Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l'aide d'électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Biology

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Summary

Les mesures de KV7 (KCNQ) l'activité des canaux potassium dans les myocytes isolés des artères (l'utilisation du patch clamp techniques électrophysiologiques) en parallèle avec des mesures de constricteurs / dilatateur réponses (en utilisant myographie pression) peut révéler des informations importantes sur le rôle des canaux KV7 dans la physiologie du muscle lisse vasculaire et pharmacologie.

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Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

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Abstract

Contraction ou la relaxation des cellules musculaires lisses dans les parois des artères de résistance détermine le diamètre et commande ainsi l'artère écoulement de sang à travers le vaisseau et contribue à la pression artérielle systémique. Le processus de contraction est régulée par la concentration en calcium cytosolique ([Ca 2 +] cyt), qui est à son tour commandé par une série de transporteurs d'ions et des canaux. Les canaux ioniques sont des intermédiaires communs dans les voies de transduction du signal activées par les hormones vasoactives pour effectuer une vasoconstriction ou une vasodilatation. Et des canaux ioniques sont souvent pris pour cible par des agents thérapeutiques soit intentionnellement (par exemple inhibiteurs calciques utilisés pour induire une vasodilatation et hypotension) ou non (par exemple, pour induire des effets secondaires indésirables cardio-vasculaires).

KV7 (KCNQ) canaux potassiques voltage-activés ont récemment été identifié comme targ physiologique et thérapeutique importanteets de régulation de la contraction du muscle lisse. Pour élucider les rôles spécifiques des KV7 canaux à la fois dans la transduction du signal physiologique et dans les actions des agents thérapeutiques, nous devons étudier la façon dont leur activité est modulée au niveau cellulaire ainsi que d'évaluer leur contribution dans le cadre de l'artère intacte.

Les artères mésentériques de rats constituent un système modèle utile. Les artères peuvent être facilement disséquées, débarassés des tissus conjonctifs, et utilisé pour préparer des myocytes artériels isolés pour patch clamp électrophysiologie, ou une canule et mis sous pression pour les mesures de vasoconstricteurs / réponses vasodilatateur dans des conditions relativement physiologiques. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour les deux types de mesures et de donner quelques exemples de la façon dont la conception expérimentale peut être intégré à fournir une meilleure compréhension des rôles de ces canaux ioniques dans la régulation du tonus vasculaire.

Protocol

1. L'excision chirurgicale de la petite arcade mésentérique intestinale vasculaire

  1. Anesthésier un 300-400 g rat Sprague-Dawley avec de l'isoflurane (4%), administré par inhalation.
  2. Effectuer une laparotomie médiane pour exposer le mésentère de l'intestin grêle. Extérioriser l'intestin grêle et du gros par l'incision abdominale avec le plus grand soin pour éviter de traumatiser l'intestin et du mésentère exposé. Doucement attiser le mésentère au-dessus de gaze stérile.
  3. Chirurgicalement d'accise de l'intestin grêle et une partie du gros intestin, y compris le caecum (vaisseaux sanguins soigneusement coupés le long des marges et à l'origine des branches principales de l'artère mésentérique supérieure / veine).
  4. Transfert du tissu excisé dans un bécher contenant de la glace solution froide dissection (tableau 1).
  5. Après l'excision de l'intestin, le rat doit être euthanasiés sans cruauté sous anesthésie.

2. Dissection d'unNettoyage des artères d

  1. Transfert de l'intestin excisée et arcade mésentérique dans une chambre de refroidissement dissection (4-5 ° C) contenant une solution de dissection. La chambre est constituée d'une boîte de 100-mm verre de Petri avec une base élastomère SYLGARD 184 pour accueillir les repères de dissection; la boîte de Petri est placée dans une base de refroidissement qui est maintenu à 4-5 ° C par un bain d'eau en circulation.
  2. Avec des ciseaux chirurgicaux couper un segment d'environ 10-12 cm de l'intestin entier. Couper à chaque extrémité du segment intestinal en conservant sa vascularisation attaché, puis retirer l'intestin utilisé à partir de la chambre en laissant le seul segment avec sa vascularisation ci-joint (arcade mésentérique) dans l'isolement.
  3. Cerner le segment de l'intestin grêle, le mésentère propagation sur le côté, près de la chambre de sorte que la première branche de la mésentérique supérieure des artères / veines est dans le centre et les commandes subséquentes de rayonner branches du centre (Figure 1). J ace que les broches sur les segments intestinaux (pas sur les vaisseaux sanguins).
  4. Distinguer les artères des veines par leur couleur rouge relativement lumineux, murs épais et caractéristiques des branches en forme de V, plutôt que sur les branches en U vu dans les veines.
  5. Visualisation à travers un microscope éclairé dissection, soigneusement nettoyer le tissu adipeux et le tissu conjonctif entourant le deuxième 2 à 4 artères ème ordre à proximité des intestins (cercle en pointillés dans la figure 1) en utilisant une pince micro et ciseaux. Tenir les veines adjacentes facilite la compensation du tissu adipeux et du tissu conjonctif. Éviter d'inutiles étirement des artères.
  6. Segments de l'artère mésentérique débarrassées des tissus conjonctifs peuvent ensuite être disséqués et utilisés pour l'isolement cellulaire (pour une seule cellule études de patch-clamp, Sections 3-4) ou une canule pour myographie pression (section 5). Couper les segments entre les points de branchement, généralement jusqu'à 1 cm de longueur.
jove_title "> 3. cellule d'isolement pour les études de patch-clamp

  1. Préparer 0,5 L de solution d'isolation (tableau 1) et la diviser en 2 parties avant d'ajuster le pH. La première partie (habituellement 100 ml) doit être réchauffé à 37 ° C et le pH doit être ajusté à 7,2 à 37 ° C (37 ° C Solution d'isolation). La deuxième partie de la solution d'isolation doit être refroidi à 4 ° C et le pH doit être ajusté à 7,2 à 4 ° C (solution d'isolation de glace froide). Après ajustement du pH, l'osmolarité des deux solutions doivent être ajustées à 298 mOsm par addition d'une quantité appropriée de D-glucose ou H 2 O.
  2. Transvaser 2 ml de solution d'isolation de 37 ° C dans un flacon en verre et incuber à 37 ° C pour une utilisation à l'étape 3.4. Ajouter 20 mg de sérum albumine bovine (BSA) à 10 ml de solution à 37 ° C Isolation, dissoudre, réchauffer à 37 ° C et réajuster le pH à 7,2. A 2 ml de cette solution, ajouter 4 mg de collagénase de type VIII (Sigma, lot 089K8612: 633 ulentes / activité collagénase mg, 285 unités / mg activité caséinase, 1,6 unités / mg clostripaïne activité), 0,64 mg d'élastase type IV (Sigma, lot 110M7025V 5,9 unités / mg; ajouter 40 ul d'un 16 mg / ml de bouillon préparé à 37 ° Solution d'isolation C) et 2 pl de 1 M DL-dithiothréitol (DTT Sigma); préchauffer cette solution enzymatique à 37 ° C dans l'étape de préparation de 3,5.
  3. Transfert 2-3 segments de l'artère mésentérique dans un plat de 35 mm de culture de tissu contenant 2 ml de solution d'isolation Ice Cold et le lieu le plat sur la glace. Couper les segments artère mésentérique dans 3-4 mm de long morceaux.
  4. En utilisant une pipette Pasteur avec le feu pointe polie (pour éviter d'endommager les artères) transférer les segments artériels dans un flacon en verre (15 x 45 mm, 1 drachme) contenant 2 ml de pré-chauffé à 37 ° C Solution d'isolation et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
  5. Après 30 minutes, aspirer délicatement la solution à 37 ° C Isolation à l'aide d'une pipette Pasteur, ajouter 2 ml de solution enzymatique tiède et laisser incuber pendant 35 minà 37 ° C.
  6. Immédiatement après l'incubation 35 min dans la solution enzymatique, placer le flacon sur la glace, aspirer la solution enzymatique et ajouter 2 ml de solution d'isolation Ice Cold (aspiration de répétition et ajout de la solution d'isolation de glace fraîche froide 4 fois). Puis, dans un volume de 1 ml de solution d'isolation Ice Cold, doucement triturer segments artériels avec les poli pipette Pasteur 10-20 fois pour libérer les cellules individuelles mésentériques artères musculaires lisses (MASMCs).
  7. Vérifier périodiquement l'apparence des myocytes en plaçant une goutte de la suspension cellulaire dans un plat de 35 mm et la visualisation au microscope. MASMCs en bonne santé devraient avoir un aspect lisse allongée. Pas toutes les cellules de la paroi artérielle sera publié. La suspension cellulaire doit être conservé sur de la glace.
  8. Un autre indicateur utile de la santé MASMC est leur tolérance physiologique des concentrations de Ca 2 +. Remplir la chambre d'enregistrement (Outils Bioscience, # CSC-25L) avec salle de bain slution contenant 2 mM de CaCl 2 (pH 7,3 à température ambiante (RT), pour la composition voir tableau 1) et le pont agar position (verre bombé capillaire rempli avec de l'agar 2% en KCl 2 M, inséré dans l'électrode de référence (Instrument Warner, REF -3L)) à l'intérieur de la chambre. Utilisation de la pipette Pasteur polie, transférer environ 100-200 ul de suspension cellulaire à une chambre d'enregistrement et de permettre aux cellules d'adhérer pendant 15 min. Des cellules intactes ne doit pas diminuer de manière significative dans le mM CaCl 2 2-solution contenant (cellules devrait sembler être allongée ou en forme de tige, non arrondi en boule).
  9. Après addition de la première partie aliquote de la suspension cellulaire à la chambre d'enregistrement, 0,25 ml de solution de bain contenant 2 mM de CaCl 2 doit être ajouté à la suspension du volume restant de la cellule. Cette suspension cellulaire restante peut être maintenu dans cette solution sur de la glace et utilisé pour l'enregistrement de patch-clamp pour un maximum de 6 heures.

4.L'utilisation de Clamp Patch cellulaire entier pour mesurer les courants potassiques ou KV7 membrane de tension

  1. Après myocytes adhérer à la base en verre de la chambre d'enregistrement (25-n 1 mm lamelle ronde, Warner Instruments), initier une perfusion continue de la solution de bain (tableau 1). Pour l'enregistrement de KV7 courants dans l'isolement de retard courants potassiques redresseur de Kv1 et Kv2 familles, la solution du bain doit être complété par 100 uM GDCL 3.
  2. Fabriquer une pipette de patch de verre de borosilicate (Kimax-51, Kimble Chase) à l'aide d'un extracteur de pipette et microforge; sa résistance doit être 4-5 MQ lorsqu'elle est remplie d'une solution interne (tableau 1). Manteau l'. 1/3 inférieur de la pipette (~ 1-2 mm au-dessus de la pointe) avec Sylgard 184
  3. Pour l'enregistrement de KV7 courants dans MASMCs, le patch perforé ensemble technique du clamp tension de cellule doit être utilisé. Utilisation d'une configuration de patch perforé aide à prévenir depletion de la membrane phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP 2) et rapide ultérieure (à 5 min) diminution des effectifs des KV7 courants, qui sont communément observées en utilisant la configuration de patch conventionnelle rupture. Compléter la solution interne (tableau 1) avec 120 pg / ml d'amphotéricine B: ajouter 3 ul de 2 mg / ml d'amphotéricine B (préparé dans du DMSO et conservé congelé en petites portions et à l'abri de la lumière) à 0,5 ml de solution interne. Remplir la pointe de la pipette de patch avec l'amphotéricine B sans solution interne en trempant l'embout de pipette dans la amphotéricine B sans solution interne et ensuite à appliquer une aspiration à l'autre extrémité à l'aide d'une seringue de 10 ml lié par l'intermédiaire d'un morceau de tuyau (Tygon R- 3603). Ajouter la solution d'amphotéricine B pipette contenant du haut à l'aide d'une pipette Eppendorf Microloader Conseil jusqu'à ce que la pipette est environ la moitié remplis de solution. Retirer les bulles d'air en tapotant doucement la pipette. Utiliser la pipette immédiatement.
  4. Insérer la pipettele porte-électrode et utiliser un micromanipulateur pour abaisser la pipette à la surface d'un myocyte allongé (proche de, mais pas au-dessus du noyau, la figure 2). Lorsque la résistance à la pipette augmente à 6-10 MQ, appliquer le vide pour atteindre un giga-joint (> 10 GΩ).
  5. Réglez tension de maintien à 0 mV en attendant perforation de la membrane. Appliquer dans 100 niveaux de tension ms à +10 mV et -10 mV, puis à, et l'utilisation de l'amplificateur pour compenser les transitoires rapides de capacité de pipettes. Parallèlement à l'apparition de l'ensemble des transitoires de capacité de cellules, de petits courants soutenus positif (généralement 2-10 pA) indique la présence de canaux fonctionnels KV7.
  6. Perforation de succès avec l'amphotéricine B permettront de réduire la résistance d'accès à 35 MQ ou moins. Enregistrement en cours peut alors être lancée à l'aide d'un protocole de 5 sec échelon de tension de la tension mV tenue -4. Nous utilisons la tension -4 mV tenant pour atteindre près inactivation maximale des autres types de rec retardétifier les courants potassiques (médiée principalement par Kv1 et Kv2 canaux) qui seraient autrement contaminer l'enregistrement des relativement petites non-inactivant KV7 courants. Le temps (5 secondes) protocole échelon de tension est nécessaire pour atteindre l'état d'équilibre d'activation de canaux KV7, qui présentent une faible dépendant de la tension d'activation et de désactivation. Les courants KV7 n'inactivent pas pendant les étapes de tension soutenues.
  7. Pour enregistrer le KV7 courant-tension (IV) la relation, appliquer des mesures de tension 5 à Sec tensions allant de -84 mV, à laquelle la probabilité d'ouverture de canaux KV7 est minime, à +16 mV à laquelle la probabilité d'ouverture de canaux atteint une KV7 plateau; après 5 secondes à chaque tension d'essai, du recul de la tension de maintien (-4 mV) pendant 10 sec. Il faudra environ 3,5 min pour la série complète des impulsions de test (figure 3A). Effectuer 2-3 de contrôle des enregistrements IV pour s'assurer que les courants enregistrés sont stables dans le temps. Terrain moyen en fin d'impulsion courants (moyennecourants enregistrés pour le dernier 1 sec) par rapport à la tension pour créer une courbe IV (figure 3D). Les courbes de contrôle IV devrait être d'environ superposées si les courants sont stables.
  8. Avant d'appliquer des agents pharmacologiques initier un protocole cours du temps conçu pour enregistrer en continu en cours à -20 mV. Assurer un enregistrement stable du courant pendant au moins 5 minutes avant l'application du médicament. Appliquer les agents pharmacologiques pour 5-15 minutes ou jusqu'à ce qu'un état ​​d'équilibre est atteint (figure 3C), puis résilier le protocole cours du temps et d'enregistrer deux courbes IV en utilisant le protocole de tension étape. Lavage de la drogue et enregistrer au cours du temps de lavage médicament, suivi d'enregistrement de deux courbes IV supplémentaires.
  9. A la fin de l'expérience linopirdine appliquer 10 pM ou 10 pM XE991, inhibiteurs irréversibles de KV7 canaux; ces médicaments devraient pleinement inhiber les courants enregistrés à des tensions négatives à -20 mV (figure 3D).

5. Utilisez des segments des artères intactes pour myographie pression

  1. Un système myographe pression acheté du danois Myo Technology (DMT A / S, Danemark, modèle 110P) est utilisé pour l'expérience myographie pression. Monter le segment de l'artère dans la chambre en acier inoxydable par l'insertion de la canule de verre horizontalement à gauche fixée à une extrémité de la canule et le verre droit mobile dans l'autre extrémité. Deux capteurs de pression (P1 à P2 et la droite à la gauche) sont intégrés pour contrôler la pression à l'intérieur de la lumière artérielle. Fluide de la canule verre droit sera utilisée pour ajuster la pression à l'intérieur de l'artère à son niveau physiologique. Tout d'abord, avant de remplir une seringue de 10 ml ouverte (servant de colonne de pression à alimentation par gravité), avec une solution de lumière (Tableau 1). Soulever la seringue pour pousser solutiontion par l'intermédiaire de tuyaux en polyéthylène dans la canule de verre à droite, en prenant soin d'éviter les bulles d'air dans le tube ou la canule. La canule gauche doit être pré-rempli avec une solution lumière via une seringue de 1 ml. Remplir la chambre myographe pression avec 10 ml de la solution de bain navire (tableau 1). Suspendre librement deux déjà créés fils de nylon fines sur chaque côté adjacent à la canule de verre.
  2. Soigneusement transférer le segment de l'artère mésentérique disséqué (généralement un segment de 3 e ou 4 e ordre, autour de 200 à 350 um de diamètre; provenant de l'étape 2,6) de la chambre de dissection de la chambre de pression myographe en se tenant à une extrémité du segment à l'aide de micro forceps.
  3. Visualiser au microscope à dissection lumineux, tenir une extrémité du segment de l'artère et de la faire glisser en douceur sur la canule de verre gauche et fixer l'extrémité à l'aide des fils de nylon. Rincer doucement la lumière de fluide à travers le récipient monté pour éliminer le sang et les débris à l'intérieur de la cuve.La vanne de la seringue de gauche doit être fermé de telle sorte que cette partie présente une colonne de fluide statique sur laquelle la pression est ajustée à partir du côté droit.
  4. À l'aide du micromanipulateur, la position de la canule de verre mobile droit près du segment de l'artère et de tirer l'extrémité du segment de droite au-dessus, enfin le fixer avec les fils de nylon. Coupez les fils de suture en excès.
  5. Montez l'unité myographe pression sur la scène sur le microscope myographe pression. Placez le couvercle sur la chambre myographe pression. Le couvercle de la chambre contient l'entrée surfusion et le tuyau d'aspiration qui s'y rattachent. Raccorder l'entrée surfusion à un collecteur pour permettre surfusion de bain la température ambiante ou solution à 60 mM de KCl dans la chambre myographe pression par gravité. Les substances d'essai, tels que les médicaments ou des hormones que l'on trouve dans les mesures de patch-clamp pour affecter la fonction du canal KV7, sont généralement appliqués directement à la solution du bain, sans passer par le bain de soutienerfusion ou dans la solution de lumière. La solution de bain de superfusion sera utilisée pour laver la solution de KCl. Fixez le tuyau d'aspiration à un système de vide pour éliminer le superfusat excès. Insérer le capteur de température dans la solution de bain à travers l'ouverture ménagée dans le couvercle de la chambre myographe.
  6. Connecter l'unité myographe pression dans le système myo-interface utilisateur, le matériel qui permet la communication de l'unité de myographe au logiciel Myoview (DMT).
  7. Ouvrez le logiciel Myoview dans l'ordinateur. Dans la fenêtre de paramètres, régler la température cible de 35 ° C avec une tolérance de température de 1 ° C, la pression d'admission cible de 80 mm de Hg et la pression de sortie en tant que cible 80 mmHg. Charger le fichier de calibration et de calibrer le diamètre récipient extérieur de sorte que les changements de diamètre de l'artère sont enregistrées avec précision en microns. Ajustez le contraste si nécessaire pour permettre une bonne vue sur le segment monté sur le fond. Une description détaillée de la façon d'utiliser le logicielest fourni dans le manuel utilisateur du DMT.
  8. Augmenter progressivement la seringue 10 ml (servant de colonne de pression à alimentation par gravité) pendant une période de 15 min jusqu'à ce que le capteur de pression P1 lit 80 mmHg. Tout en soulevant la colonne de pression, vérifier s'il ya des fuites dans la cuve. S'il ya des fuites, jeter le segment et monter un autre segment d'artère (répétez les étapes depuis 5.2). Ajuster la distance entre les canules lorsque cela est nécessaire. La distance doit être ajustée de telle sorte que le segment de l'artère sous pression est à peu près rectiligne (mais pas étiré) et forme un épaulement comme motif d'où les liens sont faits (figure 4A).
  9. Allumer le chauffage de la chambre de pression à travers myographe les contrôles dans le système de myo-interface. Laisser la solution de bain pour se réchauffer progressivement jusqu'à ce qu'il atteigne 36-37 ° C.
  10. Utilisez les réglages XYZ de l'objectif du microscope DMT lorsque cela est nécessaire pour maintenir le navire au point et de faciliter le repérage précis de la changes de diamètre récipient extérieur.
  11. Vérifier la viabilité de la cuve monté en surfusion transitoire (~ 30 sec) avec 60 mM de KCl. Un navire viable resserre rapidement addition de KCl et dilate immédiatement après lavage de la 60 mM (superfuse environ 60 ml de solution de bain pour laver le KCl) KCl. Après cet essai, ajuster le volume de la solution de bain de 10 ml exactement. La température du bain est réduite au cours de l'essai de KCl et de lavage, car ces solutions sont à la température ambiante, mais le chauffage de chambre rétablit la température à 36-37 ° C en quelques minutes.
  12. Permettre à l'artère de se stabiliser pendant au moins 30 minutes (le diamètre doit être stable pendant au moins les 10 dernières minutes de cette période). Ajouter la substance d'essai à la solution concentrée directement bain et pipeter doucement d'avant en arrière à proximité des bords de la chambre à mélanger la substance d'essai dans la solution du bain, ce qui donne la concentration finale appropriée dans le volume 10 ml chambre. Changes dans l'addition suivante navire diamètre de substance d'essai (s) peuvent être surveillés dans l'image vidéo en direct et a également indiqué dans la fenêtre d'analyse d'image alors que l'expérience est en cours.
  13. Après la fin de l'expérience, les données stockées (*. Myo) fichier peut être ouvert dans un fichier tableur pour une analyse plus approfondie.

6. Les résultats représentatifs

Les résultats présentés dans la figure 3 illustrent les enregistrements typiques de KV7 courants de myocytes artériels mésentériques en utilisant un protocole échelon de tension avant (figure 3A, B traces noires) et pendant le traitement avec un activateur des canaux KV7 pyrithione de zinc (ZnPyr, 100 nM; la figure 3A, B traces rouges). Données similaires échelon de tension de 3 cellules ont été en moyenne de préparer les caractéristiques courant-tension (IV) des parcelles indiquées dans la figure 3D. Une évolution dans le temps représentant de l'amélioration de l'amplitude du courant (mesuré par la pince de tension continue à -20 mV) Durintraitement g avec 100 nM Zn pyrithione est illustré à la figure 3C figure 4B illustre l'évolution temporelle de l'effet de ZnPyr le diamètre de l'artère mésentérique extérieure mesurée à l'aide myographie pression;. que le navire était pré-rétréci avec 100 pM arginine vasopressine (AVP) avant plus de 100 nM ZnPyr. Moyennées données dose-réponse pour ZnPyr induite par dilatation de l'artère mésentérique est représenté sur la figure 4C.

Figure 1
Figure 1. Image d'une arcade mésentérique dans la chambre de dissection.

Figure 2
Figure 2. Image d'un myocyte avec une pipette de patch sur sa surface.

Figure 3
Traces Figure 3. Originales de KV7 courants, évolution dans le temps des médicaments d'application, les courbes IV. A. Famille des traces de courant séquentiels (panneau inférieur) ont été enregistrés en réponse à des mesures de tension (panneau du haut) avant le traitement (contrôle, noir) et de stabilisation qui suit, en présence de 100 nM ZnPyr (rouge) dans une MASMC unique. B. traces représentatives actuelles de A (comme indiqué par des flèches) pour le contrôle (noir) et 100 nM ZnPyr (rouge). Barres grises indiquent l'intervalle de temps où moyennées amplitudes de courant ont été mesurées pour le courant-tension (IV) des parcelles. Tensions de pas sont indiquées sur la droite par des flèches. Bien entendu C. Temps de mise en valeur de courant KV7 par 100 nM ZnPyr mesurée avec verrouillage de tension continue à -20 mV (bar). D. moyenne courbes IV (n = 3) dérivée de KV7 densités de courant enregistrées avant (témoin, cercles pleins), pendant le traitement avec 100 nM (cercles ouverts) ZnPyr, et pendant le traitement avec 10 pM XE991 (triangles pleins). Courants de fuite non spécifiques ont été soustraites tel que décrit par Passmore et al. 1.

ent "> Figure 4
Figure 4. ZnPyr relaxation induite d'une artère mésentérique pré-rétréci avec 100 pM AVP. Photographie A. d'une artère mésentérique monté dans le myographe pression set-up. Temps de parcours B. variations de diamètre extérieur de la cuve en réponse à l'application de 100 pM AVP (barre pleine) suivie de l'application de la ZnPyr 100 nM (barre pleine). C. Barre graphique résumant les résultats de 100 nM ZnPyr induite vasodilaion.

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Discussion

Les méthodes et approches expérimentales décrites ici sont très robustes et peuvent produire des résultats clairs et reproductibles lorsqu'ils sont appliqués avec une attention méticuleuse aux détails. De bons enregistrements électrophysiologiques et la constriction / dilatation des segments artériels sont tributaires de la santé des cellules et des segments d'artère, respectivement. Préparations de cellules peut varier de jour en jour, même en utilisant le même protocole. Solutions d'isolation peut être utilisé pour un maximum de 2 semaines, mais si la qualité de la préparation cellulaire est faible sur deux jours en découlent Solutions d'isolation nouvelles doivent être préparés. Nous avons constaté que les activités enzymatiques varient d'un lot aux conditions d'isolement par lots (et donc les temps d'incubation et des concentrations d'enzymes) nécessitent l'optimisation avec chaque nouveau lot d'enzymes. Nous avons également constaté que le protocole d'isolement cellulaire décrite ici pour artère mésentérique de rats n'est pas optimal pour d'autres lits vasculaires ou d'autres espèces, qui peuvent avoir une composition différente ou tanièreslité des composants de la matrice extracellulaire. Chaque préparation vasculaire nécessite sa propre optimisation d'identifier les conditions qui produisent les cellules saines. Les critères que nous trouvons les plus utiles pour identifier les cellules saines sont: la morphologie des cellules 1): aspect lisse, allongée, mais légèrement resserré après trituration segments MA dans la solution d'isolation contenant 50 uM Ca 2 +, et en conservant le même aspect lors de son transfert à 2 mM de Ca 2 +-contenant la solution externe. Pas toutes les cellules conservent leur forme presque complètement détendu allongé, mais seuls les myocytes presque complètement détendu devrait être utilisé pour l'enregistrement électrophysiologique; 2) Les cellules doivent être optiquement dense, ce qui indique une membrane intacte intacte; 3) tensions de membrane de repos de myocytes sains utilisés pour courants potassiques de disques ou de courant clamp de tension de la membrane doit être plus négative que -40 mV (habituellement de l'ordre de -45 mV à -56 mV dans les conditions ioniques desdécrite à l notre protocole ici).

Pour assurer le succès des enregistrements électrophysiologiques, la solution du bain et la solution de la pipette (pour la composition voir tableau 1) doit être préparée le jour même de l'expérience. Il est crucial d'ajuster l'osmolalité des solutions à la fois internes et salle de bain soient identiques (298-299 mOsm).

Isobariques mesures prises fonction artérielle dans les artères de petite taille (<500 um) en utilisant myographie pression se rapprochent davantage des conditions physiologiques que ne le font les mesures de force isométrique faites en utilisant un myographe fil. Les navires dans un myographe pression sont généralement plus sensibles aux agonistes vasoconstricteurs 2-4, se rapprochant de plus près les sensibilités mesurées in vivo 5, 6. La sensibilité accrue à de faibles concentrations d'agonistes a permis l'identification de mécanismes de transduction du signal induit par des concentrations physiologiquement pertinentes picomolaires d'AVP7, 8.

Myographie pression préserve la géométrie du récipient et à maintenir l'intégrité de l'endothélium. Endothélium médiées par les effets des médicaments peuvent être distingués des muscles lisses effets médiés par la réalisation de mesures parallèles dans les vaisseaux intacts et l'endothélium dénudé 9. La perturbation intentionnelle de l'endothélium peut être réalisée par l'endothélium endommager physiquement (par exemple par passage d'un cheveu humain-et-vient à travers la lumière), soit par perfusion de l'air à travers la lumière de l'artère. La perte de la fonction endothéliale (mais non vasculaire fonction des muscles lisses) doit être confirmée par la mesure d'une réponse vasodilatatrice endothélium induite par la réduction de l'acétylcholine dans les vaisseaux pré-rétrécis avec un agoniste 9.

Mesures parallèles de courants ioniques / tension de membrane dans les myocytes artériels mésentériques en utilisant des techniques de patch-clamp et de constriction artérielle / dilatation des artériel mésentériquees en utilisant myographie pression peut permettre à l'élucidation du rôle des canaux ioniques spécifiques dans les deux cascades de transduction des signaux physiologiques et les actions des agents thérapeutiques. Traitements ciblant certaines catégories de canaux ioniques spécifiques ou intermédiaires de transduction du signal peut être appliqué de façon additive ou dans l'ordre de fournir des informations mécanistiques sur les rôles de ces canaux dans la régulation de la fonction des myocytes au niveau cellulaire et la constriction / dilatation des artères intactes. Résultats convergents de traitements qui favorisent ou inhibent certains types de courants ioniques avec des effets correspondants sur diamètre de l'artère fournir des interprétations plus fiables que peut être obtenu en utilisant soit la méthode en elle-même. Idéalement, la concentration-dépendance des agents à l'étude doit être déterminée dans les deux systèmes. Pour évaluer la pertinence physiologique ou thérapeutique, les concentrations testées doivent être liés aux concentrations mesurées dans l'environnement physiologique or obtenus avec des traitements cliniques. Des exemples de ces types d'approches expérimentales peuvent être trouvées dans nos publications antérieures 8-10.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par une subvention du National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) pour KLB et pré-doctorales de l'American Heart Association (09PRE2260209) et Arthur J. Schmitt Fondation pour BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

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References

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