マイクロ流体デバイスの低コスト作製のためのPDMSの非プラズマボンディング

Biology
 

Summary

このビデオでは、プラズマの結合なしニューロンマイクロ流体デバイスを使用する方法を示します。

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Harris, J., Lee, H., Vahidi, B., Tu, C., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (9), e410, doi:10.3791/410 (2007).

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Abstract

このビデオでは、我々はプラズマ接合することなくニューロンマイクロ流体デバイスを使用する方法を示します。いくつかのケースでは、コーニング第1カバーガラスへの可逆的結合デバイスに望ましいかもしれない。これは利用できないプラズマクリーナーに、おそらく、原因である可能性があります。それは神経細胞がデバイスで染色することができるので、免疫染色のためにデバイスを削除する必要がないのに他の例では、それは、顕微鏡の特定の型の場合や、免疫染色のための神経細胞の培養の後にガラスからデバイスを削除することが望ましい場合があります。一部の研究者は、しかし、それでもデバイスを削除することを好む。このケースでは、カバーガラスへのデバイスの可逆的結合は、それが可能になります。シールのようにタイトではないが形成されその内のデバイスの非血漿結合にはいくつかの短所があります。いくつかのケースでは軸索は、溝の下ではなく、それらを通して成長することがあります。また、ガラスとPDMSは疎水性であるため、液体は容易にデバイスにメディアや他の試薬を強制的に常にそれが必要なことデバイスを入力しないでください。液体は毛管現象を介してデバイスに入力されますが、プラズマ結合をされているデバイスと比較して、それはかなり時間がかかります。プラズマクリーナーは、数秒以内にボンディングした後、デバイスを介して液体の流れを促進ガラスやデバイス上で一時的な親水性の電荷を作成します。非プラズマ結合デバイスの場合、デバイスを介して液体の流れには数分かかります。プラズマクリーナーは、それらを殺菌するため、プラズマ処理装置は使用前に滅菌する必要がないのに対し、最初に滅菌する必要があるデバイスは、非プラズマ貼り合わせで使用することに注意することも重要です。

Protocol

ニューロンの細胞培養用マイ​​クロ流体デバイスの準備

1)クリーンコーニング第2​​4ミリメートル× 40 mmのスライドガラス

  • 30分間水浴の超音波処理のスライドガラスを超音波で分解する
  • 70%エタノールでガラススライドをすすぐ
  • ウォッシュはのdH 2 Oで三回スライド
  • 望ましい一晩数時間のための組織培養フード、のドライスライド

注:我々はスライドを使ってロードされる特殊な金属のトレイを持っている。スライドを個別に分離し、この金属製のラックのスロットに配置されます。我々は、我々は、水で埋めることにガラス皿、水浴の超音波処理の場所にトレイをロードするこれらの金属を配置し、30分間超音波処理することができます。その後の洗浄は、この皿の中で行われている。

2)PDMSデバイスを準備する

  • それを、シリコンウエハからPDMSモールドを切り取るPDSMキャストのパンチ穴と四半期
  • 最初にそれらを介して不活性ガス(アルゴンまたは窒素)を吹き込むことでPDMSデバイスを清掃してください。その後、残りの破片をリフトオフ3Mスコッチブランド471テープを使用してください

注:デバイスを表向きに保つことが重要です。当初は、我々はシリコンウエハから離れてPDMSをカットするときに、ウェハに接触する側は、クリーンな側である:それは、マイクロ流体チャネルが含まれています。我々はプラズマボンディングのための準備が整うまで私達がようにデバイスを損傷し、きれいな側面を維持できないためにできる限り慎重にしてみてください。

  • プラスチック容器のオートクレーブ装置
  • オートクレーブ後、クリーンな1号コーニングのスライドガラスとHarrickブランドプラズマクリーナー、使用してプラズマトリートデバイスwww.harrickplasma.comを
  • デバイスは、スライドガラス上側を下に清潔な場所。

デバイスはスライドガラスに結合プラズマです。

3)コーティングポリL -リジン(PLL)を持つデバイス

  • PLLは、デバイスの各サイドにウエルに添加して、次の井戸に流れるように許可されています

大井戸と小さな井戸では30μリットルPLLのPLLの=>150μlの 。それは、長い井戸が一杯なので正確である必要はありません。

注:デバイスを確認すると、4ウェルが表示されます:それぞれ2つが接続されています。あなたはよくので、次のウェルに、デバイスを流れることに一つにPLLを置きたいと思う。

  • PLLは、約10分間、デバイスを流れるし、それらを埋めるために井戸に多くのPLL追加することができます
  • (一晩が望ましい)4時間の最小値を37℃でインキュベーターでPLLを含むデバイスを配置
  • 治療後に過剰なPLLを掃除しますが、デバイスからすべての液体を吸引しないように注意してください

注:チャネルまたはチャンバーに気泡を導入したくない。ちょうど井戸の過剰なPLLを掃除。

  • 装置の両側に各ウェルにオートクレーブのdH 2 Oを追加し、毛細管現象により、他のウエルに流れることを可能に

図1は、マイクロ流体デバイスの模式図である。ブルー(相馬側)が接続されている様子がわかりますし、赤は(軸索側)に接続されています。我々はデバイスの各サイドにもいずれかPLL、または水やメディアを、置くと言うとき、我々は何を意味するか、例えば、ですの注意:オートクレーブDHの一つブルーウェルし、正しい位置を150μlのオートクレーブのdH 2 O中の150μlをまあ1つのRedに2 0。水(またはPLL、またはメディア、またはセル)は、他の対応するウェルにデバイスを介して流れることになる。

図1

図1

注:今から、私は"場所のメディア、細胞、水またはPLLがTOP井戸で"と言うと、私は相馬の左にある場所を上の図を参考にしていますし、軸索はに成長する、注意してください右側。

  • 水を(再び完全にデバイスからすべての液体を除去しないように注意しながら)オフ吸引、その後も接続されている各のいずれかにオートクレーブのdH 2 O中の別の150μlを追加し、対応するウェルに流れるよう。
  • 37℃インキュベーターでのdH 2 Oを含むデバイスを配置° Cで1時間、その後再び洗浄ステップを繰り返します。合計である一時間ごとのdH 2 Oでデバイスを3回洗浄する。

注:PLLからのホウ酸塩は、PDMSに吸収することができる、チョン研究室のいくつかは私のカップルの後にオートクレーブのdH 2 Oで一晩デバイスをインキュベート推奨されている可能性があるためnitial迅速なリンス。これは、すべて無料のホウ酸塩は細胞の読み込み前にPDMSから浸出されることを保証します。これが行われない場合、細胞毒性につながる可能性が時間の経過とともに、メディアへのホウ酸塩の放出、があるかもしれません。

  • トップウェルに必要な要因(グルタミン、B27、PenStrep)とニューラル基礎培地(NBM)を追加

注:デバイスが一晩と翌日の細胞とメッキインキュベート、または細胞を播種する前にNMB +要因で3時間の最小値をインキュベートすることができます。

デバイスにロードするのニューロンの準備

我々はどちら脳ビットまたは私たちのためにキャンパスでここに準備されるという会社から購入することが18日間の古い胎児ラットの大脳皮質を使用してください。我々は、組織が、新鮮な取得することを好む。

  1. HibernateはEに格納される1胎児の脳の皮質(組織の2個)を入手する
  2. 3つの長いガラスピペットを取ると、アルコールランプを使用して連続的に小さなサイズにそれらをそれぞれ起動
  3. 滅菌15 mlのチューブにNMB +要因の2mlのガラスピペットと場所で、HibernateのEから採取した組織を削除します。
  4. 粉砕:皮質は約5〜10回上下に渡されたとされる電球とガラスピペットを使用する。その後、次に小さいピペットは、組織の上下にピペッティングとするために使用されます。最後に、最小のピペットは、組織の上下にピペッティングとするために使用されます。私たちは、目に見える塊がないことを確認したい。

    注:最近、チョンラボは、当初50%に0.125%トリプシンで処理組織から調製された細胞にHibernateがEに保存されている組織からの細胞を比較し始めたのCa + +フリーおよびMg + +無料の解剖バッファー。コンセンサスは、トリプシンはすぐに組織を使用する予定がない場合は、その後、休止状態E.で組織を格納する必要があるHibernateのE.に最初に置かれた組織よりも多くの生細胞を得る使用して調製したもの組織です

    すぐにティッシュを使おうとしていると増加する可能性をご希望の場合は次のように、その後、前の機械的粉砕にトリプシンと組織を扱う:1)Ca + +のフリーMg + +のフリーの1mlで1ミリリットル0.25%トリプシン(Gibco社、Invitrogen)を希釈解剖のバッファは、15 mlのチューブ(氷の寒さを保つ)に(最後のトリプシン= 0.125%)、2)場所バッファ内の組織と8分37℃で直ちに培養、3)を停止する10ミリリットルDMEM/10%FBSを追加するトリプシンの反応と、下記のプロトコールを続ける。

  5. 1分間1100 rpmで遠心細胞
  6. 慎重に細胞ペレットを吸引メディア
  7. ピペッティングしてペレットと再懸それにNMB +要因の1 mlを添加し、ダウン
  8. (BDファルコンセルストレーナー40 UMナイロン)し、細胞塊を除去するフィルタを介して重力流によって再懸濁した細胞を渡す
  9. 数とプレートの細胞:
    • マイクロ遠心チューブに、60μlのNMBを追加する+要因は、細胞懸濁液20μl、およびトリパンブルー液20μlにして混ぜる
    • 血球計算板にこのソリューションの約10μlを加え、生細胞を(ではない青)カウント
    • 2.5に濃度を調整します- 4.5 × 10 6細胞/ ml

      注:我々は一般的に約2.5の濃度を得る- 4.5 × 106細胞/ mlを。ボリュームに応じて細胞が(通常は1ミリリットルNBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex)に再懸濁する。組織をトリプシンを用いて調製されている場合、収量は可能性が増加します。

デバイスのめっき

  1. デバイスの1つのウェルに細胞を(一次ニューロン)を読み込みます
  2. プレート小さなデバイスあたり5μlと大きなデバイスあたり20μlの

    注:トップソマリ族も(トップソマリ族の5μlをウェルに装置の上部と装置の底部(半数ボリューム)上に10μlの上に細胞を10μl、または直接のすべてのセル20μlをロードすることができます小型デバイス用)。

  3. 37℃インキュベーターで10分間インキュベートするので、細胞は、アタッチを開始することができます
  4. よくデバイスのサイズに応じてそれぞれにNMB +要因の約30分の150μlを加え

    注:ボリュームは、PDMSの厚さによって異なります。大切なことは、井戸が一杯であるということです。

プラズマボンディングなしでデバイスを使用する方法の補足

プラズマなしで毎週成功し、それを行うプラズマ処理し、クリスティーナ火、技術者、なしで、ちょうどすぐに細胞をロードするために述べています。

ソーマ側の両方の井戸(あなたのメディアを残す場合、軸索側は関係ないでしょう)からメディアを削除してください。それは細胞が主要なチャネルを入力するための流体の流れです。あなたが井戸内のメディアがあれば、流体の流れを取得することはありません。

Discussion

ここでは、プラズマクリーナーを必要とせずにニューロンマイクロ流体デバイスを使用する方法を示しました。我々はこのような非プラズマボンディングを参照してください。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent Dow Corning Sylgard 184 with curing agent Please consult Dow Corning to find a vendor near you
Cornig No. 1 Cover Glass Cover Glass Corning Corning No. X2935 244 Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
60 mm Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-757-13A 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
Poly-L-Lysine Reagent Sigma-Aldrich P-1274
BD Falcon 50 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352098 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C

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References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, (4), 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 599-605 (2005).

Comments

14 Comments

  1. can't view videos?? firefox latest plugins???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 4, 2007 - 10:33 PM
  2. Hi Ron. I am sorry you are having trouble. To view videos, please make sure that you have the latest version of Flash installed. If you still have problems, please send us an email to support@jove.com with operating system and browser information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 5, 2007 - 12:48 AM
  3. What protocol do you use when making the PLL solution? 5mg of PLL to 50ml water?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 7, 2008 - 2:47 PM
  4. Hi Lee T
    We dissolve the PLL in borate buffer
    1.²4 g of boric acid and 1.9 g of sodium tetraborate is added to 300 ml of nanopure water (final volume will be 400 ml) and stirred to disolve for about 30 minutes.  Next the pH is adjusted to pH 8.5.  ²00 mg of PLL is added and stirred until disolved.  The final volume is adjusted to 400 ml.  The PLL solution is then sterile filtered and aliquoted into sterile 50 ml tubes in a tissure cutlure hood.  Aliquots are stored at -²0C until use.
    Joseph Harris

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 7, 2008 - 5:57 PM
  5. Just wanted to let everyone know a company is forming to make, sell, and distribute the devices. Email xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:01 PM
  6. Hi there, it it possible to get a protocol for fixation and staining of neurons in microfluidic chambers? Which method is better for this purpose (fixation and staining), plasma- or non-plasma bonding? Is it possible to remove the microfluidic device without damaging the neurons or dŒs it have to stay on during the procedure? By the way: A really impressive method, fantastic! Looking forward to your answer. Best, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 6, 2008 - 2:32 PM
  7. Hello Harry Probably the best thing would be for you to check out our company website at http://xonamicrofluidics.com/ We have a protocol there available for download.  It gŒs over staining in the device. Also, if you would like to discuss staining in more detail or have any other questions feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:46 AM
  8. Hi Harry just to follow up.. The device dŒs not have to be removed for staining. However, if you are interested in visualizing in the mid-region of the grooves then it might not stain very well with the device on.  If you only want to visualize neurons in the main channels or axons just entering or leaving the grooves then staining with the device on is just fine. If you want to get a good stain of the middle of the microgroove region then it is best to remove the device before staining.  This means non-plasma bonding will have to be done as plasma bonding is irreversible. Yes, removing the device can and dŒs damage the neurons.  However, done with care and after some practice it is possible to remove the device and keep most of the sample intact. Some researchers like to fix the cells in the device, place the device on ice for 5 minutes then carefully remove it.  Others just remove the device as carefully as possible prior to staining. Please visit our website http://xonamicrofluidics.com/ for our detailed protocol. Also feel free to email us xonamicrofluidics@gmail.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 4:55 AM
  9. Hello JŒ, thank you very much for your reply and support. The protocol on http://xonamicrofluidics.com/ which you are refering to is indeed very detailed and helpful. I am now curious to see how my experiments work out. :-) All the best and thanks again, Harry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 11, 2008 - 5:59 PM
  10. This probably dŒsn't work for non-plasma PDMS-PDMS bonding... or, is there a way to treat one of the PDMS layers as glass?

    Reply
    Posted by: Bryn G.
    September 23, 2009 - 8:05 PM
  11. Hello,

    This was a very good video indeed. Could you please let me know how did you make the wells on the PDMS. They are not micronsized wells that we used to make by replicating form a potolithographed Silicon wafer. Did you use some kind of belt puncher? What is the exact product number and brand of the puncher? I use one to make mm sized well on the PDMS slam, however the edges are not good. Or did you use other technique to make such nicely sheped wells? If I want to make recangular or square shaped wells (² mm length/width and .5-1.0 mm height) on PDMS what could I do? I will appreciate your kind advices.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2012 - 6:39 PM
  12. Hello Taifur

    The wells are 8 mm in diameter. We have special punches machined to punch the wells. However, you can use 8 mm biopsy punches made by Sklar. VWR or Fisher Sci should have them.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    April 6, 2012 - 12:48 PM
  13. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:08 PM
  14. For the cells you receive in Hibernate E from Brain Bits, do you digest them with trypsin or even digest them at all prior to trituration. Why or why not?

    Thanks.

    Reply
    Posted by: Angela D.
    July 4, 2012 - 10:10 PM

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