Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Yılanı / dilatör yanıtları (basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak) ölçümleri ile paralel izole arteriyel miyositler (yama elektrofizyolojik teknikler kelepçe kullanarak) KV7 (KCNQ) potasyum kanal aktivitenin ölçümleri vasküler düz kas fizyolojisi KV7 kanalları rolleri hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarmak ve olabilir farmakoloji.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Direnç arterlerinin duvarları içinde düz kas hücrelerinin kasılması ya da gevşeme arter çapı belirler ve böylece damar yoluyla kan akışını kontrol eder ve sistemik kan basıncını katkıda bulunur. Daralma süreci öncelikle iyon taşıyıcıları ve çeşitli kanallar tarafından kontrol sırayla olduğunu sitozolik kalsiyum konsantrasyonu ([Ca 2 +] cyt) tarafından düzenlenir. İyon kanalları vazokonstriksiyon veya vazodilatasyon etkisi için vazoaktif hormonların aktive sinyal transdüksiyon yollarının sık ara vardır. Ve iyon kanalları genellikle ya kasten terapötik ajanlar veya bilmeyerek (istenmeyen kardiyovasküler yan etkilere neden örneğin) (örneğin kalsiyum kanal blokerleri vazodilatasyon ve düşük kan basıncı ikna etmek için kullanılır) hedeflenir.

KV7 (KCNQ) voltaj bağımlı potasyum kanalları son zamanlarda önemli fizyolojik ve terapötik targı suçlanmışdüz kas kasılması düzenlenmesi için ets. Fizyolojik sinyal transdüksiyon hem de terapötik ajanların eylemleri KV7 kanal spesifik rolü aydınlatmak için, hem de dokunulmamış arter bağlamında etkisini değerlendirmek olarak etkinliğinin hücresel düzeyde modüle edilmektedir nasıl çalışma gerekir.

Sıçan mezenter arterleri kullanışlı bir model sistem sağlar. Arterler kolayca diseke bağ dokusu temizlenir ve yama kelepçe elektrofizyoloji için izole arteriyel miyositler hazırlamak için kullanılan veya kanüle ve nispeten fizyolojik koşullar altında vazokonstriktör / vazodilatör yanıtları ölçümleri için basınç olabilir. Burada ölçümler her iki tür için kullanılan yöntemleri açıklamak ve deneysel tasarım vasküler tonusun düzenlenmesinde bu iyon kanallarının rolleri net bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için entegre edilebilir nasıl bazı örnekler verir.

Protocol

1. Küçük Bağırsak Mezenterik Vasküler Arcade Cerrahi eksizyonu

  1. Inhalasyonunun izofluran ile 300-400 g Sprague-Dawley sıçan (% 4) anestetize.
  2. Ince barsak mezenter göstermek için bir orta hat laparotomi gerçekleştirin. Maruz kalan barsak ve mezenter travma önlemek için büyük özen ile karın kesiden küçük ve kalın bağırsak Exteriorize. Yavaşça steril gazlı bez üzerine mezenter dışarı havalandırın.
  3. Cerrahi tüketim çekum (dikkatlice kenarları boyunca ve arter / ven superior mezenterik birincil dallarından kökeni kesilir kan damarları) içeren ince bağırsak ve kalın bağırsağın bir kısmı,.
  4. Buz soğuk kesme çözeltisi (Tablo 1) ihtiva eden bir beher için eksize edilen doku aktarın.
  5. Anestezi altında iken bağırsak çıkarılmasının ardından, sıçan insanca ötenazi olmalıdır.

2. Diseksiyon birArterler d Temizleme

  1. Soğutmalı bir diseksiyon odasına eksize bağırsak ve mezenterik çarşı aktarın (4-5 ° C) diseksiyon solüsyon içeren. Oda kesme işaretçilerini yerleştirmek için bir Sylgard 184 elastomer bir tabanı olan bir 100 mm Petri kabı cam oluşur; Petri kabı, bir sirküle eden su banyosu ile 4-5 ° C 'de muhafaza edilmektedir soğutulmuş bir taban içine yerleştirilir.
  2. Cerrahi makas kullanarak bütün bağırsak üzerinden yaklaşık 10-12 cm segment kesim. Onun damar bağlı tutarak barsak segmentinin her iki ucunda kesin ve sonra izolasyon ekli damar (mezenterik çarşı) ile bir segment bırakarak odasından kullanılmayan bağırsak kaldırın.
  3. Arter / ven superior mezenterik birincil dal merkezi (Şekil-1) merkez ve şube yayar sonraki siparişlerde olduğunu böyle odasının yakınında yan üzerinde mezenter yayılan, ince bağırsak segmenti aşağı pin. Pl ace sadece barsak segmentlerinin (değil kan damarları üzerinde) işaretçilerine.
  4. Yerine damarlarında görülen U-biçimli dalları daha kendi nispeten parlak kırmızı renkli, kalın duvarlar ve karakteristik V şeklinde dalları ile damarlar arterler ayırt.
  5. Yakın mikro forseps ve makas kullanılarak bağırsak (Şekil 1'de kesikli daire) 4 inci mertebeden arterler - dikkatle yağ dokusu ve 2 nci çevreleyen bağ dokusu temizlemek, bir ışıklı mikroskop aracılığıyla görselleştirme. Komşu damarlar Holding yağ dokusu ve bağ dokusu takas kolaylaştırır. Gereksiz arterlerin germe kaçının.
  6. Bağ dokusu temizlenir Mezenterik arter segmentlerinde sonra dışarı disseke ve hücre izolasyonu için kullanılan (tek hücreli yama kelepçe çalışmaları için, Bölüm 3-4) veya basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi (Bölüm 5) için kanüle edilebilir. Genellikle yukarı uzunluğu 1 cm, dal noktaları arasındaki segmentler kesin.
Patch Clamp Araştırmaları jove_title "> 3. Hücre İzolasyonu

  1. İzolasyon Çözüm 0,5 L (Tablo 1) hazırlayın ve pH ayarlamadan önce 2 parçaya bölün. Birinci kısım (genellikle 100 ml) 37 C'ye kadar ısıtılan olmalıdır ° C ve pH 7,2, 37 olacak şekilde ayarlanmalıdır ° C (37 ° C Yalıtım Çözeltisi). İzolasyon Çözüm ikinci kısım ° C ve pH 4 ° C'de (buz soğuk izolasyonu çözelti) 7.2 olacak şekilde ayarlanmalıdır 4 aşağı soğutulması gerekmektedir. PH ayarlama yapıldıktan sonra, bu solüsyonlar osmolaritesi D-glikoz veya H 2 O. uygun bir miktarda eklenmesi ile 298 mOsm uyumlu hale getirilmesi gerekir
  2. 2 37 ml ° adım 3.4 kullanılmak için 37 ° C sıcaklıkta bir cam şişeye ile inkübe C Yalıtım çözelti. Aktarma 37 10 ml (BSA), sığır serum albümini, 20 mg ekleme ° C İzolasyon Çözelti, çözünmesi, 37 yeniden sıcak ° C'de ve pH değeri 7.2 'ye yeniden ayarlamak. Bu çözeltiye, 2 ml ile 4 mg Kollajenaz tip VIII (Sigma, Lot 089K8612 eklemek: 633 unit / mg Kollajenaz aktivitesi, 285 birim / mg Caseinase aktivitesi, 1.6 birim / mg Clostripain aktivite), 0.64 mg elastaz tip IV (Sigma, Lot 110M7025V 5.9 birim / mg, 37 hazırlanmış olan bir 16 mg / ml stok, 40 ul ekle ° C Yalıtım Çözüm) ve 1 2 ul M DL-ditiyotretol (DTT Sigma); 37 öncesi ılık Bu Enzim Çözüm ° C adım 3.5 için hazırlık.
  3. Buz Soğuk İzolasyon Çözüm ve buz üzerinde yer çanak 2 ml'lik 35 mm doku kültürü çanak içine mezenterik arterin 2-3 segmentleri aktarın. 3-4 mm uzunluğundaki parçalara mezenterik arter segmentlerinde kesin.
  4. Ateş cilalı uçlu bir Pastör pipeti kullanarak (damar zarar vermesini engellemek için) önceden ısıtılmış 37 içeren 2 ml bir cam şişeye (15 x 45 mm, 1 dram) içine arterlerin aktarmak 37 ° de 30 dakika süreyle C Yalıtım Çözelti ve inkübe ° C.
  5. 30 dakika sonra, dikkatli bir Pasteur pipeti kullanarak, 37 ° C Yalıtım aspire Çözelti, 35 dakika için 2 ml sıcak enzim çözeltisi ile inkübe eklemek37 ° C'de
  6. Hemen enzim çözeltisi içinde 35 dakika inkübasyondan sonra, buz üzerinde flakon yerleştirin enzim solüsyonu aspire ve Ice Cold İzolasyonu Çözümü (tekrar aspirasyon ve taze Buz Soğuk İzolasyon Çözüm ilavesiyle 4 kez) 2 ml ekleyin. Sonra, Buz Soğuk İzolasyon Çözüm 1 ml hacminde, hafifçe bireysel mezenterik arter düz kas hücreleri (MASMCs) serbest bırakmak için cilalanmış Pasteur pipeti 10-20 kez arter segmentleri çiğnemek.
  7. Periyodik olarak 35 mm çanak hücre süspansiyonu bir damla koyarak ve bir mikroskop altında görüntüleyerek miyositler görünümünü doğrulayın. Sağlıklı MASMCs pürüzsüz bir uzun bir görünüme sahip olmalıdır. Arter duvarındaki hücrelerin tümü çıkacak değil. Hücre süspansiyonu buz üzerinde tutulmalıdır.
  8. MASMC sağlık diğer kullanışlı gösterge fizyolojik Ca 2 + konsantrasyonları hoşgörü olduğunu. Banyo s ile kayıt odasına (# Bioscience Araçlar, CSC-25L) doldurun2 mM CaCl2 (oda sıcaklığında (RT) pH 7.3, bileşimi için Tablo 1'e bakınız) ve pozisyon agar köprüsü (bükülmüş cam (Warner Enstrüman, REF referans elektrot takılı, 2 M KCl% 2 agar ile dolu kılcal içeren olution Odanın iç-3L)). Cilalı Pastör pipeti kullanarak, bir kayıt oda için yaklaşık 100-200 ul hücre süspansiyonu aktarmak ve hücreler 15 dakika boyunca uymak için izin verir. Hasar görmemiş hücreler, 2 mM önemli ölçüde sözleşme olmamalıdır CaCl2 içeren bir çözelti (hücreler, uzatılmış ya da çubuk şeklinde görünen toplar halinde yuvarlanmış olmamalıdır).
  9. Banyo çözeltisi 0.25 ml, 2 mM içeren kayıt odasına hücre süspansiyonu birinci kısım ilave edildikten sonra, CaCl2 hücre süspansiyonu geri kalan hacim ilave edilmelidir. Bu geriye kalan hücre süspansiyonu buz üzerinde bu çözelti içinde muhafaza edilmekte ve en fazla 6 saat için yama kelepçe kayıt için de kullanılabilir.

4.KV7 Potasyum Akımlar veya Membran Gerilim Tedbir Tüm Cep Patch Kelepçe kullanımı

  1. Myocytes kayıt bölmesinin (25 mm No: 1 boyunca kapak slipi, Warner Instruments) bir cam taban uygun sonra, banyo solüsyonu (Tablo 1) sürekli perfüzyon başlatır. Kv1 ve KV2 ailelerin gecikmiş doğrultucu potasyum akımlarından izole KV7 akımların kayıt için, banyo solüsyonu 100 mcM GdCl 3 ile takviye edilmelidir.
  2. Bir pipet çektirmesi ve microforge kullanarak borosilikat cam (Kimax-51, Kimble Chase) bir yama pipet Fabrikasyona; iç çözüm (Tablo 1) ile dolu zaman onun direnci MΩ 4-5 olmalıdır. Coat Sylgard 184 ile pipet (ucu yukarıda ~ 1-2 mm) 1/3 alt.
  3. MASMCs içinde KV7 akımların kayıt için, delikli yama tüm hücre voltaj kelepçesi yöntem kullanılmalıdır. Bir delikli konfigürasyonu yama kullanılması depletio önlemeye yardımcı olurmembran fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP 2) ve ardından hızlı (5 dakika içinde) sık konvansiyonel rüptüre yama yapılandırma kullanarak görülmektedir KV7 akımların yıkık n. 120 ug / ml amfoterisin B ile iç çözelti (Tablo 1) ek: iç çözeltinin 0.5 ml amfoterisin B ve 2 mg / ml stok 3 ul (DMSO içinde hazırlanır ve küçük alikots içinde dondurulur ve ışıktan koruyarak muhafaza) ekleyin. Amfoterisin B-serbest iç çözelti içinde pipet ucu ile daldırma sonra boru parçası (Tygon R-üzerinden bağlanmış bir 10 ml'lik şırınga ile diğer uç üzerine, emme uygulayarak Amfoterisin B-serbest iç çözelti ile yama pipet ucu Dolgu 3603). Pipet yaklaşık yarısı solüsyonu ile doldurulur kadar bir Eppendorf Microloader Pipet İpucu kullanarak üstten Amfoterisin B içeren pipet çözüm ekleyin. Yavaşça pipet dokunarak herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. Hemen pipet kullanın.
  4. Içinde pipet takınelektrot tutucu ve bir ince uzun miyosit (yakındır, ancak çekirdek, Şekil 2'nin üst) yüzeyine pipet düşürmek için bir mikromanipülatör kullanır. Pipet direnci MΩ 6-10 artar, bir giga-conta (> 10 GΩ) elde etmek için emme geçerlidir.
  5. Membran perforasyonu beklerken 0 mV gerilim tutarak ayarlayın. 100 ms gerilimi +10 mV adımlar ve daha sonra -10 mV uygulayın ve hızlı pipet kapasitans geçici telafi etmek için amplifikatör kullanın. Tüm hücre kapasitansı geçici, küçük sürdürülen olumlu akımları (genellikle 2-10 pA) ortaya çıkması ile Eşzamanlı fonksiyonel KV7 kanallarının varlığına işaret edecektir.
  6. Amfoterisin B ile başarılı perforasyon MΩ 35 veya daha az erişim direncini düşürecektir. Geçerli kayıt ardından -4 mV tutma geriliminden 5 sn voltaj adımı protokolü kullanılarak başlatılabilir. Biz gecikmeli rec diğer türleri maksimal inaktivasyon yakınındaki ulaşmak için -4 mV tutarak gerilim kullanınaksi nispeten küçük olmayan etkisiz KV7 akımların kayıt kontamine olur tanımı olmaz potasyum akımları (Kv1 ve KV2 kanalları tarafından ağırlıklı olarak aracılık). Uzun (5 sn) gerilim adım protokolü yavaş voltaj bağımlı aktivasyonu ve deaktivasyonu gösterirler KV7 kanalları, kararlı durum aktivasyonu sağlamak için gereklidir. KV7 akımlar sürekli gerilim adımları sırasında inaktive yok.
  7. KV7 akım-gerilim (IV) ilişkiyi kaydetmek için, KV7 kanallarının açık ihtimali ulaştığı +16 mV, KV7 kanallarının açık olasılığı az olan az -84 mV arasında değişen gerilimler için 5 sn voltaj adımları uygulayın plato; 5 saniye sonra her test gerilimi, geri 10 saniye tutarak gerilimi (-4 mV) adım. Bu test darbelerinin (Şekil 3A) tam serisi için yaklaşık 3,5 dakika sürer. Kaydedilen akımları zamanla stabil olduğundan emin olmak için 2-3 kontrolü IV kayıtları yapın. Plot ortalama uçtan puls akımları (ortalamason 1 saniye kaydedilen akımlar) karşı gerilim IV eğrisi (Şekil 3B) oluşturmak için. Akımlar kararlı ise kontrol IV eğrileri yaklaşık olarak üst üste olmalıdır.
  8. Uygulamadan önce herhangi bir farmakolojik ajanlar sürekli -20 mV akım kaydetmek için tasarlanmış bir zaman süreci protokolü başlatmak. Ilaç uygulamasından önce en az 5 dakika boyunca stabil kayıt akım sağlanması. 5-15 dakika veya kararlı durum (Şekil 3C) elde edilene kadar farmakolojik ajanlar uygulayın; ardından zaman ders protokolü ve rekor gerilim adım protokolü kullanarak iki IV eğrileri feshedebilir. Ilaç Solukluk ve iki ek IV eğrileri kayıt takip ilaçtan arındırma sırasında ders kaydedin.
  9. Deney sonunda 10 uM linopirdine veya 10 uM XE991, KV7 kanalları tersinmez inhibitörleridir geçerlidir; bu ilaçların tam -20 mV (Şekil 3B) için negatif voltajlar kaydedilen akımlar engellemelidir.

5. Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi için Bozulmamış Arter Bölümleri kullanın

  1. Danimarka Myo Technology (DMT, A / S, Danimarka, Model 110P) satın alınan bir basınç myograph sistem basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi deney için kullanılmıştır. Bir ucu ve diğer ucu içine taşınabilir kanülle içine doğru cam sol yatay olarak sabit cam kanül yerleştirilerek paslanmaz çelik hazne içinde arter segmenti monte edin. İki basınç dönüştürücüleri (sol tarafta sağ ve P2 P1) arter lümeninde basıncını izlemek için inşa edilir. Sağ cam kanül aracılığı ile yaklaşık fizyolojik sıvı seviyesine arter içindeki basıncı ayarlamak için kullanılır. Başlamak için, lümen solüsyon (Tablo 1), açık bir 10 ml şırınga (bir ağırlık besleme basıncını sütun olarak hizmet) ön doldurun. Solu itmek şırınga Raisetüp veya kanül hava kabarcıkları önlemek için dikkat çekici sağ cam kanül içine polietilen boru aracılığıyla tion. Sol kanül bir 1 ml şırınga yoluyla lümen çözelti ile önceden doldurulur. Damar banyo solüsyonu (Tablo 1) 10 ml myograph basınç odasına doldurun. Gevşekçe cam kanüller bitişik her iki tarafında iki önceden yapılmış ince naylon ipliklerle askıya.
  2. Mikro kullanarak segmentinde bir ucuna tutarak basınç myograph odasına diseksiyon odasından; - dikkatle disseke mezenterik arter segmenti (adım 2.6 'dan çapı 350 mikron, genellikle 200 civarında bir 3. veya 4. sipariş segment) aktarmak forseps.
  3. Işıklı mikroskop aracılığıyla görselleştirme, arter segmentinde bir ucunda tutun ve yavaşça sola cam kanül üzerinde kaydırın ve naylon sütürler kullanarak sonuna sabitleyin. Yavaşça damar içinde kan ve enkaz kaldırmak için monte damar yoluyla lümeni sıvı yıkayın.Sol şırınga ile valf sonra bu yan basınç sağ taraftan ayarlandığı karşı sıvının bir statik sütun sunulur, böylece kapalı olmalıdır.
  4. Sonunda naylon sütürler ile sabitleyerek, hareketli sağ cam kanül arter segmenti yakın ve üzerinde segmentinin sağ ucunu çekin mikromanipülatör, konumunu kullanarak. Aşırı sütür konuları kapalı Clip.
  5. Basınç myograph mikroskop üzerindeki sahnede basınç myograph monte edin. Myograph basınç odası üzerinde kapağı yerleştirin. Bölmesi için kapak superfusion giriş ve buna bağlı emme borusu içerir. Oda sıcaklığında banyo veya yerçekimi tarafından basınç myograph odasına 60 mM KCl çözeltisi superfusion izin veren bir manifolda superfusion girişi bağlayın. Bu tür KV7 kanal işlevini etkileyen yama kelepçe ölçümleri bulunan ilaçlar ya da hormonlar gibi Test maddeleri, genel olarak değil destek banyo yoluyla, banyo çözeltisi doğrudan uygulanırerfusion veya lümen çözüm. Banyo çözeltisi superfusion KCl çözeltisi yıkamak için kullanılır. Aşırı superfusate kaldırmak için bir vakum sistemi için emme borusu takın. Myograph haznesi kapak içinde temin açıklıktan banyo çözeltisine sıcaklık sensörü yerleştirin.
  6. Myo-arayüz sistemine basınç myograph ünitesi, myoview yazılımı (DMT) için myograph biriminin iletişimi sağlayan donanım bağlayın.
  7. Bilgisayar myoview yazılımını açın. Parametre penceresinde, 1 'lik bir sıcaklık toleransı ile 35 ° C olarak hedef sıcaklık ° C, 80 mmHg ve 80 mmHg gibi hedef çıkış basıncı gibi hedef girişi basıncı. Kalibrasyon dosyasını yükleyin ve arter çapı değişiklikleri mikron doğru kaydedilmiş, böylece damar dış çapı kalibre. Arka plana karşı monte segmentinde iyi bir görünüm sağlamak için gerektiği kadar kontrastı ayarlayın. Yazılımın nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı bir açıklamaDMT gelen kılavuzdaki sağlanır.
  8. P1 basınç dönüştürücü 80 mmHg okuyana kadar kademeli olarak 15 dakikalık bir süre içinde 10 ml şırınga (bir ağırlık besleme basıncını sütun olarak hizmet) kaldırın. Basınçlı kolon yükselterek ederken, geminin herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Herhangi bir sızıntı varsa, segmentinde atın ve (5.2 adımları tekrarlayın) başka bir arter segmenti bağlamak. Kanüller gerektiğinde arasındaki mesafeyi ayarlayın. Mesafe basınçlı arter segmenti yaklaşık olarak düz (ancak gergin değil) ve bağları (Şekil 4A) yapılmıştır-desen gibi bir omuz oluşturan bu tür bir şekilde ayarlanması gerekmektedir.
  9. Myo-arayüz sistemi denetimleri ile basınç myograph odasının ısıtma açın. Bunu 36-37 ° C ulaşıncaya kadar banyo solüsyonu yavaş yavaş ısınmasını bekleyin
  10. DMT mikroskop objektif XYZ ayarlamaları kullanın zaman odak damar tutmak ve ch doğru izleme kolaylaştırmak için gerekliDış damar çapı anges.
  11. 60 mM KCl ile geçici superfusion (~ 30 sn) tarafından monte geminin canlılığı kontrol edin. Bir canlı damar KCl Ayrıca hızla daralır ve 60 mM KCl (KCl dışarı yıkamak için banyo solüsyonu yaklaşık 60 ml superfuse) arasında arınma üzerine derhal gevşetir. Bu testten sonra tam olarak 10 ml banyo çözeltisi hacmi yeniden ayarlamak. Bu çözümler oda sıcaklığında, ancak oda ısıtıcı bir kaç dakika içinde 36-37 ° C sıcaklıkta geri çünkü banyosunun sıcaklığı KCl deney ile yıkanması sırasında azalır.
  12. Arter en az 30 dk (çap bu sürenin en azından son 10 dakika boyunca sabit olması gerekir) için denge sağlaması için izin verin. Doğrudan doğruya banyo çözeltisine konsantre test maddesi eklenir ve 10 ml hacim içinde oda uygun nihai konsantrasyon verimli, banyo çözeltisi içinde test maddesi ile karıştırmak odasının kenarlarına yakın hafifçe ileri geri pipetle. ChanTest madde (ler) in damar çapı aşağıdaki ek olarak ges canlı video görüntüsü olarak izlenir ve deney yapılırken aynı zamanda görüntü analiz penceresi içinde charted olabilir.
  13. Deneyin tamamlanmasından sonra, saklanan verilerin (*. Miyo) dosya daha ileri analiz için bir elektronik dosya açılabilir.

6. Temsilcisi sonuçları

Şekil 3A, B, Şekil 3'te gösterilen sonuçlar, bir KV7 kanalı aktivatörü çinko piritiyon (ZnPyr, 100 nM ile tedaviden önce (Şekil 3A, B siyah izleri) ve bir voltaj adımı sırasında protokolü kullanarak mezenterik arter miyositlerden KV7 akımı tipik kayıtları örneklemek kırmızı izleri). 3 hücrelerin benzer voltaj adımı veriler Şekil 3B de gösterilen akım-voltaj (IV) parselleri hazırlamak için ortalamaları alınmıştır. Geçerli genliği geliştirilmesi temsilcisi zaman ders (-20 mV sürekli gerilim kelepçe ile ölçülen) Durin100 nM çinko piritiyon ile muamele g Şekil 3C 'de gösterilmiştir Şekil 4B basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi ile ölçüldü mezenter arter çapı üzerinde ZnPyr etkisinin zaman süreci gösterir;. damar 100 pM nörohormonal (AVP) ile ön-dar olduğu önce 100 nM ZnPyr eklenmesi. ZnPyr ile endüklenen mezenter arter genişleme için ortalama doz-yanıt verilerini Şekil 4c 'de gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Diseksiyon odasında bir mezenter çarşı resmi.

Şekil 2,
Şekil 2. Yüzeyinde bir yama pipet ile miyosit resmi.

Şekil 3
KV7 akımlar, uyuşturucu zaman tabii Şekil 3. Orijinal izleri Uygulama, IV eğrileri. Tedavi öncesi gerilim adım (üst panel) (kontrol, siyah) ve tek bir MASMC içinde 100 nM ZnPyr (kırmızı) varlığında aşağıdaki stabilizasyon yanıt olarak kaydedilmiş ardışık akımı iz (alt panel) A. ailesi. B. Örnek akım izleri kontrol (siyah) ve 100 nM ZnPyr (kırmızı) için A (olarak ok başları ile gösterilir). Gri çubuklar ortalamalı akım genliklerinin akım-gerilim (IV) parsel için ölçüldü zaman aralığını gösterir. Adım gerilimleri ok uçları ile sağ tarafta gösterilir. 100 nM ZnPyr tarafından KV7 mevcut donanımın C. Zaman kursu -20 mV (bar) sürekli gerilim kelepçe ile ölçülür. KV7 akım yoğunlukları elde D. Ortalama IV eğrileri (n = 3) 100 nM ZnPyr (açık daireler), tedavi sırasında ve 10 uM XE991 (dolu üçgenler) ile tedavi sırasında, (kontrol, dolu daireler) önce kaydedildi. Non-spesifik kaçak akımlar Passmore ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi çıkartılmıştır. 1.

ent "> Şekil 4,
Şekil 4. 100 pM AVP önceden daralmış bir mezenterik arter ZnPyr bağlı gevşeme. Bir mezenterik arter A. Fotoğraf set-up baskı myograph monte. 100 nM ZnPyr (dolu çubuk) bir uygulaması takip 100 pM AVP (açık çubuk) uygulama yanıt olarak kabın dış çap değişiklikleri B. Zaman ders. C. Çubuk grafiği 100 nM ZnPyr indüklenen vasodilaion sonuçlarını özetleyen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan yöntemler ve deneysel yaklaşımlar oldukça sağlam ve titiz ile uygulandığında net ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilir. İyi elektrofizyolojik kayıtlar ve daralma / arterlerin dilatasyon sırasıyla hücreler ve arter segmentinin sağlığına bağlıdır. Hücre hazırlıklar hatta aynı protokolü kullanarak, günden güne değişebilir. İzolasyon Solutions en fazla 2 hafta için kullanılabilir, fakat hücre hazırlama kalitesi iki takip eden günlerde düşük ise yeni izolasyon çözüm hazırlanmalıdır. Bu enzim aktiviteleri enzimlerin her yeni partisi ile optimizasyon gerektiren partiden partiye ve bu nedenle izolasyon koşulları (inkübasyon süreleri ve enzim konsantrasyonu) ile farklılık olduğunu bulduk. Biz de sıçan mezenter arter için burada açıklanan hücre izolasyonu protokolü farklı bir karışımı veya dens olabilecek diğer vasküler yatak veya diğer türler için uygun olmadığını buldukekstraselüler matriks elemanlarının ity. Her vasküler hazırlık sağlıklı hücreler üretmek koşullar tanımlamak için kendi optimizasyon gerektirir. Sağlıklı hücrelerin tanımlanmasında en yararlı bulduğunuz kriterler şunlardır: 1) hücre morfolojisi: 2 transfer yaparken +, ve aynı görünüm istinat 50 mcM Ca 2 içeren İzolasyonu Çözümü MA segmentleri triturating sonra, pürüzsüz uzamış, ama biraz dar bir görünüm mM Ca2 +-içeren harici bir çözümdür. Tüm hücreler neredeyse tamamen rahat uzatılmış şekli muhafaza eder, ancak sadece neredeyse tamamen rahat miyositler elektrofizyolojik kayıt için kullanılmalıdır; 2) Hücreler intakt hasarsız membran belirtir, optik yoğun olmalıdır; 3) Sağlıklı miyositlerin İstirahat membran gerilimler için kullanılır kayıt potasyum akımı ya da membran voltaj-clamp kayıtları akım için (genellikle iyonik koşullar des altında -56 mV ile -45 mV arasındadır -40 mV daha fazla negatif olması gerekir) burada bizim protokol tanınmaktadır.

Başarılı elektrofizyolojik kayıtları, banyo çözeltisi ve pipet çözeltisi (bileşimi için Tablo 1) deney gününde hazırlanması gerekmektedir. Sağlamak için O (298-299 mOsm) aynı olması için iç ve banyo çözümleri osmolalitesi ayarlamak çok önemlidir.

Daha yakından yaklaşık izometrik kuvvet ölçümleri yapmak daha fizyolojik koşullarda basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak küçük arter (<500 mikron) yapılan Isobaric arteriyel fonksiyon ölçümleri bir tel myograph kullanılarak yapılır. Bir basınç myograph içinde gemiler genellikle daha yakından vivo 5, 6 ölçülen hassasiyetleri yaklaşıldığıdır vazokonstriktör agonistleri 2-4, daha duyarlıdır. Agonistlerinin düşük konsantrasyonda artmış duyarlılık AVP arasında önemli fizyolojik picomolar konsantrasyonları ile tetiklenen sinyal iletim mekanizmalarının belirlenmesi sağladı7, 8.

Basınçlı kap kasılmaların kâğıda çizilmesi geometrisi koruyan ve endotelyumun bütünlüğünü korur. Ilaçların endotel aracılı etkiler bozulmamış ve endotel çıplaklaşmış gemileri 9 paralel ölçümleri yaparak düz kas-aracılı etkiler ayırt edilebilir. Endotel kasten bozulması fiziksel endotel (lümen yoluyla ileri ve geri bir insan saç geçirerek örneğin) zarar veya arterin lümeni havayı perfüze gerçekleştirilebilir. Endotel fonksiyonu (ancak vasküler olmayan düz kas fonksiyonu) kaybı agonist 9 ile ön-dar damarlarda asetilkolin azalmış endotel aracılı vazodilatör yanıtı ölçerek teyit edilmelidir.

Yama klemp teknikleri ve arteriyel daralma / mezenter arteri dilatasyon kullanarak mezenterik arter miyositlerde iyonik akımların / membran gerilimi paralel ölçümleribasıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak es fizyolojik sinyal transdüksiyon kaskadlar hem de terapötik ajanların eylemleri belirli iyon kanallarının rollerinin aydınlatılması etkinleştirebilirsiniz. Iyon kanallarını veya spesifik sinyal iletimi ara belirli sınıfları hedefleme Tedaviler hücresel düzeyde miyosit fonksiyonunun düzenlenmesinde ve daralma / sağlam arterlerde dilatasyon bu kanalların rolleri hakkında mekanik bilgi sağlamak için aditif veya sırayla uygulanabilir. Arter çapına karşılık gelen etkiler ile iyonik akımların belirli türleri geliştirmek veya inhibe tedavilerin Yakınsak sonuçları kendisi tarafından iki yöntemi kullanarak elde edilebilecek olandan daha güvenilir yorumlama sağlar. İdeal olarak, üzerinde çalışılan ajanlar konsantrasyon-bağımlı iki sistemde de tespit edilmelidir. Fizyolojik ya da terapötik uygunluk değerlendirmek için, test edilen konsantrasyonlarda fizyolojik ortamda o ölçülen konsantrasyonları ile ilgili olmalıdırr klinik tedaviler ile elde. Deneysel yaklaşım, bu tür örnekleri önceki yayınlarda 8-10 de bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Bu çalışma KLB ve Amerikan Kalp Derneği (09PRE2260209) ve BKM Arthur J. Schmitt Vakfı'ndan doktora öncesi burslar için Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NIH R01-HL089564) bir hibe ile finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Patch Clamp Technique. Kaneez, F. S. Intech. (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics