促进药物发现:斑马鱼在一个自动化的高含量检测炎症

Immunology and Infection
 

Summary

在这里,我们描述了一种新型的高含量化学诱导的炎症检测,在免疫调节生物活性鉴定。我们已经成功地结合自动显微镜定制开发的软件,使量化的炎症反应以及进一步的数据处理,分析,挖掘,和存储的自动化脚本。

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Wittmann, C., Reischl, M., Shah, A. H., Mikut, R., Liebel, U., Grabher, C. Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish. J. Vis. Exp. (65), e4203, doi:10.3791/4203 (2012).

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Abstract

斑马鱼幼虫是整个动物特别适合小分子由于其体积小,相对容易操作和观察,以及化合物可以简单地被加入到洗澡水和易被人体吸收,在屏幕1,2 <1%DMSO溶液。由于斑马鱼幼虫和白细胞中表达荧光蛋白的转基因株系的可用性的光学清晰度,斑马鱼体内的一种急性炎症反应的监测提供的独特优势。因此,利用斑马鱼为高含量的小分子,在免疫调节化合物的高通量鉴定屏幕已经提出3-6,表明炎症诱导的情况下,如鱼翅组织本地化的刻痕,蛋黄表面的激光损伤胚胎尾翼截肢3,5,6。然而,这些方法的主要缺点是幼虫操纵手册的要求,促使伤人,从而防止高通量筛选。化学诱导的炎症(下巴)检测8介绍消除这些障碍。由于伤人是造成化学可以同时处理的胚胎数量几乎是无限的。临时处理的与硫酸铜斑马鱼幼虫的侧线系统和快速粒招募受伤neuromasts的结果毛细胞选择性诱导细胞死亡。随后的炎症反应,可以实时通过复合基因cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9斑马鱼幼虫,表达了绿色荧光蛋白在神经丘细胞,以及红色荧光蛋白标记粒。

为了制定筛查策略,将使高含量和高通量分析,我们介绍了机器人的液体处理和综合自动化MICRoscopy与自定义开发的软件脚本。这个脚本可以自动量化得分%面积的红色荧光白细胞占领周边受伤绿色荧光neuromasts的的经验定义的面积内的炎症反应。此外,自动数据处理,处理,可视化,存储的基础上开发的MATLAB和Python脚本定制。

总之,我们引进一个自动化的HC / HT屏幕测试化合物,允许其对粒细胞炎症反应的启动,进展或决议的影响。该协议提供一个很好的起点,为更深入地分析药物的机制和途径,参与先天免疫反应的编排。在未来,它可以帮助确定不能容忍的有毒或脱靶药物发现的早期阶段的影响,从而降低药物开发的程序上的风险和成本。

Protocol

1。动物处理

为下巴实验使用3 DPF幼虫从组纯合的转基因双cldnB :: GFP的/ lysC :: DsRED2AB型 (野生型)鱼交配,产生的。收集自然产卵胚胎,并提高他们在29°C在E3的介质(5 mM氯化钠,氯化钾0.17毫米,0.33毫米氯化钙硫酸镁 0.33毫米,0.1%亚甲蓝,平衡pH值7.0),在培养皿中。关键是要保持不超过每盘50-70胚胎密度。

2。幼虫排序

根据荧光立体检查所有幼虫荧光记者表达的,自发的炎症和适当的年龄相关的发展。

3。筛选培养基的制备(始终准备好新鲜)

准备不辅以DMSO(最后1%)和MS222(0.05克/升)的亚甲蓝E3中。

4。硫酸铜准备(始终准备好新鲜)

首先掂量出硫酸铜(M R =159.6克/摩尔),并准备了20毫米原液DH 2 O。准备120微米硫酸铜工作在E3/DMSO(1%)/ MS-222解决方案(从20 mm原液)。保护光硫酸铜溶液。

5。 384孔板上下游(格雷纳384微孔板)

预反向移液器每孔加入20μLE3/DMSO(1%)/ MS-222。枪头缸径增加,需要仔细处理,没有造成任何伤人的胚胎,这是由切割2毫米口径的一角。传输介质,在74μL单幼虫,每孔(84μL)未经处理的控制。如果有必要,在卧位东方幼虫在井使用一个灵活的Eppendorf Microloader枪头(Eppendorf公司; 5242 956.003)。

机器人液体进行液体处理步骤处理工作站,以确保所有的幼虫同时治疗。

6。药物治疗

吸取了混合药物股板块中的化合物的5倍。每孔加入16μl7.5X药物股板块的和混合的5倍。调整尖内水井的位置,防止幼虫的伤害,并免除在10μL/ s的介质。混合介质井的4倍,以确保药物均匀分布在井。

7。孵化

筛选板孵育1小时,在29°C间用铝箔覆盖,避免光线的化合物,以及硫酸铜

8。化工伤人

除了 ​​阴性对照组,混合4倍,每口井120微米硫酸铜溶液加入10微升,再次孵育1小时29°C。

9。洗涤

删除和我交换80μL dium从每个井的两倍(20μL的步骤)删除化合物和硫酸铜

10。图像采集

自动显微镜倒置(即:奥林巴斯扫描^ R)的图像采集开始90分钟后,初始铜治疗。设置初始Z-级,使左,右后外侧线neuromasts可见。图片每一次每小时渠道明,Cy3和GFP 4焦平面(50微米的距离)使用4倍的目标(,NA = 0.13)。

应要求提供额外的信息,图像和数据处理。

11。影像处理

1。数据整理

RAW图像处理与我们自定义的LabVIEW软件脚本。在图像处理管道的第一个操作是排序显微镜产生的数据通道,以及时间点的信息的文件夹中的原始图像。

ove_step“> 2。扩展的重点

随后,该软件创建扩展为每个通道从4焦平面聚焦图像。

3。 RGB-覆盖

在最后一步,从3个通道的扩展聚焦图像合并,导致最终的RGB叠加图像。

4。自动神经丘检测

一个模式识别工具(LabView的快速IA原型工具)标识内的RGB叠加图像neuromasts和创建经验的兴趣周围neuromasts定义面积。

5。量化

红色荧光白细胞(反映为红色像素)内的利息周围受伤neuromasts的的经验定义的区域都取得了主要 L eukocytes(Paol) p ercent 1 REAØccupied读数。在平均95.27±2.11%(FDA1)和95.12±井(幼虫)(1.56%FDA2)已正确检测并随后受到进一步的数据处理。原始数据输出(Paol为每个检测到的神经丘)被储存在一个txt文件,并作为进一步处理的原始数据的MATLAB脚本的数据输入。

12。数据处理

1。IMAPS

评估个别实验的颜色代码中的原始数据输出Paol图形可视化的成功,可以实现所谓的炎症地图(IMAPS)( 图2)。明亮的绿色反映了较高的初始炎症指数,黑色表示没有炎症。这种快速概览,允许失败的实验,然后可以排除进一步的数据分析的快速识别。

2。平均控制

每个实验板包含320化合物,反映了单个数据点每化合物和时间点以及32个阳性和阴性对照,分别。 32控制重复的平均值和标准偏差的计算。为控制的只有2个标准差之内的数据点都包括在内。

3。正常化

正常化是通过电子表格分析。二甲基亚砜的平均值,作为阴性对照,设置为0,和最高的铜控制的的平均Paol是设置为1,因此,阳性和阴性对照之间的最大区别是设置为1。每个化合物的Paol,是线性插值或外推到各自的实验板控制。

4。最后读出:炎症指数

后已进行了足够的重复实验(即15),平均归重复实验的原始数据,导致在最后读出 - 炎症索引。铜控制炎症的初始指数开始在100%的时间点零和相关图像采集开始时间(90分钟后,初始铜处理)。

5。单调的指数回归拟合

由于解决炎症随着时间的推移,我们对所使用的初始炎症执行单调指数非线性回归拟合式(1) - 0是在t = 0的初始响应的措施,有关斜坡的幅度随着时间的推移。

6。特征空间的2-D图( 图4)

要生成的功能空间,非线性回归应用于集群分析划分为特征区域的功能空间,从而从不同的免疫调节类有趣的候选人自动识别(反-inflammat的存储器,反决议,亲炎症,有利于决议)。基于参数01的2-D图形显示在所有化合物。

13。数据处理和存储

我们的数据处理例程创建网页,可视化和代表等药物屏幕,提供了图像的快速概览和数据处理步骤的结果,以及详细视图时,要求用户10。软链接到其他相关的异构生物和化学数据库集成,以及提供了宝贵的资源比较和新颖的研究11。通过这些例程,设置适当的数据标准和元信息这一数据的长期存储。

14。代表结果

在试点屏幕上,我们分析了库,包括640 FDA批准启动,进展或决议的麻粒的影响,被称为生物活性化合物ocytic炎症反应。基于我们分为4种类型的免疫调节表型,可能预示不同的行动模式的观测效果:消炎(1),反决议(2),(3)促炎症和亲的决议(4) ,这可以用参数01,非单调线性回归拟合(ËAO + ALX - )产生描述对初始炎症。一个0代表的炎症反应的程度,而1曲线斜率的特点,从而说明炎症决议。一个2-D的功能空间图(01)中显示所有的化合物,可以从不同的免疫调节类击中候选人( 图3)的自动识别。

45出640种减少到50%或更少的初始炎症指数产生显着的抗炎作用。内氏s个分类,我们发现了6个化合物属于药物类的非甾体类消炎药(NSAIDs),证实了我们的方法的有效性,。然而,NSAIDs的排名当中最有力的消炎药。除了从非甾体抗炎药,我们发现了一些额外的药理类药物,如例如血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARBs),抗生素和质子泵抑制剂。

7个化合物符合为潜在亲分辨率药物的经验定义的阈值标准。

18药物产生了亲消炎作用,在夸张白细胞招聘相比,阳性对照受伤neuromasts。

只有2种化合物,阻止炎症反应的及时解决。

几个候选命中消炎作用(模范候选人从上述药理类药物)从试点屏幕可以变成ð被证实在随后的二次下巴检测(数据未显示)的剂量依赖性。 4个潜在的亲分辨率药物复验未确认的行动施加在主屏幕的指示模式。 2药物在高浓度(20μM)轻微消炎潜力。第三个药物具有非剂量依赖性药物浓度范围从5边际消炎作用 - 20微米。第四药物有没有炎症反应的影响,在测试浓度。

图1
图1。下巴检测工作流程。个人复合基因cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2幼虫(3 DPF)手动分布在384孔板。药物被同时添加到每口井使用西风紧凑型液体处理工作站。检测板孵育1小时,在29°C。 硫酸铜治疗

图2
图2。原始图像。概述图片的数字显示原始图像的4焦平面(Z = 0, - 3)在渠道Cy3标记(左)和GFP(右),分别为50微米的距离。箭头(z = 1,2)表示的模范neuromasts,箭镞在neuromasts周围聚集白细胞(z = 1,2)点。

图3
图3。炎症地图(IMAPS)个别实验的成功可以反映炎症反应的颜色代码(原始数据)IMAPS评估明亮的绿色,体现了高初始infla mmatory响应;黑色表示没有炎症,时间点0(左)和时间点5(右)IMAPS清楚地表明,实验是否应包括在进一步的数据处理。铜对照组(13和24行)显示在深浅不一的绿色,而,二甲基亚砜控制井(1和12行)出现暗绿色或黑色。在时间点5,炎症几乎是解决铜的控制,现在的绿色或黑色的暗色调。 点击这里查看大图

图4
图4。 2维特征空间320 FDA的化合物情节批准库和各自的控制。所有化合物井可以在基于01的参数,从一个非线形产生的2-D的特征空间图显示回归拟合(d/4203/4203eq1.jpg“ALT =”公式1“/>对初步炎症)。此功能空间图允许自动识别属于以下4种免疫调节类药物可能指示一个有趣的候选人消炎“的行动模式:(1),抗决议(2),(3)促炎症和亲的决议(4) 点击这里查看大图

Discussion

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl sulphoxide Carl Roth GmbH Co KG A994.2
Copper(II) sulphate anhydrous Carl Roth GmbH Co KG PO23.1
FDA approved drug library Enzo Life Sciences BML-2841-0100
384 microwell plate Non-binding, μClear Greiner 781906 black
Olympus scan^R Olympus
Zephyr Compact Liquid Handling Workstation Caliper

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References

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