Гиппокампа Микроинъекция инсулина и

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Модуляция hippocampally зависит от пространственной рабочей памяти прямого intrahippocampal микроинъекции, сопровождается и последующим

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Метаболизм глюкозы является полезным маркером для местных нервной деятельности, лежащие в основе методов, таких как 2-дезоксиглюкозы и функциональной магнитно-резонансной томографии. Тем не менее, использование таких методов в моделях на животных требует анестезии и, следовательно, как изменяется состояние мозга и предотвращает поведенческие меры. Альтернативным методом является использование в естественных условиях микродиализа принять непрерывного измерения концентрации мозга внеклеточной жидкости глюкозы, лактата, и связанные с ними метаболитов в проснулась, безудержное животных. Эта техника особенно полезна в сочетании с задач, направленных на полагаются на конкретные области мозга и / или острой фармакологической манипуляции, например, гиппокамп измерений во время пространственные задачи работы памяти (спонтанное чередование) показывают падение в внеклеточной глюкозы и лактата роста, которые указывающие на расширенной 1,2 гликолиза, и intrahippocampal администрации инсулина и улучшает память и повышает гиппокампа гликолялиз 3. Вещества, такие как инсулин может быть доставлен в гиппокампе через тот же зонд микродиализа используется для измерения метаболитов. Использование спонтанного чередования в качестве меры гиппокампа функция предназначена, чтобы избежать любых тупик от стрессовых мотиваторы (например, footshock), сдержанность, или наград (например, продовольствие), все из которых могут изменять как результат выполнения задачи и обмена веществ; эта задача также обеспечивает измерения двигательной активности, что позволяет контролировать неспецифического эффектов лечения. В совокупности эти методы позволяют прямое измерение нейрохимические и метаболические переменные регулирующие поведение.

Protocol

1. Подготовка хирургии

  1. Обработка. Животные (чаще всего, крыс или мышей, хотя этот метод для микродиализа и сочетании с поведенческой тестирования в значительной степени общим со всеми необходимыми видами специфических адаптаций необходимы, например, для наркоза) обрабатываются в течение как минимум 10 мин / день, по крайней мере за два дня до операции. Широкое обращение было показано, чтобы оставить животных в ненагруженном состоянии на момент тестирования, избегая возможных тупик 2,4,5. Мы будем использовать крыс на протяжении всего этого протокола в качестве примера вида. Обращение должно быть сделано без стресса, вызванного потянув меха, например, из латекса или нитрила перчатки: это может быть достигнуто использованием голыми руками, в консультации с ветеринаром объекта и должностных лиц здоровье работника. Если это не представляется возможным, мягкие хлопчатобумажные перчатки следует носить поверх барьера перчатки, чтобы избежать потянув за мех крыс.
  2. Стерильные Подготовка поля. До начала операции, SurgicАль область готовится, стерильное поле подготовлено около стереотаксического аппарата и стерильная салфетка помещается на аппарат, охватывающий грелку, которая используется для поддержания температуры тела крысы. Циркулирующей теплой воды с площадки точным термостат используется для предотвращения перегрева животного.
  3. Анестезия индукции. Изофлуран испаритель проверяется содержат оптимальные уровни изофлурана и подключен к индукции камеры. Соединения проверены, чтобы подтвердить замкнутый контур. Обработки воздуха Вакуумная система проверяется, чтобы быть в рабочем состоянии. Isoflurane испарения включен и животных помещают в камеры с использованием индукции 5% изофлурана в кислородной смеси, то есть 5% изофлурана добавлена ​​в поток 100% кислород и доставляется к индукции камеры.
  4. Размещение в аппарате. Животные обеспечены в стереотаксической устройств, использующих earbars и зуб бар. Правильное размещение earbar результаты в неподвижной голове и ушах, что лежать вдоль earbars. Животныебыстро обеспечили и нос вставляются в специально предназначенные анестетика головная часть; доставки испаренного изофлуран переключается с индукцией камеры головная часть и смесь анестетика доводят до доставки 2-3% изофлурана в потоке кислорода собирается головная часть.
  5. Подтверждение анестезии. Хирургические плоскости анестезии подтверждается доставки жесткий щепотку на ноги и поток воздуха в глаз, и не должно вызывать никакого ответа. Эти испытания повторяются примерно 15 мин интервалами в течение операции для подтверждения поддержания хирургического плоскости анестезии. Волосы удаляются из разреза перед входом в стерильную поле.

2. Хирургия

  1. Животное начала лечения. Глазная мазь наносится на каждый глаз для предотвращения высыхания. 1 мл стерильного физиологического раствора подкожно, чтобы предотвратить обезвоживание во время операции, а тело покрыто стерильная салфетка. Бетадин наносится на кожу головы, и протереть от центрас помощью ватного тампона, 70% этанола протереть аналогично, и два свабирование шаги повторяются два раза больше, чтобы обеспечить соответствующий сайт разрез. Контакт с кожей время для бетадин и алкоголя должно быть не менее 3 мин до разреза. Анестезия поддерживается и регулярно проверяются всей операции; одной инъекции подкожно из карпрофена 5 г / кг) дается для начала обезболивания, и асептическая технология. Обезболивание дано после анестезии чтобы свести к минимуму стресс от инъекций.
  2. Разрез и череп подготовки. 3-4 см разрез сделан сагиттально в центре черепа. Смесь 1:1 bupivicaine: адреналин применяется местно обеспечить дальнейшее обезболивание и свести к минимуму кровотечение. Волосистой части головы держать на расстоянии от разреза с помощью хирургического клипы и стерильные тампоны используются для удаления вышележащих мембраны из черепа. Координаты для бурения измеряется с помощью брегмы в качестве точки отсчета, отмеченные с помощью стерильного сверла (или, наоборот, ручные прижигания девин.э.), и вновь подтвердила точность до бурения начинается. Координаты для конкретных областей мозга интерес (например, здесь гиппокамп) определяется с помощью мозга атлас. Для гиппокампа микродиализа, мы используем буровой на 5,6 мм задняя брегмы, +5.0 боковой, и 3,0 от брюшного оболочки.
  3. Буровые. Три отверстия сверлятся через череп, с заботясь о том, чтобы применять только минимальная сила такая, что травмы оболочки и основной мембраны минимальна или отсутствует. Одно отверстие находится на сайте измеряется канюли вставки, а два других расположены в удобных для вставки черепа винтов. Цель размера винтов (например, 1,17 мм саморезы; изобразительных инструментов науки) вставляются в эти отверстия, не влияя на мозг внизу, и используются в качестве опорных точек для последующего применения в стоматологии цемента.
  4. Канюля размещения и закрытия. Канюля расположена на вставке координат, которая вновь подтвердил, что сайт отверстии,, а затем медленно снижается до заданной глубины. После правильного расположения, канюля закрепляется на месте с зубным цементом. Если необходимо, одного стерильные хирургические шовные используется для закрытия раны. Стилет вводится в канюлю для поддержания проходимости. В этом протоколе мы используем CMA12 зонда и канюли (CMA / Микродиализ).
  5. Острый послеоперационный уход. 3 мл стерильного физиологического раствора подкожно для продолжения гидратации; одной инъекции подкожно из карпрофена 5 г / кг) также дано начать обезболивание. Животные удаляются из аппарата и помещен в нагретое помещение восстановления, в чистой клетке, и контролировать, пока они не полностью оправился от наркоза. Полное восстановление оценивается по восстановлению рефлекса и нормального передвижения. Животные затем вернулись в свои дома и клетка обычный номер холдинга.
  6. Краткосрочные последующего ухода. Клетки животных, которые подверглись операции отмечены даты операции. Животные контролируется по крайней мере, один раз в день, по крайней мере Чете дни после операции, и приблизительно одна карпрофена жевательные таблетки (2 мг) на следующий день после операции, и каждый из двух следующих дней. Если животные не употребляют карпрофена, инъекционные карпрофена может быть предоставлен для обеспечения адекватного обезболивания. Мониторинг и общее состояние здоровья животного и состояние раны (для инфекции, покраснения и т.д.) после институциональные принципы ухода животных и ищет помощь или совет от животного сотрудников ухода или ветеринаром, если это необходимо. Важно отметить, отметим, что соответствующие обращения и акклиматизации к экспериментатору необходимо: животные должны быть обработаны широко, включая манипуляции с канюлей, пока никаких признаков нервозности или стресса остается при обращении с экспериментатором.
  7. Последующий уход и лечение животных. Животные будут следовать соответствующие процедуры тестирования и эвтаназии в соответствии с утвержденным протоколом и их конкретных экспериментальных групп.

3. Микродиализ (мД)

  1. Perfusели подготовки. Искусственные внеклеточной жидкости (aECF) производится с 153,5 мМ Na, K 4,3 мм, 0,41 мм пулемет, 0,71 мМ Ca, Cl 139,4 мм, 1,25 мМ глюкозы, буфер при рН 7,4 6 Заметьте, что точные состав жидкости имеет важное значение:. Неточностей или использовать других, менее физиологических жидкостей, таких как Рингера или PBS для микродиализа приведет к заметно ошибочные результаты 6. В частности, отметим, что ионный состав внеклеточной жидкости (ECF) не то же самое, что и CSF, как мы показали в 2004 году в детальном изучении гиппокампа ECF 6. В день тестирования, бычий сывороточный альбумин (BSA) должны быть добавлены на 2% вес / вес и полностью растворяется, это снижает потери пептиды, такие как инсулин от присоединения к трубопроводов, а также снижает риск потери жидкости (ультрафильтрации) на зонд мембраны. После подготовки, перфузат должны быть фильтровали через фильтр 0,2 мкм.
  2. Если лечении таких как инсулин должен быть доставлен в бюстгальтерВ область интереса (здесь гиппокамп), подготовить эту лечения с использованием аликвоту подготовленных aECF с соответствующей концентрации препарата. Для инсулина, концентрации 400 нМ (66,7 мкЕд / мкл) для доставки через обратную микродиализа было показано, влияют на метаболические гиппокампа и когнитивные функции 7. Обратите внимание, что полученная концентрация тканей к инсулину не измеряется здесь и осталось неизвестным.
  3. Установка зонда мД и линий. Подготовьте новый зонд микродиализа и линии за день до тестирования. Создать два отдельных линий для "притока" и "оттока". Используйте PE50 труб для соединения двух длиной 1 метр куски FEP труб и убедиться, что есть минимальное мертвое пространство между линиями. Подключите приток трубки к 1 мл Гамильтон шприц, заполненный стерильной фильтрацией, деионизированной H 2 0 (дН 2 0), а затем приложить к датчику.
  4. Микродиализ поворотные. Для обеспечения свободного передвижения животных во время проведения измерений, подключить жидкости поворотным в яnflow и отток линий, близких к насосу, используя дополнительные трубки FEP. Не забудьте взять внутренний объем этого поворота и трубкой во внимание при рассмотрении сроков отбора проб (см. ниже).
  5. Настройка мД насоса. Включите мД насос и запустить на 1,5 мкл / мин, пока не увидите дН 2 0 выходя из отток трубки на зонде. Затем, когда насос выключен, подключите другой линии между трубкой и отток трубки пробы. Выполнить 5 мл через трубку и поместить зонд в стерильную пробирку, содержащую дН 2 0 одночасье; убедиться, что зонд всегда остается мокрым.
  6. Предварительное зондирование испытуемого. 24 часов перед тестированием, удалить фиктивные стилет с головы крысы и вставить мД зонда (использовать только для этой цели, а не для отбора проб) в течение 10 мин. Затем заменить фиктивные стилет и положил крысу обратно в клетку. Эта процедура предназначена для минимизации влияния реактивного глиоза в день тестирования 8 и в наших руках, это дает хорошие РЕЗУЛЬТАТОВTS, которые соответствуют данным других методов, и, похоже, отражает гиппокампа активации 2,5,7,9, другие использовали аналогичный подход, который оставляет зонд на месте в течение 24 часов до измерения, которое является также хорошим подходом, если ущерб Зонд ночь можно избежать.
  7. Зонд равновесия. В день микродиализа, наполнить шприц Гамильтон и сцинтилляционный флакон с фильтром aECF и прокачивать, чтобы уравновесить течение 1 часа. При необходимости заполнить второй шприц Гамильтона с подготовленными лечения (например, инсулин-aECF) и место в шприцевой насос.
  8. Зонд вставки. Когда равновесие завершено, удалить фиктивные Стилет и аккуратно вставьте уравновешенной зонд мД в мозге крыс через канюлю. Положите крысу в прозрачной пластиковой коробке, которая содержит некоторые дома постельные принадлежности крысы. Убедитесь, что в противовес трубки: приложите 1,6 мл микроцентрифужных трубки, заполненной водой трубке вне клетки таким образом, что сила тяжести удерживает microdialysis линии unkinked, но не туго. Пусть зонд равновесия у крыс в течение 2 часов. В начале этого периода подтверждают, что поток перфузат разблокирован: это наиболее легко осуществляется путем сбора перфузат отток за определенный период и взвешивания пробы, чтобы подтвердить, что ожидаемый объем выхода из системы. Любой зонд, который дает <90% от ожидаемого объема, а не само-коррекции после удаления и повторной установки, должны быть заменены (в противном случае отеков на конце зонда будет результат). Если поток постоянно низкие или отсутствуют, проверьте все соединения на утечки, если это невозможно, отсоедините трубки в стадии ли блокировка может быть изолирован. Если проблема не определены, замените датчик, если проблема не устранена, это может быть необходимо, чтобы начать заново с новым датчиком и строки из раздела 3.3. Двухчасовой периода уравновешивания позволяет гематоэнцефалический барьер, чтобы запечатать вокруг зонда и избежать острого воздействия зонда вставки.
  9. Сбор образцов. Убедитесь, что сотрудничествоrrelation между образцом диализа (от мозга) и коллекции (в трубку) точно рассчитаны. Например, при использовании двух метров от трубки FEP между поворотной и зонд, есть общий объем между зондом и коллекция из 30 мкл и, следовательно, она занимает 20 мин при 1,5 мкл / мин, скорость потока для образца, чтобы пройти через зонд, трубки, соединители и поворачивать для достижения конечной насосно-компрессорных труб для коллекции. При сборе образцов убедитесь, что вы собираете достаточного объема, чтобы иметь концентрации, необходимой для анализа. Здесь мы будем использовать 5 бункеров мин образца, и, таким образом собрать 7,5 мкл диализата в каждой коллекции трубки.
  10. Базовые образцы. После уравновешивания завершена, начинаются пробы. Соберите по крайней мере, трех образцах в то время как крыса находится в состоянии покоя в доме камеру для создания устойчивой базовых измерений
  11. Лечение времени. Позаботьтесь, чтобы рассчитать необходимое время для начала лечения до эксперимента: помните, что как существует временной лаг между диализоми отбора образцов, есть отставание (как правило, идентичны) между перфузат выходя из шприца и прибывающих в гиппокампе животных. Таким образом, в нашей установке с 30 мкл между шприц и зонд, изменить шприц той, на которой лечение перфузат 20 минут прежде, чем вы хотите, чтобы лечение начинают прибывать в гиппокампе.
  12. Изменение шприцы. Жидкость переключатель может быть использован при желании, но не надо: в нужное время, просто отсоедините приток линии от управления перфузат шприц и быстро подключиться к лечению перфузат шприц. Это займет не более 5 секунд, чтобы избежать значительного перерыва в перфузат потока. Заметим, что этот процесс должен быть отменено после желаемой дозы была доставлена, если ограниченным по времени доставки лечения желательно. Кроме того, лечение может продолжаться в течение всего срока выборки (см. Рисунок 2). Пузырьки воздуха не должна быть введена в линии при переключениишприцы, так как они могут накапливаться в диализной мембраны и уменьшить зонд эффективности.
  13. Поведенческие тестирования. При выполнении поведенческие задачи, следует, что процедура (см. раздел 4 ниже). Отметим, что координация с доставкой лечение в гиппокамп имеет важное значение. Например, поставки инсулина должна быть приурочена к произойти 10 мин до начала тестирования 10. Таким образом, переход на инсулин-содержащих перфузат должно происходить за 30 мин до поведенческого тестирования (20 мин для перфузат пройти через линии плюс 10 мин желаемое время доставки впереди тестирования).
  14. Завершение сбора образцов. После сбора желаемых образцов, аккуратно извлеките зонд из головы животного, опять же не забывая учитывать временной лаг между диализом и отбора образцов. Вернуть животное в его родную клетку и внимательно следить за любой пост-экспериментального изменения в здоровье или поведение, пока животное не погибает, а мозг удалить, чтобы подтвердить правильностьЗонд размещения. Если жертва не произойдет немедленно, вернуть манекен стилет с канюлей, чтобы избежать введения инородных материалов.
  15. Анализ. Аналитическая методика будет варьироваться в зависимости от аналита (ов) интересов. Потому что диализ выборки не позволяет полное уравновешивание аналита на зонде мембраны, образцы концентрации должны быть исправлены, чтобы дать ECF концентраций с использованием нулевого чистого потока метод 11,12.

4. Поведенческие Тестирование

  1. Размещение на лабиринт. После базового образца (то есть, по крайней мере после трех образцов завершили диализа, но все еще ​​может быть отток трубки собираются), аккуратно переместить крысы в поведенческих аппарата тестирования. Любые соответствующие задачи могут быть использованы, данные на рисунке 1 были собраны, используя четыре руки, плюс форме лабиринта и измерения спонтанной смене, которая является мерой пространственной памяти работы: крыса изначально помещены в центртер лабиринт и позволили исследовать свободно 9,13. Потому что любой поведенческий тест может быть использован, основное внимание в этом протоколе не на конкретную задачу в качестве примера здесь (которые подробно изложены в другом 9,14,15), но вкратце, животных позволили исследовать лабиринт (период сером поле на рисунке 1) и использовать hippocampally-зависимые процессы сохранить память о которых оружием были недавно посетил.
  2. Диализа движения во время тестирования. Держа трубку так, что он движется свободно, и не препятствует движению крысы, ни будет разрешено двигаться в передней части животного и отвлечь его. Оставайтесь на месте и свести к минимуму собственные движения, так что вы не влияют на поведение крыс.
  3. Продолжение коллекции образцов. Как и в базовой, переместить отток труб в новую пробирку коллекции каждые 5 мин.
  4. Чередование тестирования. Дайте животным свободно исследовать лабиринт в течение 20 мин. Запишите последовательность и сроки руке записи либо с помощьюЗапись видео или вручную для последующего анализа выполнения задачи 9,15.

5. После тестирования

  1. Заключительный сбор образцов. После тестирования, удалите крыса осторожно из лабиринта и вернуться к Контрольной палаты. Продолжить сбор микродиализа образца, по крайней мере, четыре образца на период восстановления после выполнения задачи.
  2. Зонд удаления. Ведь образцы были собраны, аккуратно удалить зонд от головы животного и поместить в хранилище флаконе; вернуть животное к его дому клетке.
  3. Зонд хранения. После возвращения животного в доме клетку и комплектующие коллекцию оставшиеся диализата, промыть зонд тщательно дН 2 0 и хранить в сцинтилляционный флакон заполнен дН 2 0 и покрыты парафином. Промойте трубки, переключившись на шприц, содержащий раствор 1:10,000 Катон в дН 2 0, чтобы предотвратить рост микробов. Зонды могут быть повторно использованы, пока они сохраняют хороший поток, абез ущерба для мембраны; с осторожностью этом следует постоянно быть свыше десяти целей.
  4. Гистологии. Убить животное и удалить мозг. Slice на криостата и использовать стандартные гистологических методов (например, крезиловый окрашивания фиолетовый), чтобы подтвердить правильность размещения зонда.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Крысы должны быстро восстанавливаться после операции и быть начеку, подвижны и активны в течении 30 минут после прекращения анестезии. Влияние крышки канюля должна быть минимальной, если операция проводится чисто и минимальной зубной цемент используется. Если никаких признаков инфекции заметил во время послеоперационного мониторинга, или крысу в любом случае признаки бедствия или дискомфорт, немедленно прекратить эксперимент, это должно быть крайне редки. Во время обработки до испытания, животные должны быть начеку, свободно подвижные, дружелюбные и любознательные. Хорошо обрабатывается животные должны иметь существенно не наблюдается стресс, оставшиеся от операции, послеоперационного восстановления, или присутствие экспериментатора, это может быть подтвержден при желании путем измерения гормонов плазмы стресса (адреналина, глюкокортикоидов) и / или глюкозы 2,4 , 5.

Глюкозой мозга ECF, как правило, в диапазоне 0,5 - 1,5 мм, варьируется в зависимости от области мозга, хотя более высокие значенияможно увидеть в диабетических животных, в гиппокампе, исходных концентраций глюкозы на закрытии порядка 1,25 мм 6,12. В отсутствие каких-либо экзогенных лечения, окунуться в глюкозу ECF (и, обычно, рост ECF лактат) следует рассматривать, во время выполнения задания, в областях мозга, участвующих в посредничестве этой задачи (см. Рисунок 1 для примера): это отражает увеличение метаболической активности, вызванной нагрузкой когнитивных 9,14,16. Подобные изменения могут быть приняты в качестве доказательств того, что конкретные действия, повышает местный обмен веществ, как это видно, например, после острого введения инсулина с помощью дополнение к перфузат 7 (рис. 2).

В общем, хорошо ручкой животного должна выполнять поведенческие тестирование без признаков бедствия и без каких-либо признаков осведомленности о микродиализа трубки: признаки чрезмерного ухода, неподвижность, никаких признаков боли или попытки животных, чтобы удалить зонд указываютвероятно, недостаточная обработка и / или инфекции вокруг зонда сайте, и должны быть приняты как указание прекратить этот эксперимент.

Животные, получающих инсулин администрации должны, в дополнение к повышенным метаболизмом гиппокампа, показывают заметно улучшения пространственной памяти 7. Контроль, необработанных животных должны иметь среднюю производительность чередование на 4-руки лабиринт между 65 и 75% 7,9,14.

Рисунок 1
Рисунок 1. Task-связанной окунуться в гиппокампе глюкозы ECF (адаптировано из 9). Серые коробки период лабиринта тестирование на спонтанное чередование (SA). Фиолетовая линия показывает глюкозы в гиппокампе животных без лабиринт тестирование (но которые в противном случае обрабатываются одинаково). Красная линия измерений в животных выполнении 4-руки SA задачи; оранжевая линия показывает измерения в животных выполнении легче3-мя версии SA.

Рисунок 2
Рисунок 2. Изменения в гиппокампе глюкозы и лактата после введения инсулина через включение в перфузат (адаптировано из 7). Инсулин достигает гиппокампа в точке, указанном стрелкой, и вводят непрерывно после этого. Животные были протестированы в своих клетках дома, без поведенческих манипуляций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Все решения, используемые в микродиализа должны быть отфильтрованы непосредственно перед использованием, используя 0,2 мкм. После введения зонда в руководстве канюля, наблюдать, чтобы подтвердить, что поток беспрепятственно и пробы происходит. Если поток останавливается после введения, наиболее вероятной причиной является повреждение мембраны зонда, вызванные недостаточной помощи на вставку, и свежий датчик должен быть заменен.

Как отмечалось выше, основным преимуществом этих методов является отсутствие тупик, позволяющие как поведенческие и нейрохимические меры проснулся, свободно движущихся животных: чтобы воспользоваться этой обширной обработке перед тестированием необходимо для того, что животное будет безударные во время измерениях. Уравновешивания период, как правило, достаточно для обеспечения стабильного базового метаболизма, но еда может быть удален в течение 1-2 ч до тестирования при желании в целях обеспечения равномерного уровня глюкозы в крови через животных.

Thэлектронной двумя наиболее значительными ограничениями мД в качестве отбора проб являются: (I) ограничен размер анализируемого вещества и (II) возможность потери аналита в связи с адгезией в трубку. Бывший могут быть решены в некоторой степени использования мД зондов с большим молекулярным весом отсечки. Типичные коммерческие зонды позволяют отключений до 100 кДа, так что молекулы до 50 кДа, возможно, будет проходить через относительно беспрепятственно, однако, использование нижнего среза мембраны рекомендуется по возможности свести к минимуму любые потери образца с помощью ультрафильтрации на конце зонда. Адгезии молекул-мишеней к трубке это вопрос в первую очередь в случае пептида измерений, многие из которых, как правило, придерживаются FEP труб и, следовательно, снизить как восстановление аналита и точность измерений. Эта проблема может быть сведено к минимуму (I), предварительной обработки внутренней части трубы помощью перфузат которых 2% бычьего сывороточного альбумина был добавлен, выступая в качестве блокирующего агента, и (II) путем минимизации длины возвращения трубки: если пеEDED, легкий флакон коллекции могут быть прикреплены близко к оттоку зонд, хотя это создает дополнительные проблемы при переходе коллекцию трубы, не нарушая животных, особенно в период поведенческого тестирования. Одним из преимуществ метода является то, образцы, полученные в форме бесплатных продуктов распада клеток или больших молекул, таких как ферменты, и, как правило, подходит для прямого анализа с помощью инъекции в ВЭЖХ, MS или другой аналитической машины как есть, без необходимости дополнительной очистки , что также позволяет во многих случаях анализ нескольких аналитов в каждом образце (например, глюкозы и лактата показано на рисунке 2).

Вариации на использование обратного микродиализа доставить фармакологических методов лечения является использование двойного микроинъекции-микродиализа зондов, можно получить из нескольких источников. Тем не менее, отверстие инъекционным портом, как правило, очень узкие и склонны к блокировке, и это может быть трудно точноконтролировать сроки и / или объема лечения доставки. Эта альтернатива, следовательно, рекомендуется только для лечения, которые не поддаются доставка через включение в перфузат.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH / NIDDK (DK077106 к ECM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (6), 2881 (2000).
  2. McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56, (2), 66 (2001).
  3. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75, (3), 325 (2001).
  4. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  5. McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53, (2), 418 (2004).
  6. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  7. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75, (3), 325 (2001).
  8. McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55, (4), 1088 (2006).
  9. McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132, (1), 35 (2004).
  10. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  11. Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49, (3), 729 (1987).
  12. Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74, (3), 234 (1987).
  13. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (6), 2881 (2000).
  14. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93, (4), 546 (2010).
  15. Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
  16. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  17. Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26, (1), 91 (2002).
  18. Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5, (4), 358 (1986).
  19. McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87, (2), 298 (2006).
  20. McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18, (10), 3853 (1998).
  21. Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98, (4), 467 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics