SNARE蛋白介导的膜融合酶的细胞融合含量的分析

Biology

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Summary

我们已经开发出一种量化SNARE介导膜融合事件由激活的β-半乳糖苷酶的表达的细胞融合实验。

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Hasan, N., Humphrey, D., Riggs, K., Hu, C. Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay. J. Vis. Exp. (68), e4378, doi:10.3791/4378 (2012).

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Abstract

T-SNARE蛋白的相互作用的SNARE(oluble N-乙基马来酰亚胺敏感因子一个的重整 ttachment蛋白受体)的目标膜蛋白在囊泡(V-SNARE蛋白)和()催化细胞内的囊泡融合1-4。重组分析是必不可少的解剖机制和调节SNARE蛋白介导的膜融合5。在细胞融合实验6,7中 ,异位SNARE蛋白表达在细胞表面。这些“翻转”SNARE蛋白驱动细胞与细胞融合,展示,网罗足够细胞膜融合。由于测定是基于微观分析的细胞融合,它是低效率的,使用时,多个的v-叔SNARE相互作用定量分析。

在这里,我们描述了一种新的检测的量化β-半乳糖苷酶的活性表达的SNARE蛋白介导的细胞融合。二在Tet-关基因表达系统9的组件被用作读出系统:四环素控制的反式激活(tTA的)和四环素反应元件(TRE-LacZ的)的控制下,编码的LacZ基因的报道质粒。我们tTA的转染到COS-7细胞表达翻转的v-SNARE蛋白在细胞表面(的v-细胞)和TRE-LacZ基因转染到COS-7细胞表达翻转叔SNARE蛋白在细胞表面(t细胞) 。 SNAP-依赖的融合的v-和T-细胞的查询结果中的结合的tTA的TRE,LacZ和β-半乳糖苷酶的表达的转录激活。 β-半乳糖苷酶的活性,使用的比色的方法通过在420 nm处的吸光度进行定量。

囊泡相关膜蛋白(VAMPS),是V-SNARE蛋白驻留在不同的后高尔基体泡状车厢10-15。鞋面1,3,4,5,7和8,在相同的水平表达,我们比较了它们的膜融合活动中使用的酶的细胞融合实验。基于光谱测量,该法提供了一个量化的方法分析SNARE蛋白介导的膜融合,为高通量研究。

Protocol

1。细胞培养和转染

  1. 补充与4.5克/升葡萄糖和10%牛胎儿血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)中培养COS-7细胞。
  2. 根据制造商的说明(Invitrogen公司),与Lipofectamine质粒转染。

2。 SNARE细胞表面表达的荧光显微分析

  1. 转染前一天,3×10 4个 COS-7细胞接种在无菌的12毫米的盖玻片(Fisher Scientific)的24孔培养板中所载。
  2. 对于v-细胞,在各孔中,0.25微克,编码tTA的质粒(pTet-关闭,CLONTECH公司)共转染的质粒表达翻转VAMPS用0.25微克。
  3. 0.25微克的质粒编码TRE-LacZ的(的pBI-G,CLONTECH公司)对于t在每个孔中的细胞,用0.25微克表示翻转SNAP-25和syntaxins 1或4的每一个的质粒共转染。
  4. 24小时后T转染的,固定细胞,用4%的多聚甲醛(PBS补充有0.1克/升CaCl 2和0.1克/升的MgCl 2)10分钟,然后在10%FBS的在PBS中的阻塞,在PBS + + + + 30分钟。
  5. 与抗Myc单克隆抗体9E10(纯的杂交瘤培养上清液),将细胞温育1.5小时。
  6. PBS + +洗涤四次后,将细胞温育1小时,在1:500稀释的FITC标记的二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)。
  7. 洗涤四次后用PBS + +,标记的细胞被安装在延长Gold抗淬灭试剂(Invitrogen)。
  8. 共聚焦图像采集的奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜。与Adobe Photoshop软件处理图像。

3。流式细胞仪检测细胞表面SNARE表达

  1. 转染前一天,2×10 5 COS-7细胞接种于6孔培养板的各孔中。
  2. 24小时后,TRAnsfection与翻转圈套,pTet-Off和的pBI-G质粒,细胞被固定,用1%多聚甲醛的PBS + +的15分钟,然后在10%FBS在PBS + + 15分钟中断。
  3. 将细胞孵育60分钟抗Myc单克隆抗体9E10。
  4. 洗涤三次后,用PBS + +中,被标记细胞用FITC标记的二次抗体(1:200稀释),45分钟。
  5. 用PBS洗涤三次后,+ +,将细胞刮下板,用细胞刮刀破碎。
  6. 使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences公司),分析了15,000个细胞。使用CellQuest Pro软件得到各样品的平均荧光强度。

4。酶细胞融合含量

  1. 转染前一天,1.2×10 6个 COS-7细胞接种于每100毫米的组织培养皿中,和2×10 5 COS-7细胞接种于6孔培养板的各孔中。
  2. 对于v-细胞,0.5 - 5微克每个flipp编辑VAMP质粒共转染pTet关闭到每100毫米的培养皿中的细胞用5μg。控制细胞转染空载体pcDNA3.1(+)和pTet关闭。为了防止鞋面1,4,5,7和8,衣霉素的N-糖基化的(10微克/毫升)被包括在转染细胞培养基中。
  3. 对于t-细胞的6孔培养板的各孔中,1微克翻转SNAP-25质粒的pBI-G的共转染0.5μg的翻转的翻转syntaxin4质粒syntaxin1质粒或0.05微克。
  4. 转染后24小时,培养皿与酶的无细胞解离缓冲液(Invitrogen)中的v-细胞脱离。剥离的细胞,用血细胞计数器计数,并再悬浮在HEPES缓冲的DMEM培养液含10%FBS,6.7微克/毫升衣霉素和0.67 1mM DTT的。
  5. 4.8×10 5再悬浮的v-细胞被添加到每个孔中已经含有的t-细胞。
  6. 6,第12或24小时后的大鼠37℃,在5%CO 2的
  7. 90分钟后,停止显色反应,通过加入1M碳酸钠。
  8. 在420 nm处的吸光度测量采用日立100-40分光光度计。

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Representative Results

要制定一个定量的细胞融合实验,我们利用强有力的转录激活TTA到TRE的结合。在tTA的的情况下,转录 LacZ基因在TRE-LacZ的是无声的。 tTA的存在时,它的TRE结合并激活 LacZ基因的转录, 图1示出了流程图的酶的细胞融合实验。 tTA的转染到v-细胞表达的v-SNARE蛋白在细胞表面,和TRE-LacZ基因转染到t细胞,在细胞表面的表达叔SNARE蛋白。的v-和T-细胞的查询结果中的结合的tTA的TRE LacZ基因的转录活化和β-半乳糖苷酶的表达的融合。

图2A示出的结构域结构的翻转SNARE构造。的preprolactin信号序列的N-末端的SNAREs融合。这些工程SNARE蛋白被称为“翻转”斯耐尔因为其SNARE图案的取向对细胞膜被翻转。当与翻转SNARE质粒转染COS-7细胞时,翻转SNARE蛋白表达在细胞表面( 图2B)。流式细胞仪是用来测量SNARE蛋白的表达水平在细胞表面( 图2C和D)。为了比较它们的膜融合能力,鞋面需要表示在同一水平。因此,我们滴定的和优化的浓度每个翻转SNARE质粒中使用转染。翻转SNARE质粒转染在下列浓度(每10cm 2的增长领域, ,在6孔培养板每孔):VAMP1,0.2微克; VAMP3,含0.5μg; VAMP4,含0.5μg; VAMP5,0.05微克; VAMP7 1.0微克; VAMP8,0.1微克; syntaxin1,含0.5μg; syntaxin4,0.05微克。共转染TTA,TRE-LacZ和翻转SNAP-25在1微克每10平方厘米的增长领域。在SUCĤ条件,鞋面1,3,4,5,7和8是表示在相同的水平,而syntaxins 1和图4表示在同一水平在细胞表面( 图2D)。正如所示的共聚焦,相位相反的图像分析( 图2E),80%的COS-7细胞的转染与翻转SNARE质粒。双重标记成像分析( 图2F)表明,70%的转染的v-细胞同时表达tTA的和翻转VAMP蛋白质。由于在TRE-LacZLacZ基因不表达在细胞融合之前,我们不能够确定同时表达TRE-LacZ和翻转叔SNARE蛋白的转染的T细胞的百分比。

神经元斯耐尔(的v-SNARE VAMP2,和叔 - 斯耐尔syntaxin1和SNAP-25)介导突触胞吐作用的用于测试的测定法的可行性。事实上,当v-细胞表达VAMP2和t-细胞表达syntaxin1/SNAP-25相结合,鲁棒的β-半乳tosidase检测到表达( 图3)。然而,不表达时,无论VAMP2或SNAP-25,仅基线的β-半乳糖苷酶的活动被检测到,这表明细胞融合和β-半乳糖苷酶的表达依赖于相互作用的v-和t-斯耐尔。这些结果表明,酶的细胞融合实验在v-和t-SNARE蛋白有效地标识膜融合的配对。

通过表达VAMP蛋白在细胞表面处于同一水平( 图2D),我们比较了它们的膜融合活动。随着叔斯耐尔syntaxin1/SNAP-25,鞋面1,第3,和8具有可比性和最高的融合,而鞋面4和7具有50%和30%下的融合活动,( 图4)分别。相比之下,当结合与t-斯耐尔VAMP5时,被检测到仅基线的β-半乳糖苷酶的活性( 图4),这表明VAMP5不驱动膜融合与SYNTaxin1/SNAP-25。

图1
图1。酶法细胞融合实验。 TTA的翻转V-SNARE质粒的共转染,转染和TRE-LacZ的翻转T-SNARE质粒的。的v-和t-细胞的融合导致的结合tTA的TRE和通过比色的方法,其测量的β-半乳糖苷酶的表达。

图2
图2中的表达在细胞表面的翻转斯耐尔。 (A)翻转域结构的圈套。 (SS)preprolactin信号序列融合到SNARE蛋白的N-末端,并插入一个Myc标签之间的信号序列和SNARE基序(卷曲螺旋)。 (B)被共转染COS-7细胞与tTA的和空载体pcDNA3.1(+),或翻转VAMP5质粒。 24小时转染后,用抗Myc单克隆抗体。unpermeabilized的细胞被染成代表单片的共聚焦图像显示。 (C和D)24小时后,与tTA的和pcDNA3.1(+)的共转染,或翻转鞋面(五-细胞),或与TRE-LacZ的共转染后的24小时,翻转SNAP-25和syntaxins 1或4(t细胞),unpermeabilized细胞的抗Myc抗体染色,并用流式细胞仪分析。 (C)代表FACS公司转染的细胞,将pcDNA3.1(+),或翻转VAMP1质粒。使用CellQuest Pro软件确定各样品的平均荧光强度。 (D)表示VAMPS在同一水平和快速syntaxins 1和4在细胞表面在同一水平,翻转SNARE质粒转染浓度在滴定。所示SNARE蛋白染色的细胞表面的平均荧光强度。误差棒表示标准偏差4个独立实验。 (E,F)24小时后,cotransfe ction与tTA的和翻转VAMP5质粒,细胞被permeablized与0.2%的Triton X-100在PBS + +和(E)染色,用抗Myc抗体,或(F)的双染色的抗Myc单克隆抗体和一个多克隆抗体以TET阻遏(检测tTA的)。 (E)是代表聚焦和相位对比图像。由的抗Myc的抗体(VAMP5)和总相衬通道中的细胞数进行计数的组(n = 60细胞),并计算转染效率(80%)被标记为的转染的细胞的数目。 (F)的数目的同时表达VAMP5和tTA的转染细胞,转染的细胞的总数,明示VAMP5,tTA的或两者进行计数(n = 75人转染的细胞)。然后计算同时表达VAMP5和tTA的转染的细胞的百分比(70%)。比例尺,20微米。 点击此处查看大图

“佛:保持together.within”页面=“总是”> 图3
图3。细胞融合取决于上的v-和t-SNARE蛋白的相互作用。 V-表示TTA和VAMP2培养的T细胞,细胞表达TRE-LacZ的,syntaxin1和SNAP-25。 24小时后,裂解细胞和细胞裂解物中的β-半乳糖苷酶的活性来确定使用的比色的方法通过在420 nm处的吸光度。仅基线β-半乳糖苷酶的活性来检测时,无论翻转VAMP2或SNAP-25质粒省略从转染。

图4
图4。融合活动VAMPS比较。在优化的转染条件下,鞋面1,3,4,5,7和8是表示在同一水平的v-细胞在细胞表面。用t-细胞结合的v-细胞的24小时后,前按syntaxin1/SNAP-25,细胞融合使用的酶的细胞融合实验量化。误差棒表示标准偏差4个独立实验。 ** P <0.01,*** P <0.001与VAMP1。

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Discussion

原细胞融合实验6荧光显微镜决定SNARE蛋白介导的细胞融合。在这里,我们描述了一个创新的分析,量化SNARE蛋白介导的细胞融合,通过激活β-半乳糖苷酶的表达和光谱测量。使用这个实验中,我们经常分析15 - V-20和T-SNARE组合在一个单一的实验。使用流式细胞仪来测量圈套在细胞表面的表达,我们滴定的鞋面的表达水平,并比较它们的膜融合的能力(图2和图4)。此外,使用的酶的细胞融合实验,我们确定密度VAMP1蛋白的细胞表面上的细胞融合活性的依赖,并没有观察到协同性VAMP1蛋白在细胞融合反应8,这表明多个SNARE复合物不需要协调一致的行动融合细胞的膜。

是公认的N-糖基化莫蒂FS(Asn-X-Ser/Thr)在SNARE蛋白。由于N-糖基化抑制融合活动翻转SNARE蛋白6,有两种方法已被用来防止翻转SNARE蛋白的糖基化的。首先,糖基化位点突变导入翻转SNARE构成体6。其次,所述的N-糖基化抑制剂衣霉素(6.7微克/毫升)在目前的协议,包括在细胞融合反应。此外,加入0.67 1mM DTT的细胞融合反应中,以防止翻转SNARE蛋白之间的二硫键的形成,这将抑制SNARE融合活动。我们的实验表明,增​​加了6.7微克/毫升衣霉素和0.67毫米DTT细胞培养液中不会干扰COS-7细胞的增殖和存活的。我们常规终止结合的v-和T-细胞的细胞融合后,在24小时反应。然而,重大SNAP-介导的细胞融合被检测到6小时,合成后的V-AND T细胞。因为酶的细胞融合反应依赖于β-半乳糖苷酶的表达,细胞融合后,此读出系统的时间过程的滞后翻转SNARE蛋白介导的膜融合过程中的时间。

的酶的细胞融合实验用于检查潜在的v-和t-SNARE在哺乳动物细胞中的相互作用的膜融合活动提供一个定量重组测定。通过共表达调节蛋白( 例如 ,Munc18)和SNARE蛋白在细胞表面或通过包括重组调节蛋白在细胞融合反应,该法可用于阐明SNARE介导膜融合的调控机制,。此外,该法应SNARE介导膜融合抑制剂或活化剂的高通量筛选中的应用程序。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

这项工作是支持的大学,路易斯维尔和CA135123从美国国立卫生研究院(CH)的启动资金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 cells ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
pBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
Enzyme-free cell dissociation solution Invitrogen 13151-014
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody Millipore AB3541
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
FACSCalibur flow cytometer BD Biosciences
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer Promega E2000
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer Hitachi C740843

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References

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