패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Published 9/14/2012
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Biology

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Summary

압축시키는 것 / 확장시키는 반응 (압력 myography를 사용하여)의 측정 병렬 절연 동맥 근세포 (패치가 el​​ectrophysiological 기술 클램프 사용)에서 Kv7 (KCNQ) 칼륨 채널 활동의 측정은 혈관 평활근의 생리학에 Kv7 채널의 역할에 대한 중요한 정보를 공개 할 수 있습니다 약리학.

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Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

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Abstract

저항 동맥의 벽 내의 평활근 세포의 수축이나 이완이 동맥 직경을 결정함으로써 혈관을 혈액의 흐름을 제어하고 조직 혈압에 기여한다. 수축 과정은 주로 이온 수송 및 채널의 다양한 의해 제어 차례에 cytosolic 칼슘 농도 ([칼슘 2 +] cyt)에 의해 조절된다. 이온 채널은 혈관 수축 또는 vasodilation에 영향을 미치도록 vasoactive 호르몬에 의해 활성화 신호 전달 경로의 일반적인 중간체 있습니다. 그리고 이온 채널은 종종 두 의도적으로 치료 대리인 또는 실수 (원치 않는 심장 혈관 부작용을 유발하는 등) (예 : 칼슘 채널 차단제가 vasodilation과 낮은 혈압을 유도하기 위해 사용)에 의해 타겟팅 할 수 있습니다.

Kv7 (KCNQ) 전압 활성화 칼륨 채널은 최근에 중요한 생리 및 치료 targ으로 연루되어있다부드러운 근육 수축의 조절을위한 ETS. 생리적 신호 전달 모두와 치료 대리인의 행동에 Kv7 채널의 특정 역할을 명료하게하다하기 위해, 우리는뿐만 아니라 그대로 동​​맥의 맥락에서의 공헌을 평가로서 활동이 세포 수준에서 조절이 얼마나 공부를해야합니다.

쥐 창 자간 막 동맥 유용한 모델 시스템을 제공합니다. 동맥은 쉽게 해부하는 결합 조직의 청소 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 격리 된 동맥 근세포를 준비하는 데 사용하거나, cannulated 상대적으로 생리적 조건 하에서 혈관 수축 제라 / vasodilator 응답 측정을 위해 가압 될 수 있습니다. 여기 측정의 두 가지 유형에 사용되는 방법을 설명하고 실험 디자인 혈관 톤의 규정에 이러한 이온 채널의 역할을 명확하게 이해를 제공하기 위해 통합 될 수있는 방법의 예를 제공합니다.

Protocol

1. 작은 창자 장간막 혈관 아케이드의 외과 절단

  1. 흡입에 의해 관리 isoflurane과 300-400g Sprague-Dawley 쥐 (4 %)를 마취.
  2. 작은 창자 장간막을 표시 할 수있는 중간 선 개복술을 수행합니다. 노출 된 장과 장간막에 외상을 방지하기 위해 세심한주의와 복부 절개를 통해 크고 작은 창자를 외면 화하다. 부드럽게 멸균 거즈 위에 장간막을 좋아합니다.
  3. 수술 절제 맹장 (주의 여백을 따라 동맥 / 정맥 장간막의 주요 지점에서 기원에서 잘라내 혈관)을 포함하여 작은 창자와 큰 창자의 일부.
  4. 얼음 차가운 해부 솔루션 (표 1)이 포함 된 비커에 excised 조직을 전송합니다.
  5. 마취하에 동안 소장의 절단 후, 쥐가 편안하게 euthanized해야합니다.

2. 해부동맥의 D 청소

  1. 냉각 해부 챔버에 excised 장 및 장간막 아케이드 전송 (를 4-5 ° C) 박리 솔루션을 포함. 챔버은 해부 핀을 수용 할 수있는 SYLGARD 184 엘라스토머 기반으로 100 mm 유리 페트리 접시로 구성되어, 페트리 접시는 순환 물 목욕으로 4-5 ° C로 유지되는 냉각베이스에 배치됩니다.
  2. 외과 가위를 사용하면 전체 소장의 아웃 약 10-12센티미터 세그먼트를 잘라. 그 vasculature 첨부 유지 장 세그먼트의 각 끝 부분에 잘라하고 고립에서의 첨부 vasculature (창 자간 막 아케이드)와 하나의 세그먼트를 떠나지 챔버에서 사용하지 않는 장을 제거합니다.
  3. 동맥 / 정맥 장간막의 주요 지점이 중심 (그림 1)에서 센터와 지점의 방출의 후속 명령에 있는지 등의 챔버의 가까운 쪽 위에 장간막을 전파, 소장의 세그먼트를 핀. PL 에이스 만 장 세그먼트 (안 혈관)에 핀.
  4. 오히려 정맥에서 본 U 자 모양의 가지보다는 상대적으로 밝은 붉은 색, 두꺼운 벽과 특성 V 자형 가지에 의해 정맥에서 동맥을 구분합니다.
  5. 가까운 마이크로 포셉 및 가위를 사용하여 내장 (그림 1의 점선 동그라미) 4 번째 주문 동맥 - 조심스럽게 지방 조직과 2 차를 둘러싼 결합 조직을 취소 조명 해부 현미경을 통해 시각화. 인접한 정맥을 개최하는 것은 지방 조직과 결합 조직을 삭제 용이하게한다. 불필요한 동맥의 스트레칭을 피하십시오.
  6. 결합 조직에서 벗어날 창 자간 막 동맥 세그먼트는 아웃 한 다음 해부 및 세포 분리에 사용 (단일 셀 패치 클램프 연구, 제 3-4) 또는 압력 myography (제 5 항)에 cannulated 할 수 있습니다. 보통 최대 길이는 1cm까지, 분기 지점 사이의 세그먼트를 잘라.
패치 클램프 연구 jove_title "> 3. 셀 절연

  1. 절연 솔루션의 0.5 L (표 1)을 준비하고 pH를 조정하기 전에 두 부분으로 나눕니다. 첫 번째 부분 (보통 100 ML)가 37 예열해야 ° C와 산도가 37 7.2로 조정해야 ° C (37 ° C 절연 솔루션). 절연 솔루션의 두 번째 부분은 ° C와 산도은 4 ° C (얼음 냉 절연 솔루션)에서 7.2로 조정한다 4 냉각해야합니다. 산도 조정 후, 두 솔루션의 osmolarity는 D-글루코오스 또는 H 2 O.의 적절한 금액을 추가하여 mOsm를 298 조정 할합니다
  2. 이 37 ML ° 단계 3.4에서 사용하기위한 37 ° C에서 유리관과 부화 C 절연 솔루션입니다.를 전송 37 10 ML에 (BSA) 소 혈청 알부민의 20 밀리그램을 추가 ° C 절연 솔루션, 용해, 37에 다시 따뜻한 ° C 및 7.2에 pH를 다시​​ 조정. 이 솔루션 2 ML 4 MG collagenase 유형 VIII을 (시그마, 롯 089K8612 추가 633 Units / MG의 Collagenase 활동, 285 단위 / MG의 Caseinase 활동, 1.6 단위 / MG Clostripain 활동), 0.64 밀리그램 엘라 스타 제 유형 IV는 (시그마, 롯 110M7025V 5.9 단위 / MG, 37 준비 16 MG / ML 주식의 40 μl를 추가합니다 ° C 절연 솔루션) 1 2 μl M DL-dithiothreitol (DTT 시그마), 37 미리 따뜻한이 효소 솔루션 ° C 단계 3.5에 대한 준비 인치
  3. 아이스 콜드 절연 솔루션과 얼음의 장소 요리를 2 ML를 포함하는 35 mm 조직 배양 접시에 창 자간 막 동맥로부터 2-3 세그먼트를 전송합니다. 3-4mm 길이의 조각으로 창 자간 막 동맥 세그먼트를 잘라.
  4. 불 광택 팁과 파스퇴르 피펫을 사용하면 (동맥의 손상 방지하기 위해) 사전 예열이 ML 37이 포함 된 유리관 (15 X 45mm, 1 DRAM)에 동맥 세그먼트를 전송 ° 37 번 30 분을위한 C 절연 솔루션 및 품다 ° C.
  5. 30 분 후, 조심스럽게 파스퇴르 피펫을 사용하여 37 ° C 절연 솔루션을 기음, 35 분에서 2 ML 따뜻한 효소 솔루션 및 품다을 추가37 번 ° C.
  6. 바로 효소 솔루션의 35 분 부화 후, 얼음에 병을 배치 효소 솔루션을 기음과 얼음 차가운 절연 솔루션 (반복 흡인와 신선한 아이스 콜드 절연 솔루션의 추가 4 회) 2 ML를 추가합니다. 그런 다음, 아이스 콜드 절연 솔루션 1 ML의 볼륨에 부드럽게 각각의 창 자간 막 동맥 평활근 세포 (MASMCs)를 공개하는 광택 파스퇴르 피펫 평균의 10 배에서 20 배에 동맥 세그먼트를 씹다.
  7. 주기적 35 mm 접시에 세포 현탁액의 한 방울을 배치하고 현미경으로 확인하여 근세포의 모양을 확인합니다. 건강한 MASMCs는 부드러운 가늘고 긴 모양이 있어야합니다. 동맥 벽의의 모든 셀이 출시되지 않습니다. 세포 현탁액은 얼음에 보관해야합니다.
  8. MASMC 건강의 또 다른 유용한 지표는 생리 칼슘 2 + 농도 자신의 관용이다. 목욕 s와 (과) 기록 챔버 (# Bioscience 도구, CSC-25L)를 작성이 MM에게 CaCl 2 (실내 온도 (RT)에서 산도 7.3, 구성에 대한 표 1 참조) 및 위치 한천 다리 (구부러진 유리합니다 (워너 악기, REF 참조 전극 삽입, 2 M KCl에 2 % 한천로 가득 모세 혈관을 포함하는 olution 챔버 내부-3L)). 광택 파스퇴르 피펫 사용하여 녹음 챔버에 약 100-200 μl 세포 현탁액을 전송하고 세포가 15 분을 위해 준수 할 수 있습니다. 손상되지 않은 세포는 2 MM 크게 계약을 체결하지 말아야 CaCl 2 함유 솔루션 (세포의 가늘고 긴 또는 막대 모양으로 나타납니다 공을 반올림하지 않아야 함).
  9. 목욕 솔루션의 0.25 ML 2 음을 포함, 녹음 챔버에 세포 현탁액의 첫 나누어지는을 추가 한 후 CaCl 2는 세포 현탁액의 나머지 볼륨에 추가해야합니다. 이 남아있는 세포 현탁액은 얼음에이 솔루션에 유지되고 최대 6 시간까지에 대한 패치 클램프 녹음에 사용할 수 있습니다.

4.Kv7 칼륨 요즘 나 막 전압을 측정하기 위해 전체 세포 패치 클램프의 사용

  1. 근세포가 기록 챔버 (25 mm 제 1 원형 커버 슬립, 워너 악기)의 유리 기반을 준수 후, 목욕 솔루션 (표 1)의 연속 살포을 시작합니다. Kv1 및 Kv2 가족의 지연 정류기의 칼륨 전류에서 고립 된 Kv7 전류 녹화를 들어, 목욕 솔루션 100 μM GdCl 3 보충해야합니다.
  2. 피펫 풀러와 microforge를 사용하여 붕규산 유리 (Kimax-51, 킴블 체이스)에서 패치 피펫을 제조, 내부 솔루션 (표 1)로 가득 차 때의 저항은 MΩ 4-5 있어야합니다. 코트 SYLGARD 184과 피펫 (팁 위 ~ 1~2밀리미터)의 1 / 3 낮출 수 있습니다.
  3. MASMCs의 Kv7 전류 녹화를 들어, 천공 패치 전체 셀 전압 클램프 기술이 사용되어야합니다. 구멍 패치 구성의 사용 depletio을 방지하는 데 도움이막 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP 2) 이후 빠른 (5 분 이내) 일반적으로 기존의 파열 패치 구성을 사용 관찰 Kv7 전류의 개요의 N. 120 μg / ML Amphotericin B와 내부 솔루션 (표 1) 보충 : 내부 솔루션의 0.5 ML에 Amphotericin B의 2 밀리그램 / ML 주식 3 μl를 (DMSO에서 조리 작은 aliquots에 냉동과 빛으로부터 보호 유지)를 추가합니다. Amphotericin B-무료 내부 솔루션의 피펫 팁을 찍어 한 후 튜브의 조각 (Tygon R-를 통해 연결된 10 ML의 주사기를 사용하여 다른 끝에 흡입을 적용하여 Amphotericin B-무료 내부 솔루션과 패치 피펫의 팁을 기입 3603). 피펫은 약 절반 솔루션으로 가득 될 때까지 Eppendorf Microloader 피펫 팁을 사용하여 위로부터 Amphotericin B-함유 피펫 솔루션을 추가합니다. 부드럽게 피펫을 클릭하여 모든 기포를 제거합니다. 즉시 피펫을 사용합니다.
  4. 에 피펫을 삽입전극 홀더와 길쭉한 myocyte (가까이에 있지만 핵, 그림 2의 상단에있는)의 표면에 피펫을 낮출 micromanipulator를 사용합니다. 피펫의 저항 MΩ 6-10로 증가 할 때, 기가 - 인감 (> 10 GΩ) 달성 흡입을 적용합니다.
  5. 막 천공을 기​​다리는 동안 영 뮤직 비디오에 전압을 가지고 설정합니다. 100 MS 전압 10 뮤직 비디오로 단계 후 -10 뮤직 비디오로 적용 및 빠른 피펫의 용량 과도을 보상하기 위해 앰프를 사용합니다. 전체 셀 용량 과도, 작은 지속적인 긍정적 인 전류 (일반적으로 2-10 PA)의 모습이 동시에이 기능 Kv7 채널의 존재를 나타냅니다.
  6. Amphotericin B와 성공적인 천공는 MΩ 35 이하로 액세스 저항을 줄일 수 있습니다. 현재 녹음 후 -4 MV 보류 전압에서 5 초 전압 단계 프로토콜을 사용하여 시작하실 수 있습니다. 우리는 지연 오락의 다른 유형의 최대 불 활성화 근처에 달성 할 수 -4 MV 잡고 전압을 사용하여그렇지 않으면 상대적으로 작은 비 운영을 중지시키지 Kv7 전류의 기록을 오염시킬 tifier의 칼륨 전류 (Kv1와 Kv2 채널에 의해 주로 중재). 긴 (5 초) 전압 단계 프로토콜은 속도가 느린 전압에 의존 활성화 및 비활성화를 전시 Kv7 채널의 정상 상태 활성화를 달성 할 필요가 있습니다. Kv7 전류는 지속적인 전압 단계에서 비활성화하지 않습니다.
  7. Kv7 전류 - 전압 (IV)의 관계를 기록하기 위해 Kv7 채널의 개방 가능성이 도달되는 16 뮤직 비디오까지, Kv7 채널의 개방 가능성이 최소 인에서 -84 뮤직 비디오,에 이르기까지 전압을 5 초 전압 단계를 적용 고원, 5 초 후 각 시험 전압에서 다시 10 초에 개최 전압 (-4 뮤직 비디오)에 단계. 이 테스트 펄스 (그림 3A)의 전체 시리즈를위한 약 3.5 분 소요됩니다. 기록 전류가 시간이 지남에 따라 안정되는 것을 보장하기 위해 2-3 제어 IV 녹음을 수행합니다. 플롯 평균 엔드 펄스 전류 (평균마지막 1 초에 기록 된 전류) ​​대 전압은 IV 곡선 (그림 3D)을 만들 수 있습니다. 전류가 안정 경우 제어 IV 곡선은 약 겹쳐해야합니다.
  8. 신청하기 전에 약리 요원이 지속적으로 -20 뮤직 비디오에서 현재 레코드하기위한 시간 코스 프로토콜을 시작합니다. 약물 응용 프로그램에 전에 적어도 5 분 동안 전류의 안정적인 기록을 확인합니다. 5-15 분 또는 정상 상태가 (그림 3C) 달성 될 때까지 약리 대리인을 적용, 다음 시간 코스 프로토콜과 기록 전압 단계 프로토콜을 사용하여 두 IV 곡선을 해지 할 수 있습니다. 약물 희미하게 두 개의 추가 IV 곡선의 기록에 의해 다음 약물 유실의 시간 코스를 기록합니다.
  9. 실험의 끝에서 10 μM의 linopirdine 또는 10 μM XE991, Kv7 채널 돌이킬 수없는 억제제를 적용,이 약을 완전히 -20 MV (그림 3D)에 부정적인 전압에 기록 된 전류를 억제해야합니다.

5. 압력 Myography에 그대로 동​​맥 세그먼트의 사용

  1. 덴마크어 Myo 기술 (DMT A / S, 덴마크, 모델 110P)에서 구입 한 압력 myograph 시스템은 압력 myography 실험에 사용됩니다. 한쪽 끝과 다른 쪽 끝으로 이동 오른쪽 유리 캐뉼라에 수평으로 고정 왼쪽 유리 캐뉼라를 삽입하여 스테인레스 스틸 챔버에 동맥 세그먼트를 탑재합니다. 두 압력 트랜스 듀서는 (왼쪽에서 오른쪽과 P2에서 P1) 동맥 내강 내의 압력을 모니터링하기 위해 내장되어 있습니다. 오른쪽 유리 캐뉼라의 유체는 대략 생리적 수준으로 동맥 내부의 압력을 조정하는 데 사용됩니다. 시작하려면 루멘 솔루션 (표 1), 오픈 10 ML의 주사기를 (중력 공급 압력 항목으로 제공) 사전 입력하십시오. solu를 밀어 주사기를 높튜브 또는 캐뉼라의 기포를 피하기 위해 돌봐 오른쪽 유리 캐뉼라에 폴리에틸렌 관, 통해 기. 왼쪽 캐뉼라가 1 ML의 주사기를 통해 루멘 솔루션과 사전 입력해야합니다. 선박 목욕 솔루션 (표 1)의 10 ML과 압력 myograph 챔버를 입력합니다. 대충 유리 캐 뉼러에 인접한 양쪽에 두 미리 만든 고급 나일론 봉합을 일시 중지합니다.
  2. 마이크로을 사용하여 세그먼트의 한쪽 끝에 개최하여 압력 myograph 챔버로 해부 챔버에서, - 조심스럽게 해부하는 장간막 동맥 세그먼트를 (단계 2.6에서 직경 350 μm 보통 200 3 또는 4 번째 주문 세그먼트) 전송 포셉.
  3. 조명 해부 현미경을 통해 시각화, 동맥 세그먼트의 한쪽 끝을 잡고 살짝 왼쪽 유리 캐뉼라를 통해 그것을 밀어과 나일론 봉합을 사용하여 끝을 고정하십시오. 부드럽게 혈관 내에서 혈액과 오염 물질을 제거하기 위해 장착 된 선박을 통해 루멘 유체를 플러시.왼쪽 주사기에 대한 밸브는 다음이면이 압력이 오른쪽에서 조정하는 대한 유체의 정적 열을 제공하므로 폐쇄해야합니다.
  4. 마지막으로 나일론 봉합으로 고정, 이동식 오른쪽 유리 캐뉼라 동맥 세그먼트에 가까이 그리고는 세그먼트의 오른쪽 끝을 당겨 micromanipulator, 위치를 사용합니다. 초과 봉합 실을 클립.
  5. 압력 myograph 현미경으로 무대에 압력 myograph 단위를 탑재합니다. 압력 myograph 챔버를 통해 덮개를 놓습니다. 챔버의 표지가 superfusion 입구와 연결된 흡입 파이프가 포함되어 있습니다. 실온 욕조 또는 중력에 의해 압력 myograph 챔버에 60 MM KCl 용액의 superfusion 할 수 있도록 매니 폴드에 superfusion 유입구에 연결합니다. 이러한 Kv7 채널 기능에 영향을 미치는 패치 클램프 측정에서 발견되는 약물 또는 호르몬 등의 시험 물질은 일반적으로하지 한모금 목욕을 통해, 욕실 솔루션에 직접 적용됩니다erfusion 또는 루멘 솔루션 인치 목욕 솔루션의 superfusion은 KCl 용액을 씻어하는 데 사용됩니다. 초과 superfusate를 제거하는 진공 시스템으로 흡입 파이프를 연결합니다. myograph 챔버 커버에서 제공되는 개구를 통해 목욕 솔루션에 온도 센서를 삽입합니다.
  6. myo 인터페이스 시스템에 압력 myograph 장치, myoview 소프트웨어 (DMT)에 myograph 단위의 통신을 가능하게 하드웨어를 연결합니다.
  7. 컴퓨터의 myoview 소프트웨어를 엽니 다. 매개 변수 창에서 (1)의 온도 허용 오차를 35 ° C로 대상의 온도를 설정 ° C, 80 mmHg 80 mmHg로 대상 유출 압력과 같은 대상 유입 압력. 교정 파일을로드하고 동맥 직경의 변화가 마이크론에 정확하게 기록되도록 용기 외경을 조정. 배경에 대한 마운트 된 세그먼트의 좋은보기를 활성화 할 필요에 따라 명암을 조정합니다. 소프트웨어를 사용하는 방법에 대한 자세한 설명DMT의 사용자 설명서에 제공됩니다.
  8. P1 압력 변환기 80 mmHg를 읽은 때까지 점차적으로 15 분에 걸쳐 10 ML의 주사기를 (중력 공급 압력 항목으로 제공) 올립니다. 압력 열을 높이는 한편, 선박의 모든 누출을 확인합니다. 어떤 누수가있는 경우, 세그먼트를 버리고 (5.2에서 단계를 반복) 다른 동맥 세그먼트를 탑재합니다. 캐 뉼러 필요한 경우 사이의 거리를 조정합니다. 거리가 가압 동맥 세그먼트는 약 스트레이트 (하지만 않았어야)이며, 관계는 (그림 4A) 한 것 같은 패턴 어깨를 형성하는 방식으로 조정해야합니다.
  9. myo 인터페이스 시스템의 컨트롤을 통해 압력 myograph 챔버의 난방을 켜십시오. 가 36-37 ° C.에 도달 할 때까지 목욕 솔루션이 점차 따뜻하게 할 수 있도록 허용
  10. DMT 현미경의 목적의 XYZ 조정을 사용할 때 초점이 혈관을 유지하고 채널의 정확한 추적을 용이하게하기 위해 필요한외부 용기 직경 anges.
  11. 60 밀리미터 KCl과 과도 superfusion (~ 30 초)가 장착 된 선박의 생존을 확인합니다. 가능한 함정이 KCl의 추가에 빠르게 수축하고 60 MM KCl (KCl을 씻어 목욕탕 솔루션의 약 60 ML을 superfuse)의 유실 즉시 열립니다. 이 테스트 후, 정확히 10 ML에 목욕 솔루션의 볼륨을 다시 조정. 이 솔루션은 실온에서 있지만, 챔버 히터 몇 분 이내에 36-37 ° C로 온도를 복원 할 용의가 있기 때문에 욕조의 온도는 KCl 테스트 및 유실 동안 감소된다.
  12. 동맥은 적어도 30 분 (직경이 시대의 적어도 10 분 동안 안정적이어야합니다)에 대한 평형 할 수 있습니다. 직접 목욕 솔루션에 집중 시험 물질을 추가하고 10 ML 챔버 볼륨에서 적절한 최종 농도를 항복, 목욕 솔루션에 테스트 물질을 혼합 할 수있는 챔버의 가장자리 근처에 부드럽게 앞뒤로 피펫. 찬시험 물질 (들)의 선박 직경 다음의뿐만 아니라 릿지는 라이브 비디오 이미지에 모니터링하고 실험을 진행하는 동안 또한 이미지 분석 창에서 차트 할 수 있습니다.
  13. 실험 완료 후, 저장된 데이터 (*. myo) 파일은 추가 분석을 위해 스프레드 시트 파일로 열 수 있습니다.

6. 대표 결과

그림 3A, B, 그림 3에 표시된 결과는 Kv7 채널 활성화 아연 pyrithione (ZnPyr, 100 nm의 치료를하기 전에 (그림 3A, B 블랙 흔적)과 동안 전압 단계 프로토콜을 사용하여 장간막 동맥 근세포에서 Kv7 전류의 전형적인 녹음을 보여주는 붉은 흔적). 3 세포에서와 마찬가지로 전압 단계 데이터는 그림 3D에 표시된 전류 전압 (IV) 음모를 준비하기 위해 평균했다. 현재 진폭의 향상의 대표 시간 코스 (-20 뮤직 비디오의 지속적인 전압 클램프에 의해 측정) 내야100 나노 미터 아연 pyrithione과 g 치료는 그림 3C에 표시되어 그림 4B는 압력 myography를 사용하여 측정 창 자간 막 동맥 외경에 ZnPyr의 효과의 시간 과정을 보여줍니다,. 선박 100 PM 아르기닌 바소프레신 ​​(AVP)에 사전 죄였다 이전 100 나노 미터 ZnPyr의 추가. ZnPyr 유도 창 자간 막 동맥 지연에 대한 평균 투여 량 - 반응 데이터는 그림 4C에 표시됩니다.

그림 1
그림 1. 해부 챔버에서 창 ​​자간 막 아케이드의 그림.

그림 2
그림 2. 표면 패치 피펫과 myocyte의 그림.

그림 3
Kv7 전류, 약물의 시간 코스의 그림 3. 원본 흔적 응용 프로그램, IV 곡선. 치료하기 전에 전압 단계 (상단 패널) (제어, 검은 색)과 단일 MASMC 100 NM ZnPyr (빨간색)의 존재에 다음과 안정화에 대한 응답으로 기록 된 순서 현재의 흔적 (하단 패널)의 A. 가족. 에서 B. 대표 전류 트레이스 제어 (검은 색)의 100 nm의 ZnPyr (빨간색)에 대한 A (로 화살촉으로 표시). 회색 막대는 평균 전류 진폭이 전류 전압 (IV) 플롯에 대한 측정 된 시간 간격을 나타냅니다. 단계 전압은 화살촉이 오른쪽에 표시됩니다. 100 나노 미터 ZnPyr로 Kv7 현재 강화의 C. 시간 코스 -20 MV (바)에서 연속 전압 클램프로 측정. Kv7 현재 밀도에서 파생 D. 평균 IV 곡선 (n은 = 3) 100 NM ZnPyr (오픈 원), 치료 기간 동안과 10 μM XE991 (가득 삼각형)와 치료 기간 동안 (제어, 가득 원) 전에 기록했다. 비 특정 누설 전류는 Passmore 의해 설명 등의 차감되었습니다. 1.

다닐 "> 그림 4
그림 4. 100시 AVP와 사전 죄 창 자간 막 동맥의 ZnPyr 유도 휴식. 창 자간 막 동맥의 A.의 사진은 설정 압력 myograph에 장착. 100 NM ZnPyr (가득 바)의 응용 프로그램에 의해 다음 100 PM AVP (오픈 바)의 응용에 대한 응답으로 선박의 외경의 변화 B. 시간 코스입니다. C. 막대 그래프는 100 nm의 ZnPyr 유발 vasodilaion의 결과를 요약.

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Discussion

여기에서 설명한 방법과 실험 방법은 아주 강력하고 세부 사항에 세심한주의를 적용 할 경우 명확하고 재현 결과를 생성 할 수 있습니다. 좋은 electrophysiological 레코딩 및 수축 / 동맥 세그먼트의 팽창은 각각 셀 및 동맥 세그먼트의 건강에 따라 달라집니다. 셀 준비는 동일한 프로토콜을 사용하여, 날마다 다를 수 있습니다. 절연 솔루션은 최대 2 주까지 사용할 수 있지만 셀 준비의 품질은 두 결과의 일에 낮은 경우 새로운 절연 솔루션이 준비되어야한다. 우리는 효소 활동이 효소의 각각의 새 배치와 최적화를 필요로 일괄 배치되므로 절연 조건 (부화의 시간과 효소의 농도)에 따라 다를 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 쥐 장간막 동맥은 여기에 설명 된 세포 격리 프로토콜이 다른 혼합이나 동굴이있을 수 있습니다 다른 혈관 침대 혹은 다른 종에 대한 최적의 있지 않은 것으로 나타났습니다세포 외 기질의 구성 요소 ity. 각 혈관 준비 가장 건강 세포를 생산 조건을 식별 할 수있는 자신의 최적화가 필요합니다. 우리가 건강한 세포를 식별하는 가장 도움이되는 기준은 다음과 같습니다 1) 세포 형태 : 2로 이전 할 때 +, 같은 모양을 유지 50 μM 칼슘이 포함 된 절연 솔루션에 MA 세그먼트를 triturating 후, 부드러운 가늘고 긴하지만, 약간 죄 모습 MM 칼슘 2 + 함유 외부 솔루션입니다. 모든 세포는 거의 완벽하게 편안한 가늘고 긴 모양을 유지됩니다 만 거의 완전히 완화 근세포는 electrophysiological 레코딩에 사용되어야한다, 2) 세포가 손상 손상 멤브레인을 나타내는, 광학 조밀해야, 3) 건강 근세포의 휴식 막 전압에 사용 기록 칼륨 전류 또는 막 전압의 전류 클램프 녹음 용 (보통 이온 조건 데에 따라 -56 뮤직 비디오에 -45 mV의 범위에서 -40 뮤직 비디오보다 더 부정적인해야) 여기 프로토콜에 cribed.

성공 electrophysiological 녹음, 목욕 솔루션과 피펫 솔루션 (구성에 대한 표 1 참조) 실험 당일 준비해야합니다. 보장하기 위해 그것은 (298-299 mOsM) 동일이 될 수있는 내부 및 욕조 솔루션의 osmolality를 조정하는 데있어 매우 중요합니다.

더 자세히 대략 isometric 힘을 측정보다 생리 조건을 압력 myography를 사용하여 작은 동맥 (<500 μm)에서 만든 Isobaric 동맥 기능 측정 와이어 myograph를 사용했다. 압력 myograph의 선박은 일반적으로보다 밀접하게 생체 5, 6으로 측정 민감한를 건수 혈관 수축 제라 agonists 2-4, 더 민감합니다. agonists의 낮은 농도를 증가 감도는 AVP의 생리 학적 관련 picomolar 농도에 의해 유도 신호 전달 메커니즘의 식별을 사용하고 있습니다7, 8.

압력 myography은 혈관의 구조를 보존하고 내피의 무결성을 유지합니다. 약물의 내피로 인한 효과는 온전하고 내피 - denuded 선박 9 병렬 측정을 실시하여 평활근로 인한 효과를 구별 할 수 있습니다. 내피의 의도적 방해가 물리적으로 내피을 (루멘을 통해 앞뒤로 인간의 머리카락을 전달하여 예) 손상 또는 동맥의 내강을 통해 공기를 관류하여 수행 할 수 있습니다. 내피 기능 (하지만, 혈관하지 평활근 기능)의 손실이 작용제 9 미리 죄 선박에서 아세틸 콜린에 대한 할인 내피로 인한 vasodilator 응답을 측정하여 확인해야합니다.

패치 클램프 기술과 동맥 수축 / 창 자간 막 arteri의 팽창을 사용하여 창 자간 막 동맥 근세포의 이온 전류 / 막 전압의 병렬 측정압력 myography를 사용하여 에스는 생리적 신호 전달 폭포 모두와 치료 대리인의 행동에서 특정 이온 채널의 역할 해설을 활성화 할 수 있습니다. 이온 채널 또는 특정 신호 전달 중간체의 특정 클래스를 타겟으로 치료 세포 수준에서 myocyte 함수의 규제 및 수축 / 그대로 동​​맥의 팽창에 이러한 채널의 역할에 대한 기계론의 정보를 제공하기 위해 additively 또는 순서에 따라 적용 할 수 있습니다. 동맥 직경에 해당하는 효과를 이온 전류의 특정 유형을 강화하거나 억제 트리트먼트 수렴 결과는 자체적으로 두 가지 방법을 사용하여 얻을 수보다 더 신뢰할 수있는 해석을 제공합니다. 이상적으로, 연구에 따라 에이전트의 농도 - 의존성은 두 시스템에서 결정해야합니다. 생리학 또는 치료 관련성을 평가하기 위해 테스트 농도는 생리적 환경 O로 측정 농도에 관한해야R은 임상 치료와 함께 달성했습니다. 실험 방법 이러한 유형의 예는 이전 출판물 8-10에서 찾을 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

이 작품은 KLB와 미국 심장 협회 (09PRE2260209)와 BKM에 아서 J. 슈미트 재단의 사전 박사 장학금으로 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 (NIH R01-HL089564)의 교부금으로 운용되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

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References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
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