجة من E إسبات مع ماصة الزجاج ومكان في 2 مل من العوامل + NMB في أنبوب 15 مل العقيمة.
  4. سحن : استخدام ماصة لمبة زجاجية ويتم تمرير القشرة صعودا ونزولا حوالي 5 إلى 10 مرات. ثم ، يتم استخدام ماصة صغيرة بجوار ماصة صعودا وهبوطا في الأنسجة. أخيرا ، يتم استخدام أصغر ماصة للماصة صعودا وهبوطا في الأنسجة. نود أن نتأكد من عدم وجود قطع مرئية.

    ملاحظة : في الآونة الأخيرة ، وبدأت المقارنة بين جيون مختبر الخلايا من الأنسجة المخزنة في البريد إسبات إلى الخلايا التي تم إعدادها من الأنسجة في البداية تعامل مع التربسين 0.125 ٪ في 50 ٪ كا + + مجانا + + والمغنيسيوم العازلة تشريح الحرة. تجمع الآراء على أن نسيج المعدة باستخدام الخلايا التربسين الغلة أكثر قدرة على البقاء من الأنسجة وضعت في البداية E. إسبات إذا كنت لا تنوي استخدام الأنسجة على الفور ، ثم أنت بحاجة لتخزين الأنسجة في إسبات E.

    إذا كنت تنوي استخدام الأنسجة على الفور ، وأود البقاء زيادة ، ثم التعامل النسيج مع التربسين قبل سحن الميكانيكية على النحو التالي : 1) تمييع 1 مل التربسين 0.25 ٪ (Gibco ، Invitrogen) مع 1 مل من + كا + مجانا ميغاغرام مجانا + + تشريح العازلة (التربسين النهائي = 0.125 ٪) في أنبوب 15 مل (حفاظ على برودة الثلج) ، 2) مكان في الأنسجة العازلة واحتضان فورا عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق ، 3) إضافة 10 مل DMEM/10 ٪ لوقف FBS التربسين تفاعل وتواصل بروتوكول أدناه.

  5. الخلايا في جهاز الطرد المركزي 1100 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة
  6. يستنشق وسائل الإعلام بعناية قبالة الخلية بيليه
  7. إضافة 1 مل من العوامل + NMB لبيليه وإعادة علقت عليه ، pipetting صعودا وهبوطا
  8. تمر الخلايا إعادة علقتها تدفق الجاذبية من خلال مرشح لإزالة أي تكتلات دينار بحريني (فالكون 40 مصفاة الخلية النايلون أم)
  9. والخلايا لوحة العد :
    • في أنبوب microfuge ، إضافة NMB 60 ميكرولتر + العوامل ، 20 ميكرولتر من التعليق الخلية ، و 20 ميكرو لتر من اللون الأزرق ثم مزيج التريبان
    • إضافة حوالي 10 ميكرولتر من هذا الحل لعدادة الكريات وعد الخلايا الحية (وليس الأزرق)
    • ضبط تركيز على 2،5-4،5 X10 6 خلية / مل

      ملاحظة : نحن عموما الحصول على تركيز من حوالي 2،5-4،5 X 106 خلية / مل. اعتمادا على حجم ومعلق الخلايا في (عادة 1 مل + NBM B27/Glutamax/PenStrep percortex). إذا كان على استعداد للنسيج التربسين مع ذلك ، من المحتمل أن تكون زيادة الغلة.

الطلاء وأجهزة

  1. تحميل الخلايا (الخلايا العصبية الأولية) في واحدة من جانب الجهاز
  2. لوحة 5 ميكرولتر في جهاز صغير و 20 ميكرولتر لكل جهاز كبير

    ملاحظة : يمكنك تحميل 10 ميكرولتر من الخلايا في الجزء العلوي من الجهاز و 10 ميكرولتر على الجزء السفلي من الجهاز (إجمالي حجم نصف) ، أو مباشرة عن 20 ميكرولتر من الخلايا في أعلى جسدي جيدا (5 ميكرولتر في جسدي جيدا الأعلى للأجهزة الصغيرة).

  3. احتضان لمدة 10 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية بحيث تبدأ الخلايا لإرفاق
  4. إضافة ميكرولتر 150/30 تقريبا من العوامل + NMB لكل اعتمادا على حجم الجهاز جيدا

    ملاحظة : وحدات التخزين قد تختلف تبعا لسمك PDMS. كل ما يهم هو أن تمتلئ الآبار.

تكميلية على استخدام الأجهزة وبدون الربط البلازما

من دون علاج البلازما ، وكريستينا تو ، فني ، الذي لا بنجاح كل أسبوع دون البلازما ، ويقول لتحميل فقط على الخلايا على الفور.

تذكر لإزالة وسائل الإعلام من كل من الآبار على الجانب سوما (محوار الجانب لن يهم إذا تركت وسائل الإعلام في). انها تدفق السائل الذي يسمح للخلايا لدخول القناة الرئيسية. إذا كان لديك وسائل الاعلام في الآبار ، وأنك لن تحصل على تدفق السوائل.

Discussion

تظاهر نحن هنا كيفية استخدام الجهاز عصبون ميكروفلويديك دون الحاجة إلى نظافة البلازما. نشير إلى هذه الرابطة وغير البلازما.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass Cover Glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).

Comments

14 Comments

  1. can't view videos?? firefox latest plugins???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2007 - 10:33 PM
  2. Hi Ron. I am sorry you are having trouble. To view videos, please make sure that you have the latest version of Flash installed. If you still have problems, please send us an email to support@jove.com with operating system and browser information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2007 - 12:48 AM
  3. What protocol do you use when making the PLL solution? 5mg of PLL to 50ml water?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 7, 2008 - 2:47 PM
  4. Hi Lee T
    We dissolve the PLL in borate buffer
    1.²4 g of boric acid and 1.9 g of sodium tetraborate is added to 300 ml of nanopure water (final volume will be 400 ml) and stirred to disolve for about 30 minutes.  Next the pH is adjusted to pH 8.5.  ²00 mg of PLL is added and stirred until disolved.  The final volume is adjusted to 400 ml.  The PLL solution is then sterile filtered and aliquoted into sterile 50 ml tubes in a tissure cutlure hood.  Aliquots are stored at -²0C until use.
    Joseph Harris

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2008 - 5:57 PM
  5. Just wanted to let everyone know a company is forming to make, sell, and distribute the devices. Email xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:01 PM
  6. Hi there, it it possible to get a protocol for fixation and staining of neurons in microfluidic chambers? Which method is better for this purpose (fixation and staining), plasma- or non-plasma bonding? Is it possible to remove the microfluidic device without damaging the neurons or dŒs it have to stay on during the procedure? By the way: A really impressive method, fantastic! Looking forward to your answer. Best, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 2:32 PM
  7. Hello Harry Probably the best thing would be for you to check out our company website at http://xonamicrofluidics.com/ We have a protocol there available for download.  It gŒs over staining in the device. Also, if you would like to discuss staining in more detail or have any other questions feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:46 AM
  8. Hi Harry just to follow up.. The device dŒs not have to be removed for staining. However, if you are interested in visualizing in the mid-region of the grooves then it might not stain very well with the device on.  If you only want to visualize neurons in the main channels or axons just entering or leaving the grooves then staining with the device on is just fine. If you want to get a good stain of the middle of the microgroove region then it is best to remove the device before staining.  This means non-plasma bonding will have to be done as plasma bonding is irreversible. Yes, removing the device can and dŒs damage the neurons.  However, done with care and after some practice it is possible to remove the device and keep most of the sample intact. Some researchers like to fix the cells in the device, place the device on ice for 5 minutes then carefully remove it.  Others just remove the device as carefully as possible prior to staining. Please visit our website http://xonamicrofluidics.com/ for our detailed protocol. Also feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:55 AM
  9. Hello JŒ, thank you very much for your reply and support. The protocol on http://xonamicrofluidics.com/ which you are refering to is indeed very detailed and helpful. I am now curious to see how my experiments work out. :-) All the best and thanks again, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2008 - 5:59 PM
  10. This probably dŒsn't work for non-plasma PDMS-PDMS bonding... or, is there a way to treat one of the PDMS layers as glass?

    Reply
    Posted by: Bryn G.
    September 23, 2009 - 8:05 PM
  11. Hello,

    This was a very good video indeed. Could you please let me know how did you make the wells on the PDMS. They are not micronsized wells that we used to make by replicating form a potolithographed Silicon wafer. Did you use some kind of belt puncher? What is the exact product number and brand of the puncher? I use one to make mm sized well on the PDMS slam, however the edges are not good. Or did you use other technique to make such nicely sheped wells? If I want to make recangular or square shaped wells (² mm length/width and .5-1.0 mm height) on PDMS what could I do? I will appreciate your kind advices.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2012 - 6:39 PM
  12. Hello Taifur

    The wells are 8 mm in diameter. We have special punches machined to punch the wells. However, you can use 8 mm biopsy punches made by Sklar. VWR or Fisher Sci should have them.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    April 6, 2012 - 12:48 PM
  13. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:08 PM
  14. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:10 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics