الحصين حقن مكروي الأنسولين و

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

التشكيل المكاني من الذاكرة التي تعتمد على العمل hippocampally بواسطة حقن مكروي intrahippocampal المباشرة، يرافقه ويليه

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ايض الجلوكوز هو علامة مفيدة للنشاط العصبي المحلية، التي تشكل أساس طرق مثل 2-deoxyglucose والتصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي. ومع ذلك، واستخدام مثل هذه الأساليب في النماذج الحيوانية يتطلب التخدير وبالتالي يغير كل دولة الدماغ ويمنع تدابير سلوكية. طريقة بديلة هو استخدام الجسم الحي في microdialysis لاتخاذ القياس المستمر لتركيزات الدماغ السائل خارج الخلية من نواتج الأيض الجلوكوز، اللاكتات، وذات الصلة في الحيوانات، مستيقظا غير المقيد. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عندما يقترن المهام مصممة للاعتماد على مناطق محددة في الدماغ و / أو التلاعب الدوائية الحادة، على سبيل المثال، وقياسات الحصين خلال مهمة الذاكرة العاملة المكانية (تداول عفوية) تظهر انخفاضا في نسبة الجلوكوز خارج الخلية وارتفاع اللاكتات التي هي توحي 1،2 تحلل المعززة، وintrahippocampal الإدارة الانسولين يحسن الذاكرة على حد سواء، ويزيد جليكول قرن آمونysis 3. يمكن أن يتم تسليم المواد مثل الانسولين عن طريق الحصين إلى التحقيق microdialysis نفسها التي استخدمت لقياس نواتج الأيض. تم تصميم استخدام التناوب التلقائي كإجراء وظيفة قرن آمون لتجنب أي تفنيد من المحفزات المجهدة (مثل footshock)، وضبط النفس، أو المكافآت (مثل المواد الغذائية)، والتي يمكن أن تغير كل من الأداء والتمثيل الغذائي المهمة؛ هذه المهمة كما يوفر قياس النشاط الحركي الذي يسمح لمراقبة آثار غير محددة من العلاج. مجتمعة، هذه الأساليب تسمح القياس المباشر للمتغيرات الكيميائية العصبية والأيضية التي تنظم السلوك.

Protocol

1. جراحة إعداد

  1. التعامل مع. يتم التعامل مع الحيوانات (الأكثر شيوعا، الجرذان أو الفئران، على الرغم من أن طريقة لmicrodialysis وبالاشتراك مع اختبار السلوكية إلى حد كبير عام واحد مع التعديلات أنواع معينة أي حاجة المطلوبة، على سبيل المثال للتخدير) مدة لا تقل عن 10 دقيقة / يوم لمدة لا تقل قبل يومين من الجراحة. وقد تبين واسعة النطاق لمعالجة الحيوانات ترك في حالة بهيج في وقت الاختبار، وتجنب الخلط بين الممكن 2،4،5. سوف نستخدم الفئران في جميع أنحاء هذا البروتوكول من الفصائل سبيل المثال. ويجب أن يتم التعامل مع الإجهاد الناجم عن دون سحب على الفراء من اللاتكس أو قفازات النتريل مثل: يمكن استخدام هذه أفضل طريقة لتحقيق بأيديهم العارية، بالتشاور مع الطبيب البيطري ومسؤولي الصحة مرفق موظف. إذا لم يكن ذلك ممكنا، ينبغي ارتداء القفازات القطنية الناعمة على الجدار قفازات لتجنب سحب على الفئران الفراء.
  2. العقيمة الميدانية إعداد. قبل بداية عملية جراحية surgic،ويتم إعداد آل منطقة، حقل معقمة أعدت حول جهاز التجسيمي وثنى العقيمة عبر وضع جهاز، وتغطي وسادة التدفئة الذي يستخدم للحفاظ على درجة حرارة الجسم الفئران. ويستخدم منصة تداول الماء الدافئ مع الحرارة دقيقة لمنع ارتفاع درجة حرارة الحيوان.
  3. التخدير التعريفي. يتم فحص المرذاذ isoflurane لاحتواء المستويات المثلى من isoflurane وتوصيلها إلى غرفة تحريض. يتم التحقق من وصلات لتأكيد حلقة مغلقة. يتم فحص نظام فراغ تنقية الهواء لتكون جاهزة. يتم تبديل التبخر Isoflurane على والحيوان وضعت في غرفة تحريض باستخدام isoflurane 5٪ في مزيج الأكسجين: هذا هو، 5٪ isoflurane أضاف ضمن تيار من الأكسجين 100٪ وتسليمها إلى الدائرة التعريفي.
  4. التنسيب إلى الجهاز. يتم تأمين الحيوانات في الجهاز باستخدام التجسيمي earbars وبار الأسنان. نتائج التنسيب الصحيح earbar في الرأس والأذنين متحركة الشقة التي تقع على طول earbars. الحيواناتيتم تأمين بسرعة والأنف إدراجه ضمن الرؤوس مخدر الغرض التصميم؛ يتم تبديل تسليم isoflurane المتبخرة من غرفة الحث على الرؤوس ومزيج التخدير تعديلها لتسليم 2-3٪ isoflurane الأكسجين في مجرى الذهاب إلى الرؤوس.
  5. تأكيد التخدير. وأكد ان طائرة مخدر الجراحية من خلال تقديم قليل من الصعب القدم ونفخة من الهواء للعين؛ لا ينبغي أن يسبب أي رد. وتتكرر هذه الاختبارات على فترات حوالي 15 دقيقة طوال عملية جراحية لتأكيد الحفاظ على الطائرة مخدر الجراحية. تتم إزالة الشعر من موقع شق قبل دخول المجال المعقم.

2. جراحة

  1. الأولي علاج الحيوان. يتم تطبيق مرهم للعين على كل مقلة العين لمنع جفاف. وتعطى 1 مل ملحي معقم الشوري لمنع أي الجفاف أثناء الجراحة، ويتم تغطية الجسم مع ثنى العقيمة. يتم تطبيق Betadine على فروة الرأس، وممسوح من مركزمع مسحة من القطن، ويتم ممسوح الايثانول 70٪ وبالمثل، ويتم تكرار الخطوتين ينظف مرتين أكثر لضمان موقع شق المناسبة. يجب الجلد وقت الاتصال لbetadine والكحول تكون على الاقل 3 دقائق قبل شق. يتم الاحتفاظ التخدير وفحص بانتظام طوال الجراحة؛ وتعطى حقنة واحدة من كاربروفين SC 5 غ / كغ) لبدء تسكين، ويستخدم تقنية العقيم. وتعطى تسكين بعد تحريض التخدير لتقليل الإجهاد من أي حقن.
  2. شق وإعداد الجمجمة. يتم إجراء قطع 3-4 سم sagitally في وسط الجمجمة. يتم تطبيق ادرينالين موضعيا لتوفير مزيد من وعي وتقليل النزيف: مزيج 1:1 من bupivicaine. يقام فروة الرأس بعيدا عن شق جراحي باستخدام مقاطع ومسحات معقمة وتستخدم لإزالة الأغشية المغطي من الجمجمة. يتم قياس إحداثيات وضع علامة للحفر باستخدام bregma كنقطة مرجعية، وذلك باستخدام مثقاب العقيمة (أو، بدلا من ذلك، باليد الكي ديفيم)، وإعادة تأكيد للتأكد من دقتها قبل بدء الحفر. ويتم تحديد إحداثيات لمناطق محددة في الدماغ من الفائدة (على سبيل المثال هنا قرن آمون) باستخدام أطلس الدماغ. لmicrodialysis قرن آمون، ونحن استخدام موقع الحفر بنحو 5.6 مم الخلفي لbregma، +5.0 الوحشي، و 3.0 بطني من دورا.
  3. الحفر. يتم حفر ثلاثة ثقوب من خلال الجمجمة، مع الرعاية التي يجري اتخاذها لتطبيق الحد الأدنى من القوة فقط بحيث الصدمة إلى الجافية والأغشية الأساسي هو الحد الأدنى أو غائبة. فتحة واحدة هي في موقع قياس من الإدراج قنية؛ يتم وضع الاثنان الآخران ومريحة لإدخال مسامير الجمجمة. يتم إدراجها في هذه الثقوب دون التأثير على المخ تحت، وتستخدم ونقاط الربط اللاحقة لتطبيق الاسمنت الأسنان؛ الغرض الحجم مسامير (أدوات العلوم الجميلة مثل 1،17 ملم الذاتي التنصت على مسامير).
  4. قنية التنسيب والإغلاق. يتم وضع قنية في إحداثيات الإدراج، والتي يتم إعادة أكدت أن موقع حفر حفرة ل،وبعد ذلك نزلت ببطء إلى عمق الهدف. صحيح مرة واحدة في وضع، يتم تأمين قنية في مكان مع الاسمنت الأسنان. إذا لزم الأمر، يتم استخدام واحدة خياطة جراحية معقمة لإغلاق الجرح. يتم إدراج مرود في قنية للحفاظ على سالكية. في هذا البروتوكول نستخدم التحقيق CMA12 ودليل قنية (CMA / Microdialysis).
  5. الحادة الرعاية بعد الجراحة. وتعطى 3 مل ملحي معقم الشوري لمواصلة الماء؛ وتعطى أيضا واحدة من الحقن SC كاربروفين 5 غ / كغ) لبدء تسكين. تتم إزالة الحيوانات من الجهاز ووضعها في غرفة الإنعاش حرارة، في قفص نظيفة، وحتى يتم رصد تعافى تماما من أنها التخدير. ويتم تقييم الشفاء التام من استعادة بتصحيح تنقل رد الفعل وطبيعية. وعاد بعد ذلك إلى قفص الحيوانات وطنهم وغرفة العادية القابضة.
  6. على المدى القصير متابعة الرعاية. وتتميز أقفاص الحيوانات التي خضعت لعملية جراحية مع تاريخ الجراحة. يتم مراقبة الحيوانات على الأقل مرة كل يوم لمدة لا تقل عبتيهه أيام بعد الجراحة، ومنحها كاربروفين مضغ قرص (2 ملغ) في اليوم التالي لعملية جراحية وكل من اليومين التاليين. إذا الحيوانات لا تستهلك كاربروفين، قد تعطى عن طريق الحقن لضمان كاربروفين وعي كاف. رصد كل من الصحة العامة للحيوان وحالة مكان الجرح (لاحمرار، والعدوى، وغيرها) بعد المؤسسية المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان وطلب المساعدة أو المشورة من موظفي الرعاية الحيوانية أو طبيب بيطري وإذا لزم الأمر. الأهم من ذلك، نلاحظ أن التعامل مع المناسبة والتأقلم لالمجرب ضروري: يجب التعامل مع الحيوانات على نطاق واسع، بما في ذلك التلاعب في قنية، حتى أي علامة على التوتر أو الإجهاد عندما لا يزال التعامل معها من قبل المجرب.
  7. رعاية الحيوانات اللاحقة والعلاج. وسوف تتبع الحيوانات المناسبة الاختبار وإجراءات القتل الرحيم وفقا لبروتوكول المعتمدة وجماعتهم التجريبية المحددة.

3. Microdialysis (MD)

  1. Perfusيأكلون الإعداد. يتم السوائل خارج الخلية الاصطناعية (aECF) مع نا ملي 153،5، 4.3 ملي K، 0.41 ملي المغنيسيوم، 0.71 ملي الكالسيوم، الكلور 139.4 مم، 1.25 مم الجلوكوز، مخزنة في درجة الحموضة 7.4 6 ملاحظة أن تكوين السائل دقيقة من الضروري: عدم الدقة أو استخدام وسوف من السوائل، وأخرى أقل الفسيولوجية مثل لقارع الأجراس أو لPBS microdialysis يؤدي إلى نتائج خاطئة بشكل ملحوظ 6. على وجه التحديد، لاحظ أن تكوين الأيونية من السائل خارج الخلية (ECF) ليست هي نفسها كما ان من CSF، ونحن وأظهرت دراسة أجريت عام 2004 في مفصل للECF الحصين 6. في يوم الاختبار، وزلال المصل البقري يجب (BSA) أن تضاف في الوزن 2٪ / والوزن حله تماما، وهذا يقلل من فقدان الببتيدات مثل الأنسولين من الانضمام إلى أنابيب، ويقلل أيضا من خطر فقدان السوائل (الترشيح الفائق) في الغشاء التحقيق. بعد إعداد، ينبغي تصفية سائل الإرواء من خلال مرشح ميكرومتر .2.
  2. إذا كان العلاج مثل الأنسولين هو أن يتم تسليمها إلى الصدريةفي المنطقة ذات الاهتمام (هنا قرن آمون)، وإعداد هذا العلاج باستخدام قسامة من aECF المعدة مع تركيز الدواء المناسب. للأنسولين، وقد تبين تركيز 400 نيوتن متر (66.7 μU / ميكرولتر) للتسليم عبر microdialysis عكس تؤثر على التمثيل الغذائي قرن آمون وظيفة الادراك 7. لاحظ أنه لا قياس تركيز الأنسجة الناتجة من الأنسولين وهنا لا يزال غير معروف.
  3. إنشاء خطوط التحقيق والعضو المنتدب. إعداد التحقيق microdialysis الطازجة وخط اليوم قبل إجراء الاختبار. إنشاء سطرين منفصلين ل "تدفق" و "تدفق". استخدام أنابيب لتوصيل PE50 قطعتين طويلة من الأنابيب 1 متر FEP وضمان وجود الحد الأدنى من الفضاء الميت بين السطور. توصيل أنابيب تدفق لحقنة 1 مل هاميلتون مليئة العقيمة، التي تمت تصفيتها، منزوع الأيونات 0 2 H (DH 2 0)، ثم نعلق على التحقيق.
  4. Microdialysis قطب. للسماح لحركة الحيوانات مجانا في حين أخذ القياسات، قم بتوصيل قطب السائل إلى طnflow وخطوط تدفق، على مقربة من المضخة، وذلك باستخدام أنابيب FEP إضافية. تذكر أن تأخذ حجم الداخلية لهذا قطب وأنابيب في الاعتبار عند النظر في توقيت جمع العينة (أدناه).
  5. إنشاء مضخة MD. بدوره على مضخة العضو المنتدب وتشغيل عند 1.5 ميكرولتر / دقيقة حتى ترى DH 2 0 الخروج من أنبوب تدفق على التحقيق. ثم، في حين يتم تشغيل المضخة قبالة، قم بتوصيل خط آخر بين أنبوب تدفق أنبوب وجمع العينات. تشغيل 5 مل من خلال أنبوب ووضع المسبار في قارورة تحتوي على DH العقيمة 2 0 ليلة وضحاها، وضمان أن يبقى دائما تلميح التحقيق الرطب.
  6. قبل التحقيق موضوع الاختبار. 24 ساعة قبل الاختبار، وإزالة مرود وهمية عن رأس فأر وإدراج التحقيق MD (تستخدم فقط لهذا الغرض، وليس لأخذ العينات) لمدة 10 دقيقة. ثم استبدال مرود وهمية ووضع الفئران مرة أخرى إلى قفصه. تم تصميم هذا الإجراء للحد من أي تأثير رد الفعل دباق في يوم الاختبار 8 و في أيدينا، وهذا يعطي نتيجة جيدةTS التي تطابق البيانات من التقنيات الأخرى، ويبدو أن تعكس تفعيل الحصين 2،5،7،9، والبعض الآخر قد استخدمت نهجا مماثلا أن يترك التحقيق في مكان لمدة 24 ساعة قبل القياس، الذي هو أيضا نهج جيد إذا الأضرار التي لحقت التحقيق يمكن تجنبها بين عشية وضحاها.
  7. التحقيق موازنة. في يوم microdialysis، وملء المحاقن هاميلتون والتلألؤ فيال مع aECF تمت تصفيتها من خلال ضخ ولكي تتوازن لمدة 1 ساعة. إذا لزم الأمر، وملء حقنة هاميلتون المركز الثاني برصيد العلاج المعدة (على سبيل المثال، الانسولين aECF) ومكان في محقنة مضخة.
  8. التحقيق الإدراج. عندما موازنة اكتمال إزالة دمية مرود وضعه بلطف التحقيق في الدماغ MD معايرتها في الجرذ عن طريق قنية. وضع الفئران في مربع من البلاستيك الواضح أن يحتوي على بعض من الفراش منزل فأر. تأكد من موازنة أنابيب: إرفاق ميكروسنتريفوج مل 1،6 أنبوب مملوء بالماء إلى خارج القفص أنابيب في مثل هذه الطريقة التي تحافظ على خطورة microdiخطوط مشدود ولكن alysis unkinked لا. دعونا التحقيق تتوازن في الفئران لمدة 2 ساعة. في بداية هذه الفترة، تأكد أن تدفق سائل الإرواء رفع الحجب هو: هو الأكثر بسهولة ذلك عن طريق جمع تدفق سائل الإرواء خلال فترة محددة وزنها العينة للتأكد من أن حجم المتوقع والخروج من النظام. أي أن التحقيق غلة <90٪ من حجم المتوقع، و لا ذاتية الصحيحة بعد إزالة وإعادة الإدراج، يجب أن يتم استبدال (وذمة في الطرف خلاف ذلك سيؤدي التحقيق). إذا تدفق منخفض أو غير موجودة باستمرار، والتحقق من كافة الاتصالات عن التسرب؛ إذا تعذر ذلك، قطع الأنابيب في مراحل لمعرفة ما إذا كان يمكن أن تكون معزولة الانسداد. إذا لم يتم تحديد المشكلة، استبدل التحقيق، وإذا كان لا يحل المشكلة، قد يكون من الضروري لبدء التحقيق من جديد مع خطوط جديدة وقسم من 3.3. فترة موازنة لمدة ساعتين يسمح حاجز الدم في الدماغ لختم التحقيق حول وتجنب أي تأثير حاد في الإدراج التحقيق.
  9. جمع العينات. تأكد من أن المشتركويحسب بدقة rrelation بين غسيل الكلى العينة (من الدماغ) وجمع (في أنبوب). على سبيل المثال، وذلك باستخدام مترين من أنابيب FEP بين قطب والتحقيق، وهناك الحجم الكلي بين التحقيق وجمع من 30 ميكرولتر، وبالتالي فإنه يأخذ 20 دقيقة عند 1.5 ميكرولتر / دقيقة معدل تدفق العينة لتمرير من خلال التحقيق، وصلات، وأنابيب وقطب للوصول إلى نهاية لجمع أنابيب. عندما جمع عينات التأكد من جمع ما يكفي أن يكون حجم التركيز اللازم لفحوصات الخاص بك. هنا، فإننا سوف استخدم 5 صناديق عينة دقيقة، وبالتالي جمع 7،5 ميكرولتر من ديالة في كل أنبوب جمع.
  10. خط الأساس العينات. مرة واحدة موازنة كاملة، تبدأ جمع العينات. جمع ما لا يقل عن ثلاث عينات في حين أن الفئران هي في بقية المنزل في غرفة لإنشاء خط الأساس للقياسات مستقرة
  11. العلاج التوقيت. رعاية لحساب توقيت المطلوبة لبدء العلاج قبل التجربة: تذكر أنه مثلما هناك فارق زمني بين غسيل الكلىوجمع العينات، وهناك LAG (متطابقة عادة) بين ترك حقنة سائل الإرواء وصولا الى الحصين الحيوان. وبالتالي، في الإعداد لدينا مع المجلد 30 ميكرولتر بين حقنة والتحقيق، تغيير حقنة لأن تحتوي على 20 دقيقة المعاملة سائل الإرواء قبل كنت ترغب في أن يبدأ العلاج وصوله الى الحصين.
  12. تغيير المحاقن. ويمكن استخدام تبديل السائل إذا رغبت في ذلك ولكن ليس من الضروري: في الوقت المناسب، افصل ببساطة خط التدفق من الحقنة ضبط سائل الإرواء والاتصال بسرعة إلى حقنة المعاملة سائل الإرواء. وهذا ينبغي أن تتخذ أي أكثر من 5 ثوانى لتجنب انقطاع كبيرة في تدفق سائل الإرواء. ملاحظة أنه ينبغي عكس هذه العملية بعد أن تم تسليم الدواء المطلوب، إذا هو المطلوب التسليم في الوقت المحدد محدودة من العلاج. بدلا من ذلك، قد يستمر العلاج لمدة أخذ العينات (انظر الشكل 2). لا ينبغي أن فقاعات الهواء التي أدخلت على خط التبديل من خلالالحقن، كما أنها قد تتراكم في الغشاء غسيل الكلى وتقليل كفاءة التحقيق.
  13. السلوكية الاختبار. إذا تنفيذ مهمة السلوكية، اتبع هذا الإجراء (انظر القسم 4 أدناه). لاحظ أن التنسيق مع تقديم العلاج لقرن آمون هو المهم. على سبيل المثال، ينبغي التسليم في الوقت المناسب من الأنسولين تحدث 10 دقيقة قبل الاختبار التي تبدأ في 10. وبالتالي، يجب التبديل إلى سائل الإرواء الأنسولين التي تحتوي على 30 دقيقة تحدث قبل الاختبار السلوكية (20 دقيقة للسائل الإرواء بالمرور عبر خطوط بالإضافة إلى 10 دقيقة وقت التسليم المطلوب قبل الاختبار).
  14. الانتهاء من جمع العينة. بعد جمع العينات المطلوبة، وإزالة بلطف التحقيق من رأس الحيوان، وتذكر مرة أخرى أن تأخذ في الاعتبار الفارق الزمني بين غسيل الكلى وجمع العينات. العودة إلى قفص الحيوان وطنه ومراقبة عن كثب لأي تغيير آخر تجريبية في مجال الصحة أو السلوك حتى يتم قتل الحيوان والدماغ لتأكيد إزالة الصحيحالتحقيق التنسيب. إذا التضحية لن يحدث على الفور، والعودة إلى مرود دمية إلى قنية لتجنب أي إدخال مواد غريبة.
  15. التحليل. سوف المنهجية التحليلية تختلف تبعا لتحليلها (ق) من الفائدة. لأن غسيل الكلى أخذ العينات لا يسمح للموازنة الحليلة الكامل في الغشاء التحقيق، ينبغي تصحيح عينة تركيزات لإعطاء تركيزات ECF باستخدام طريقة صفر صافي تدفق 11،12.

4. اختبار السلوكية

  1. التنسيب على المتاهة. بعد عينات خط الأساس (أي بعد ما لا يقل عن ثلاث عينات قد أكملت غسيل الكلى، ولكن قد يكون لا يزال في أنابيب تدفق يجري جمعها)، حرك بلطف الفئران في جهاز الفحص السلوكي. ويمكن استخدام أي مهمة المناسبة؛ تم جمع البيانات في الشكل 1 باستخدام الذراع أربعة زائد على شكل متاهة وقياس التناوب التلقائي، والذي هو مقياس لالذاكرة العاملة المكانية: في البداية يتم وضع الفئران في فضاءثالثا من المتاهة، وسمحت لاستكشاف بحرية 9،13. لأنه قد يكون استخدام أي اختبار السلوكية، والتركيز على هذا البروتوكول ليس على مهمة محددة تستخدم كمثال هنا (والذي هو مفصل في مكان آخر 9،14،15)، ولكن باختصار، ويسمح الحيوانات لاستكشاف المتاهة (فترة وقد تم مؤخرا مربع رمادي في الشكل 1) والتي تعتمد على استخدام hippocampally العمليات للاحتفاظ الذاكرة التي زار الأسلحة.
  2. غسيل الكلى حركة أنابيب أثناء الاختبار. عقد أنابيب من النوع الذي يتحرك بحرية، مما يعيق الحركة لا فأر ولا يتم السماح للتحرك أمام الحيوان ويصرف عليه. البقاء في مكان وتقليل الحركة الخاصة بك بحيث كنت لا تؤثر على السلوك وفأر.
  3. استمرار جمع العينة. كما خلال خط الأساس، نقل أنابيب تدفق إلى أنبوب جمع جديدة كل 5 دقائق.
  4. التناوب الاختبار. تسمح للحيوان بحرية لاستكشاف المتاهة لمدة 20 دقيقة. تسجيل تسلسل وتوقيت مقالات الذراع إما باستخدامتسجيل فيديو أو باليد في وقت لاحق مهمة تحليل الأداء 9،15.

5. بعد الاختبار

  1. جمع عينة النهائي. بعد الاختبار، وإزالة بلطف من الفئران متاهة والعودة للسيطرة على الغرفة. تواصل microdialysis جمع العينات لمدة لا تقل أربع عينات لتغطية الفترة من التعافي من أداء المهمة.
  2. التحقيق الإزالة. بعد الانتهاء من جمع كل العينات، وإزالة بلطف التحقيق من رأس الحيوان ومكان إلى قارورة التخزين؛ العودة إلى قفص الحيوان وطنه.
  3. التحقيق التخزين. بعد عودته إلى القفص الحيوانية الرئيسية واستكمال جمع أي ديالة المتبقية، وشطف جيدا التحقيق مع DH 2 0 وتخزينها في قارورة التلألؤ مليئة 0 2 درهم ومغطاة parafilm. تدفق أنابيب عن طريق التحول إلى حقنة تحتوي على محلول من 1:10،000 Kathon في DH 2 0 لمنع نمو الميكروب. يمكن إعادة استخدامها تحقيقات طالما أنها الحفاظ على تدفق جيد ولهاأي ضرر لغشاء، وينبغي أن يكون هذا مع العناية بشكل روتيني تتجاوز عشرة الاستخدامات.
  4. علم الأنسجة. قتل الحيوان وإزالة الدماغ. شريحة على ناظم البرد واستخدام تقنيات النسيجية القياسية (مثل تلطيخ البنفسجي الكريزيل) لتأكيد صحة التنسيب التحقيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يجب استعادة الفئران بسرعة من الجراحة ويكون في حالة تأهب، ونشط داخل متحركة 30 دقيقة وقف التالية من التخدير. ينبغي أن أثر الحد الأقصى قنية يكون ضئيلا للغاية إذا تم إجراء الجراحة نظيفة، ويستخدم الحد الأدنى من الاسمنت الأسنان. إذا لاحظت أي علامة على الإصابة خلال الرصد اللاحقة للعمليات الجراحية، أو الفئران بأي شكل من الأشكال تظهر عليها علامات الانزعاج أو الضيق، وعلى الفور إنهاء التجربة، وينبغي أن يكون هذا نادر للغاية. خلال التعامل مع قبل الاختبار، يجب أن تكون في حالة تأهب الحيوانات، متحركة بحرية، ودية والفضوليين. وينبغي التعامل مع الحيوانات بشكل جيد يكون في الأساس ليست الإجهاد يمكن ملاحظتها المتبقية من عملية جراحية، والانتعاش بعد الجراحة، أو وجود المجرب، ويمكن تأكيد هذا إذا رغب قياس هرمونات التوتر البلازما (ادرينالين، السكرية) و / أو الجلوكوز 2،4 ، 5.

الدماغ الجلوكوز ECF هو عادة في حدود 0،5 حتي 1،5 ملم، تتفاوت من منطقة في الدماغ، على الرغم من ارتفاع قيميمكن أن ينظر إليها في الحيوانات السكري؛ في قرن آمون، تركيزات الجلوكوز الأساسية هي بناء على أمر من وثيقة 1.25 مم 6،12. في حالة عدم وجود أي علاج الخارجية، ينبغي النظر تراجع في نسبة الجلوكوز في ECF (والشائع أن يكون ارتفاع اللاكتات ECF)، أثناء أداء المهمة، في مناطق الدماغ تشارك في التوسط تلك المهمة (انظر الشكل 1 على سبيل المثال)، وهذا يعكس زيادة النشاط الأيضي الناجم عن الحمل المعرفي 9،14،16. يمكن أن تؤخذ تغييرات مماثلة كدليل على علاج معين يزيد التمثيل الغذائي المحلية، كما رأينا على سبيل المثال بعد إعطاء الأنسولين عن طريق الحاد في إضافة إلى سائل الإرواء 7 (الشكل 2).

بشكل عام، يجب أن الحيوان أيضا ذات مقبض أداء الاختبار السلوكي مع عدم وجود علامة الشدة ودون أي علامة على الوعي أنابيب microdialysis: علامات الاستمالة المفرطة، والجمود، أي إشارة من الألم أو محاولات لإزالة الحيوان التحقيق تشيرالتعامل مع غير كافية المرجح و / أو عدوى حول موقع المسبار، ينبغي أن تؤخذ كمؤشر وإنهاء تلك التجربة.

يجب أن تلقي الإدارة الحيوانات الأنسولين، بالإضافة إلى قرن آمون الأيض مرتفعة، وتبين الذاكرة المكانية المعززة بشكل ملحوظ 7. السيطرة، وينبغي أن يكون الحيوانات غير المعالجة متوسط ​​الأداء التناوب على متاهة 4-ذراع بين 65 و 75٪ 7،9،14.

الشكل 1
الشكل 1. المهام المرتبطة تراجع في مستوى السكر في ECF قرن آمون (مقتبس من 9). رمادي مربع هي فترة اختبار المتاهة على التناوب التلقائي (SA). الخط البنفسجي يظهر الجلوكوز في قرن آمون الحيوانات مع عدم وجود اختبار المتاهة (ولكن الذين تم التعامل معها بطريقة أخرى مماثل). الخط الأحمر هو قياس أداء الحيوانات في 4-SA الذراع المهمة؛ البرتقال خط يبين القياسات في أداء الحيوانات أسهل3-SA إصدار الذراع.

الشكل 2
الشكل 2. التعديلات في الجلوكوز واللاكتات بعد قرن آمون الإدارة من الأنسولين عن طريق إدراجها في سائل الإرواء (مقتبس من 7). الأنسولين يصل إلى قرن آمون في النقطة التي يشير إليها السهم وإدارة باستمرار بعد ذلك. تم اختبار الحيوانات في أقفاص وطنهم، مع عدم وجود تلاعب السلوكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يجب أن تتم تصفيته جميع الحلول المستخدمة في microdialysis فورا قبل الاستخدام، وذلك باستخدام ميكرومتر 0.2 التصفية. بعد الإدراج من التحقيق في قنية دليل، ومراقبة للتأكد من تدفق دون عوائق وجمع العينات والتي تحدث. إذا توقف تدفق بعد الإدراج، والسبب الأكثر ترجيحا هو الأضرار التي لحقت الغشاء التحقيق بسبب عدم كفاية الرعاية على الإدراج، ويجب أن تكون بديلا لتحقيق الطازجة.

كما ذكر أعلاه، ميزة رئيسية لهذه الأساليب هو عدم وجود تفنيد، والسماح تدابير كلا السلوكية والكيميائية العصبية في الحيوانات، مستيقظا التحرك بحرية: للاستفادة من هذا والمناولة واسعة قبل الاختبار أمر ضروري من أجل أن بهيج الحيوان خلال القياسات. فترة موازنة عموما كافية لتوفير قاعدة مستقرة الأيض، ولكن قد تتم إزالة المواد الغذائية لمدة 1-2 ساعة قبل الاختبار إذا رغبت لضمان موحدة مستويات السكر في الدم عبر الحيوانات.

اله قيدين أهم MD كأسلوب أخذ العينات هي (ط) من حجم يقتصر الحليلة و (الثاني) إمكانية فقدان الحليلة بسبب التصاق في الأنابيب. يمكن التخفيف من السابق إلى حد ما عن طريق استخدام المجسات MD مع قطع الوزن الجزيئي أكبر. تحقيقات تجارية نموذجية تسمح بقطع تصل إلى 100 دينار، بحيث تصل إلى جزيئات ربما 50 دينار كويتي سيمر عبر دون عوائق نسبيا، ومع ذلك، واستخدام الأغشية أقل من الموصى قطع حيثما أمكن لتقليل أي خسارة عينة عن طريق الترشيح الفائق في الطرف التحقيق. التصاق جزيئات الهدف إلى أنابيب قضية في المقام الأول في حالات القياسات الببتيد، وكثير منها سوف تميل إلى التمسك محطة إثراء الوقود وبالتالي تقليل أنابيب الانتعاش على حد سواء الحليلة ودقة القياس. يمكن التقليل من هذه المشكلة عن طريق (ط) ما قبل معالجة المناطق الداخلية من الأنابيب باستخدام سائل الإرواء إلى 2٪ البقري الذي تمت إضافة مصل الزلال، التي تعمل كعامل إعاقة، و (الثاني) عن طريق التقليل من طول الأنبوب عودة: إذا NEeded، يمكن إرفاق قارورة جمع خفيفة بالقرب من تدفق التحقيق، رغم أن هذا يشكل تحديات إضافية في التحول أنابيب جمع من دون إزعاج الحيوانات، وخصوصا خلال اختبار السلوكية. ميزة واحدة من هذه التقنية هو أن يتم الحصول على عينات في شكل خالية من الحطام الخلوية أو الجزيئات الكبيرة مثل الإنزيمات، وعادة ما تكون مناسبة للتحليل المباشر عبر الحقن في HPLC، MS أو آلات التحليلية الأخرى كما هو دون الحاجة لمزيد من تنقية وهذا يسمح أيضا في كثير من الحالات التحليل من analytes متعددة في كل عينة (مثل الجلوكوز والقياسات اكتات هو موضح في الشكل 2).

وهناك تباين في استخدام microdialysis عكس العلاجات الدوائية لتسليم هو استخدام مزدوج حقن مكروي-microdialysis تحقيقات، التي تتوفر من عدة مصادر. ومع ذلك، فإن حمل للميناء حقن عموما ضيقة جدا وعرضة للانسداد، ويمكن أن يكون من الصعب بدقةالسيطرة على توقيت و / أو حجم تقديم العلاج. وبالتالي هذا البديل الوحيد الموصى به لعلاج غير قابلة للتسليم عن طريق إدراجها في سائل الإرواء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK (DK077106 إلى ECM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (6), 2881 (2000).
  2. McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56, (2), 66 (2001).
  3. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75, (3), 325 (2001).
  4. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  5. McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53, (2), 418 (2004).
  6. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  7. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75, (3), 325 (2001).
  8. McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55, (4), 1088 (2006).
  9. McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132, (1), 35 (2004).
  10. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  11. Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49, (3), 729 (1987).
  12. Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74, (3), 234 (1987).
  13. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (6), 2881 (2000).
  14. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93, (4), 546 (2010).
  15. Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
  16. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  17. Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26, (1), 91 (2002).
  18. Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5, (4), 358 (1986).
  19. McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87, (2), 298 (2006).
  20. McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18, (10), 3853 (1998).
  21. Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98, (4), 467 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics