Exploring Arteriell glatt muskulatur KV7 Kalium Channel funksjon ved hjelp Patch Clamp Elektrofysiologi og trykk Myography

Published 9/14/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Målinger av KV7 (KCNQ) kalium kanal aktivitet i isolerte arterielle myocytes (med patch klemme elektrofysiologiske teknikker) parallelt med målinger av constrictor / dilator svar (med trykk myography) kan avsløre viktig informasjon om rollene KV7 kanaler i vaskulær glatt muskulatur fysiologi og farmakologi.

Cite this Article

Copy Citation

Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kontraksjon eller relaksasjon av glatte muskelceller innenfor veggene av motstand arterier bestemmer arterien diameter og derved kontrollerer flyten av blod gjennom karet og bidrar til systemisk blodtrykk. Sammentrekning Prosessen reguleres primært ved cytosoliske kalsiumkonsentrasjon ([Ca2 +] cyt), som er i sin tur styrt av en rekke ione transportproteiner og kanaler. Ionekanaler er vanlige mellomprodukter i signaltransduksjonsveiene aktiveres av vasoaktive hormoner for å påvirke vasokonstriksjon eller vasodilatasjon. Og ionekanaler er ofte målrettet med terapeutiske midler enten med vilje (f.eks kalsiumkanalblokkere brukes til å indusere vasodilatasjon og lavere blodtrykk) eller utilsiktet (f.eks å indusere uønskede kardiovaskulære bivirkninger).

KV7 (KCNQ) spenning-aktiverte kaliumkanaler har nylig blitt antydet som viktig fysiologisk og terapeutiske targets for regulering av glatt muskel sammentrekning. Å belyse de spesifikke roller KV7 kanaler i både fysiologiske signaltransduksjon og i handlingene terapeutiske midler, må vi studere hvordan deres aktivitet er modulert på cellenivå samt vurdere deres bidrag i sammenheng med den intakte arterie.

Rotte mesenteric arteries gi en nyttig modell system. Arteriene kan lett dissekert, renset av bindevev, og brukes til å forberede isolerte arterielle myocytes for patch clamp elektrofysiologi, eller kanylert og trykksatt for målinger av vasokonstriktor / vasodilator responser under relativt fysiologiske forhold. Her beskriver vi de metoder som brukes for begge typer målinger og gi noen eksempler på hvordan den eksperimentelle design kan integreres for å gi en klarere forståelse av rollene disse ionekanaler i reguleringen av vaskulær tone.

Protocol

1. Kirurgisk excision av tynntarmen mesenteric Vaskulær Arcade

  1. Anesthetize en 300-400 g Sprague-Dawley rotte med isofluran (4%) administrert ved inhalering.
  2. Utfør en midtlinjen laparotomi å eksponere små intestinal mesentery. Eksteriorisere små og store tarmen gjennom abdominal snitt med stor forsiktighet for å unngå skade på utsatt tarm og mesentery. Forsiktig lufte mesentery ut over steril kompress.
  3. Kirurgisk avgifter tynntarmen og en del av tykktarmen, inkludert caecum (blodårer nøye kuttet langs margene og ved opprinnelse fra primære grener av den overlegne mesenteriske arterie / vene).
  4. Overfør det utskårende vevet til et beger inneholdende iskald dissecting løsning (tabell 1).
  5. Etter excision av tarmen, skal rotten humant avlivet mens under anestesi.

2. Disseksjon end Rengjøring av Arterier

  1. Overfør det utskårende tarmen og mesenteriske arkaden til en avkjølt dissecting kammer (4-5 ° C) inneholdende dissekerende løsning. Kammeret består av en 100-mm glass petriskål med en SYLGARD 184 elastomer base til imøtekomme dissecting pins; petriskålen plasseres i nedkjølt base som holdes ved 4-5 ° C ved en sirkulerende vannbad.
  2. Bruke kirurgiske sakser kutte en ca 10-12 cm segment ut av hele tarmen. Skjær ved hver ende av intestinal segmentet holde sin vaskulatur festet, og deretter fjerne den ubrukte tarmen fra kammeret forlater ett segment med sin tilknyttede blodforsyning (mesenteriske arkade) isolert.
  3. Pin ned del av tynntarmen, og spre mesenteriet over nær side av kammeret slik at den primære gren av den overlegne mesenteriske arterie / vene er i midten og de ​​etterfølgende bestillinger av grener utstråle fra sentrum (Figur 1). Pl ess pinnene bare på intestinal segmenter (ikke på blodårene).
  4. Skille arterier fra årer av deres relativt lys rød farge, tykke vegger og karakteristiske V-formede grener, i stedet for U-formede grener sett i årer.
  5. Visualisere gjennom en opplyst disseksjonsmikroskop, nøye fjerne fettvev og bindevev rundt 2. - 4 th bestille arterier nær tarmen (stiplet sirkel i figur 1) med mikro tenger og sakser. Holder de tilstøtende årer letter å fjerne fettvev og bindevev. Unngå unødvendig strekking av arteriene.
  6. Mesenteric arterie segmenter ryddet av bindevev kan da dissekert ut og brukes til celleisolasjon (for encellede patch clamp studier, § 3-4) eller kanylert for press myography (§ 5). Skjær segmenter mellom avdelingskontorer poeng, vanligvis opptil 1 cm i lengde.
jove_title "> 3. Cell Isolasjon for Patch Clamp Studies

  1. Forbered 0,5 L av isolasjon Solution (tabell 1) og del den i to deler før justering av pH Den første del (vanligvis 100 ml) må varmes opp til 37 ° C og pH bør justeres til 7,2 ved 37 ° C (37 ° C Isolation Solution). Den andre del av den isolasjon Løsning bør avkjøles ned til 4 ° C og pH bør justeres til 7,2 ved 4 ° C (Ice Cold Isolation Solution). Etter pH-justering, må osmolariteten av begge løsninger som skal justeres til 298 mOsm ved tilsetning av en passende mengde av D-glukose eller H 2 O.
  2. Overfør 2 ml av 37 ° C Isolation Løsning på et hetteglass og inkuber ved 37 ° C for bruk i trinn 3.4. Tilsett 20 mg bovint serumalbumin (BSA) til 10 ml av 37 ° C Isolation Solution, oppløse, re-varm til 37 ° C og juster pH til 7,2. Til 2 ml av denne løsning tilsett 4 mg kollagenase attraksjon VIII (Sigma, Lot 089K8612: 633 units / mg collagenase aktivitet, 285 enheter / mg Caseinase aktivitet, 1,6 enheter / mg Clostripain aktivitet), 0,64 mg elastase type IV (Sigma, Lot 110M7025V 5,9 enheter / mg, tilsett 40 pl av en 16 mg / ml lager utarbeidet i 37 ° C Isolasjon Løsning) og 2 pl av 1 M DL-ditiotreitol (DTT Sigma); forvarme denne enzymoppløsning til 37 ° C i forberedelse til trinn 3.5.
  3. Overfør 2-3 segmenter av den mesenteriske arterien i en 35-mm vevskultur parabolen inneholdende 2 ml iskald Isolation Løsning og sett formen på is. Skjær mesenteric arterie segmenter i 3-4 mm lange stykker.
  4. Ved hjelp av en Pasteur-pipette med ild polert tips (unngå skadelige av arterier) overføre arterielle segmenter inn i et glass hetteglass (15 x 45 mm, 1 dram) inneholdende 2 ml forvarmet 37 ° C Isolation Løsning og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
  5. Etter 30 min, nøye suge 37 ° C Isolasjon Solution med en Pasteur pipette, tilsett 2 ml varm enzymoppløsning og inkuber i 35 minved 37 ° C.
  6. Umiddelbart etter 35 min inkubasjon i enzymoppløsning, plasserer hetteglasset på is, suge enzymoppløsning og tilsett 2 ml iskald Isolation Solution (gjenta aspirasjon og tilsetning av frisk Ice Cold Isolation Løsning 4 ganger). Så, i et volum på 1 ml iskald Isolation Solution, forsiktig triturate arterielle segmenter med de polerte Pasteur pipette 10-20 ganger for å frigjøre den enkelte mesenteric artery glatte muskelceller (MASMCs).
  7. Periodisk kontrollere myocytes utseende ved å plassere en dråpe cellesuspensjonen på en 35-mm parabol og visning under et mikroskop. Friske MASMCs bør ha en glatt langstrakt utseende. Ikke alle cellene i arterieveggen vil bli utgitt. Cellesuspensjonen bør holdes på is.
  8. En annen nyttig indikator på MASMC helse er deres toleranse av fysiologiske Ca 2 + konsentrasjon. Fyll opptak kammer (Biovitenskap Verktøy, # CSC-25L) med badekar solution inneholdende 2 mM CaCl 2 (pH 7,3 ved romtemperatur (RT), for sammensetning se tabell 1) og posisjon agar bro (bøyd glass kapillært fylt med 2% agar i 2 M KCl, satt inn i referanse-elektroden (Warner Instrument, REF -3L)) inne i kammeret. Bruke polert Pasteur pipette, overføre ca 100-200 ul cellesuspensjon til en innspilling kammer og la cellene å overholde i 15 min. Uskadde celler bør ikke kontrakt betydelig i 2 mM CaCl 2-holdige løsning (celler bør synes å være avlange eller stavformet, ikke avrundet opp i baller).
  9. Etter tilsetning første alikvot av cellesuspensjonen til opptaket kammeret, 0,25 ml av bad inneholdende 2 mM CaCl 2 bør legges til gjenværende volum av cellesuspensjon. Denne gjenværende cellesuspensjon kan opprettholdes i denne løsningen på is og brukes for patch clamp-opptak for opptil 6 timer.

4.Bruk av Whole Cell Patch Clamp å måle KV7 kaliumstrømmene eller membran Spenning

  1. Etter myocytes overholde glassfot av opptaket kammeret (25-mm nr. 1 omg dekkglass, Warner Instruments), initiere kontinuerlig perfusjon av bad-løsningen (tabell 1). For opptak av KV7 strømninger i isolasjon fra forsinkede likeretter kalium strøm på Kv1 og Kv2 familier bør bad løsning suppleres med 100 mikrometer GdCl 3.
  2. Dikte en patch pipette fra borsilikatglass (Kimax-51, Kimble Chase) med en pipette avtrekker og microforge; sin motstand bør være 4-5 MΩ når fylt med intern løsning (tabell 1). Coat nedre 1/3 av pipetten (~ 1-2 mm over spissen) med SYLGARD 184.
  3. For opptak av KV7 strømninger i MASMCs bør perforerte patch hele cellespenning clamp teknikken brukes. Bruk av en perforert patch konfigurasjon forhindrer depletion av membran phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP 2) og påfølgende rask (innen 5 min) oversikt over de KV7 strøm, som ofte observert med konvensjonelle sprukket patch konfigurasjon. Supplere den interne oppløsning (tabell 1) med 120 ug / ml Amphotericin B: Tilsett 3 pl av 2 mg / ml lager av Amphotericin B (fremstilt i DMSO og holdt frosset i små aliquoter og beskyttet mot lys) til 0,5 ml av intern løsning. Fyll spissen av plasteret pipette med Amphotericin B-fri innvendig løsning ved dypping pipettespissen i Amphotericin B-fri innvendig løsning og deretter anvende sug på den andre enden ved hjelp av en 10 ml sprøyte festet via et stykke slange (Tygon R- 3603). Legg Amphotericin B-holdig pipette løsning fra toppen ved hjelp av en Eppendorf Microloader pipettespissen til pipetten er omtrent halvparten fylt med løsningen. Fjern eventuelle luftbobler ved å banke pipetten. Bruk pipetten umiddelbart.
  4. Sett pipettentil elektrodeholderen og bruke en mikromanipulator å senke pipetten til overflaten av en langstrakt myocyte (nær, men ikke på toppen av kjernen, figur 2). Når motstanden i pipetten øker til 6-10 MΩ, påfør sug for å oppnå en Giga-tetning (> 10 GΩ).
  5. Still holde spenningen til 0 mV mens du venter på membran perforasjon. Påfør 100 ms spenning trinn til 10 mV og deretter til -10 mV, og bruke forsterkeren til å kompensere raske pipette kapasitans transienter. Samtidig med utseendet helcelle kapasitans transienter, små vedvarende positive strømmer (vanligvis 2-10 pA) vil indikere tilstedeværelse av funksjonelle KV7 kanaler.
  6. Vellykket perforering med Amphotericin B vil redusere tilgangen motstand til 35 MΩ eller mindre. Aktuelle opptaket kan da initieres med en 5 sek spenning trinn protokollen fra -4 mV holding spenning. Vi bruker -4 mV holder spenning å oppnå nær maksimal inaktivering av andre typer forsinket rectifier kaliumstrømmene (mediert hovedsakelig av Kv1 og Kv2 kanaler) som ellers ville forurense innspillingen av de relativt små ikke-inaktivere KV7 strømmer. Den lange (5 sek) spenning trinn protokollen er nødvendig for å oppnå likevekt aktivering av KV7 kanaler, som oppviser langsomme spenningsavhengige aktivering og deaktivering. De KV7 strømninger ikke inaktivere under vedvarende spenning trinn.
  7. Å registrere KV7 Strøm-spenning (IV) forholdet, påfør 5 sek spenning trinn til spenninger som spenner fra -84 mV, ved hvilken den åpne sannsynlighet KV7 kanaler er minimal, for å 16 mV ved som den åpne sannsynlighet KV7 kanaler når en platå, etter 5 sek på hver test spenning, gå tilbake til å holde spenningen (-4 mV) for 10 sek. Det vil ta ca 3,5 min for full serie av test pulser (figur 3A). Utfør 2-3 kontroll IV opptak for å sikre at de registrerte strømmene er stabile over tid. Plot gjennomsnittlig end puls strømmer (gjennomsnittligstrømninger registrert for siste 1 sek) versus spenning for å skape en IV kurve (figur 3D). Kontrollpunktene IV kurver skal være omtrent lagt hvis strømmen er stabil.
  8. Før du bruker noen legemidler som initiere en gang selvfølgelig protokoll laget for å kontinuerlig registrere strøm ved -20 mV. Sikre stabil innspilling av gjeldende i minst 5 minutter før stoffet søknaden. Påfør de farmakologiske agenter for 5-15 min eller til en steady-state oppnås (Figur 3C), deretter avslutte tidsforløpet protokollen og opp to IV kurver ved hjelp av spenning-trinns protokollen. Bleke stoffet og registrere tidsforløpet av narkotika utvasking, fulgt av opptak av to ytterligere IV kurver.
  9. På slutten av eksperimentet gjelde 10 uM linopirdine eller 10 uM XE991, irreversible inhibitorer av KV7 kanaler, og disse stoffene bør fullt hemme strømmene registrert ved spenninger negative til -20 mV (Figur 3D).

5. Bruk av intakt Artery segmenter for Pressure Myography

  1. En presset myograph system kjøpt fra dansk Myo Technology (DMT A / S, Danmark, Model 110P) brukes for trykket myography eksperimentet. Monter arterien segmentet i rustfritt stål kammeret ved å sette den horisontalt løst venstre glass kanyle i den ene enden og den bevegelige riktig glass kanyle inn i den andre enden. To trykktransdusere (P1 på høyre og P2 på venstre side) er bygget inn for å overvåke trykket i arterien lumen. Fluid fra riktig glass kanyle vil bli brukt til å justere trykket i arterien til dens omtrentlige fysiologisk nivå. For å begynne, pre-fylle en åpen 10 ml sprøyte (tjener som en falltilførsel-kolonnekromatografi), med lumen løsning (tabell 1). Hev sprøyten å presse løsningersjon via polyetylen slangen inn i den høyre glass kanylen, ta vare å unngå luftbobler i slangen eller kanyle. Den venstre kanyle bør forhåndsutfylt med lumen løsning via en 1 ml sprøyte. Fyll trykket myograph kammeret med 10 ml av fartøyet bad løsning (tabell 1). Løst suspendere to pre-laget fin nylon suturer på hver side ved siden av glasset kanyler.
  2. Nøye overføre dissekerte mesenteric arterien segmentet (vanligvis en 3. eller 4. orden segmentet, rundt 200-350 um i diameter, fra trinn 2.6) fra dissekere kammer til det trykket myograph kammeret ved å holde på en ende av segmentet ved hjelp av mikro tang.
  3. Visualisering gjennom en opplyst disseksjonsmikroskop, holder den ene enden av arterien segmentet og skyv den over den venstre glasset kanylen og fest enden bruke nylon suturer. Forsiktig skylle lumen fluid gjennom den monterte fartøyet for å fjerne blod og rusk i beholderen.Ventilen til venstre sprøyten skal deretter være lukket slik at denne siden presenterer en statisk kolonne av fluid mot hvilken trykket er justert fra høyre side.
  4. Bruke micromanipulator, posisjon den bevegelige høyre glass kanyle nærmere arterien segmentet og trekk den høyre enden av segmentet over det, han sikret det med nylon suturer. Klipp av overskytende suture tråder.
  5. Monter press myograph enhet på scenen over trykket myograph mikroskop. Plasser dekselet over trykket myograph kammeret. Dekslet for kammeret inneholder superfusjons innløp og innsugningsrøret knyttet til den. Koble superfusjons innløpet til en manifold for å tillate superfusjons av romtemperatur bad eller 60 mM KCl-løsning inn trykket myograph kammeret av tyngdekraften. Forsøksstoffer som narkotika eller hormoner som finnes i plasteret klemme målingene å påvirke KV7 kanalfunksjon, er generelt brukt direkte til bad løsning, ikke via badekaret superfusion eller i lumen løsningen. Den superfusjons av bad løsningen vil bli brukt til å vaske ut KCl løsning. Fest innsugningsrøret til et vakuum system for å fjerne overflødig superfusate. Skyv temperaturføleren inn på badet løsning gjennom åpningen gitt i myograph kammer dekselet.
  6. Koble trykket myograph enhet til myo-grensesnitt system, maskinvare som muliggjør kommunikasjon av myograph enheten til myoview programvare (DMT).
  7. Åpne myoview programvare på datamaskinen. I parameteren vinduet set måltemperaturen som 35 ° C med en temperatur toleranse på 1 ° C, mål tilsig press som 80 mmHg og målet utstrømning press som 80 mmHg. Laste kalibrering filen og kalibrere skipet ytre diameter slik at endringene i arterie diameter er registrert nøyaktig i mikron. Juster kontrasten som nødvendig for å muliggjøre et godt inntrykk av den monterte segmentet mot bakgrunnen. En detaljert beskrivelse for hvordan du bruker programvarener gitt i bruksanvisningen fra DMT.
  8. Gradvis øker 10 ml sprøyte (tjener som en falltilførsel-kolonnekromatografi) over en periode på 15 minutter til P1 trykktransduseren leser 80 mmHg. Samtidig øke trykket kolonnen, sjekk for eventuelle lekkasjer i fartøyet. Hvis det er noen lekkasjer, kast segmentet og montere en annen arterie segment (gjenta trinn fra 5.2). Juster avstanden mellom kanyler ved behov. Avstanden bør justeres slik at den trykksatte arterien segmentet er tilnærmet rett (men ikke strukket) og danner en skulder som-mønster hvor båndene er laget (figur 4A).
  9. Slå på oppvarming av trykket myograph kammer gjennom kontrollene i myo-Grensesnittsystem. Tillat badekaret oppløsningen varmes gradvis til den når 36-37 ° C.
  10. Bruk XYZ justeringer av målet i DMT mikroskop når det er nødvendig for å holde fartøyet i fokus og legge til rette for nøyaktig sporing av lmanges i ytre fartøy diameter.
  11. Sjekk levedyktighet av montert fartøyet ved forbigående superfusjons (~ 30 sek) med 60 mM KCl. En levedyktig fartøy constricts raskt på tilsetning av KCl og dilates umiddelbart ved utvasking av de 60 mM KCl (superfuse ca 60 ml bad løsning for å vaske ut KCl). Etter denne testen, juster volumet av bad løsning til nøyaktig 10 ml. Temperaturen av badet reduseres under KCl testen og utvasking fordi disse løsningene er ved romtemperatur, men kammeret varmeapparatet vil gjenopprette temperaturen til 36-37 ° C i løpet av noen få minutter.
  12. Tillat arterien å ekvilibrere i minst 30 minutter (den diameter bør være stabile i minst den siste 10 min av denne periode). Tilsett konsentrert forsøksstoffet i badekaret løsningen direkte og pipetteres frem og tilbake forsiktig nær kantene av kammeret til blande forsøksstoffet i badekaret løsningen, hvilket gav den riktige endelige konsentrasjonen i 10 ml kammervolum. Changer i fartøyet diameter følgende tillegg av forsøksstoffet (s) kan overvåkes i live videobildet og også kartlagt i bildeanalyse vinduet mens eksperimentet pågår.
  13. Etter gjennomføringen av forsøket, kan de lagrede data (*. Myo-fil) åpnes som et regneark for videre analyse.

6. Representative resultater

Resultatene vist i figur 3 illustrerer typiske innspillinger av KV7 strømmene fra mesenteric arterien myocytes hjelp en spenning trinn protokollen før (Figur 3A, B Black spor) og under behandling med en KV7 kanals aktivator Zn pyrithione (ZnPyr, 100 nm; figur 3A, B røde spor). Lignende spenning trinn data fra tre celler ble midlet til å forberede dagens spenning (IV) plotter vist i Figur 3D. Et representativt tidsforløpet av forbedring av amplituden (målt ved kontinuerlig spenning klemmen ved -20 mV) during behandling med 100 nM Zn pyrithione er vist i figur 3C figur 4B illustrerer tidsforløpet av effekten av ZnPyr på mesenteric arterien ytterdiameter målt med press myography;. fartøyet var pre-innsnevret med 100 pM arginin vasopressin (AVP) før tilsetning av 100 nM ZnPyr. Gjennomsnittlig dose-respons-data for ZnPyr-indusert mesenteric arterien dilatasjon er vist i figur 4C.

Figur 1
Figur 1. Bilde av en mesenteric arkade i dissekere kammeret.

Figur 2
Figur 2. Bilde av en myocyte med en lapp pipette på overflaten.

Figur 3
Figur 3. Originale spor av KV7 strøm, tidsforløpet av narkotika søknad, IV kurver. A. Familie av sekvensielle dagens spor (nedre panel) tatt opp i respons til spenning trinn (topp panel) før behandling (kontroll, svart) og følgende stabilisering i nærvær av 100 nM ZnPyr (rød) i en enkelt MASMC. B. Representative nåværende spor fra A (som indikert av pilspisser) for kontroll (sort) og for 100 nM ZnPyr (rød). Grå søyler indikerer tidsintervall hvor gjennomsnittlig nåværende amplituder ble målt for strøm-spenning (IV) plotter. Trinn spenninger er angitt til høyre ved pilspisser. C. Tid løpet av KV7 nåværende forbedring med 100 nM ZnPyr målt med kontinuerlig spenning klemme ved -20 mV (bar). D. Gjennomsnitt IV kurver (n = 3) avledet fra KV7 strømtettheter registrert før (kontroll, fylte sirkler), ved behandling med 100 nM ZnPyr (åpne sirkler), og ved behandling med 10 uM XE991 (fylte trekanter). Uspesifikke lekkasjepunkter strømninger ble trukket som beskrevet av Passmore m.fl.. 1.

ent "> Figur 4
Figur 4. ZnPyr indusert avslapning av en mesenteric arterie pre-constricted med 100 pM AVP. A. Fotografi av en mesenteric arterie montert i trykket myograph oppsett. B. Tid løpet av endringer i ytre diameter av fartøyet som reaksjon på anvendelsen av 100 pM AVP (åpne bar) fulgt av påføring av 100 nM ZnPyr (fylt stolpe). C. baragraf sammenfatte resultater av 100 nM ZnPyr-indusert vasodilaion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder og eksperimentelle tilnærminger beskrevet her er ganske robust og kan produsere klare og reproduserbare resultater når den brukes med nitid oppmerksomhet på detaljer. Gode ​​elektrofysiologiske opptak og innsnevring / utvidelse av arterielle segmenter er avhengig av helsen av cellene og arterien segmenter, henholdsvis. Cell preparater kan variere fra dag til dag, selv ved hjelp av den samme protokoll. Isolation Solutions kan brukes i opptil to uker, men hvis kvaliteten på celleforberedelsen er lav på to påfølgende dager nye Isolation Solutions skal utarbeides. Vi har funnet at enzymaktivitet varierer fra parti til parti, og derfor isolasjon forhold (ganger av inkubering og konsentrasjoner av enzymer) krever optimalisering med hver ny batch av enzymer. Vi har også funnet at celleisolasjon protokollen beskrevet her for rotte mesenteric arterie er ikke optimal for andre vaskulære senger eller andre arter som kan ha en annen blanding eller hiligheten av ekstracellulære matrix komponenter. Hver vaskulær forberedelse krever sin egen optimalisering for å identifisere forhold som produserer de sunneste celler. Kriteriene som vi finner mest nyttig i å identifisere friske celler er: 1) cellemorfologi: glatt, avlang, men litt trange utseende etter triturating MA segmenter i Isolation Solution inneholder 50 uM Ca 2 +, og beholde samme utseende når de overføres til 2 mM Ca 2 +-holdige ekstern løsning. Ikke alle celler vil beholde sin nesten helt avslappet langstrakt form, men bare nesten helt avslappet myocytes bør brukes for elektrofysiologisk opptak, 2) Cellene må være optisk tett, noe som indikerer en intakt uskadet membran, 3) Hvilende membran spenninger av sunne myocytes pleide å registrert kaliumstrøm eller for nåværende-clamp opptak av membran spenning bør være mer negativ enn -40 mV (vanligvis i området fra -45 mV til -56 mV under ioniske betingelser described i vår protokoll her).

For å sikre vellykkede elektrofysiologiske opptak, bad løsning og pipetten løsning (for komposisjon se tabell 1) Det bør utarbeides på dagen av forsøket. Det er viktig å justere osmolalitet av både interne og bad løsninger for å være identiske (298-299 mOsm).

Isobariske arterielle funksjon målinger gjort i små arterier (<500 mikrometer) ved hjelp av press myography nærmere omtrentlig fysiologiske forhold enn gjør isometriske kraft målinger gjort ved hjelp av en wire myograph. Skipene i et trykk myograph er vanligvis mer følsomme for vasokonstriktor agonister 2-4, nærmere tilnærmet sensitiviteter målt i 5 vivo, 6. Økt følsomhet for lave konsentrasjoner av agonister har aktivert identifisering av signalformidling indusert av fysiologisk relevante picomolar konsentrasjoner av AVP7, 8.

Pressure myography bevarer geometrien av fartøyet og opprettholder integriteten av endotelet. Endothelium-medierte effekter av legemidler kan skilles fra glatte muskel-medierte effekter ved å gjennomføre parallelle målinger i intakt og endotel-denuded fartøy 9. Tilsiktet forstyrrelse av endotelet kan oppnås ved fysisk skade endotelet (f.eks ved å føre en menneskehår og tilbake gjennom hulrommet) eller ved perfusing luft gjennom hulrommet av arterien. Tapet av endotelial funksjon (men ikke vaskulær glatt muskelfunksjon) bør bekreftes ved å måle en redusert endotel-mediert vasodilator respons for acetylkolin i skip før constricted med en agonist 9.

Parallelle målinger av ioniske strøm / membran spenning i mesenteric artery myocytes med lapp klemme teknikker og arteriell innsnevring / utvidelse av mesenteric arteries ved hjelp av press myography kan aktivere klarlegging av rollene spesifikke ionekanaler i begge fysiologiske signaltransduksjon kaskader og i handlingene terapeutiske midler. Behandlinger er rettet mot grupper av ionekanaler eller spesifikke signaltransduksjon mellomprodukter kan brukes additivt eller i rekkefølge for å gi mekanistiske informasjon om rollene disse kanalene i reguleringen av myocyte funksjon på cellenivå og i innsnevring / utvidelse av intakte arterier. Konvergerende resultater av behandlinger som forsterker eller hemmer spesielle typer ioniske strømmer med tilsvarende effekter på arterie diameter gi mer pålitelige tolkninger enn kan oppnås ved hjelp av begge metoder i seg selv. Ideelt sett bør konsentrasjon-avhengighet av agenter under studien bestemmes i begge systemer. Å vurdere fysiologisk eller terapeutisk relevans, bør konsentrasjoner testet være relatert til konsentrasjoner målt i fysiologisk miljø or oppnådd med klinisk terapi. Eksempler på slike eksperimentelle tilnærminger kan bli funnet i våre tidligere publikasjoner 8-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) til KLB og pre-doktorgradsstipend fra American Heart Association (09PRE2260209) og Arthur J. Schmitt Foundation til BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Patch Clamp Technique. Kaneez, F. S. Intech. (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats