Hippocampal microinjection और इंसुलिन

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Neuroscience

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Summary

Hippocampally निर्भर प्रत्यक्ष intrahippocampal microinjection द्वारा स्थानिक काम स्मृति के मॉडुलन के साथ, और द्वारा पीछा

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McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

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Abstract

ग्लूकोज चयापचय स्थानीय तंत्रिका गतिविधि के लिए एक उपयोगी मार्कर, 2 deoxyglucose और कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के रूप में इस तरह के तरीकों के आधार बनाने. हालांकि, पशु मॉडल में इस तरह के तरीकों के उपयोग संज्ञाहरण की आवश्यकता है और इसलिए दोनों मस्तिष्क राज्य बदल और व्यवहार उपायों से बचाता है. एक वैकल्पिक तरीका vivo microdialysis में उपयोग करने के लिए मस्तिष्क जाग, अनर्गल पशुओं में ग्लूकोज, लैक्टेट, और संबंधित चयापचयों का कोशिकी द्रव सांद्रता के निरंतर माप लेने है. यह तकनीक विशेष रूप से उपयोगी है जब विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों और / या तीव्र औषधीय हेरफेर पर भरोसा करने के लिए डिज़ाइन कार्यों के साथ संयुक्त है, उदाहरण के लिए, एक स्थानिक काम स्मृति कार्य के दौरान (सहज प्रत्यावर्तन) hippocampal माप कोशिकी ग्लूकोज और लैक्टेट में वृद्धि कर रहे हैं कि एक डुबकी दिखाओ बढ़ाया ग्लाइकोलाइसिस 1,2, और intrahippocampal इंसुलिन प्रशासन की विचारोत्तेजक दोनों स्मृति में सुधार और hippocampal glycol बढ़ जाती है3 ysis. इंसुलिन जैसे पदार्थ ही microdialysis चयापचयों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जांच के माध्यम से हिप्पोकैम्पस के लिए दिया जा सकता है. hippocampal समारोह का एक उपाय के रूप में सहज प्रत्यावर्तन का उपयोग करने के लिए तनावपूर्ण motivators (जैसे footshock), संयम, या पुरस्कार (जैसे भोजन), जो सभी के दोनों कार्य प्रदर्शन और चयापचय को बदल सकते हैं किसी भी उलझाना से बचने के लिए बनाया गया है, इस कार्य को भी एक प्रदान करता है मोटर गतिविधि के उपाय कि उपचार के nonspecific प्रभाव के लिए नियंत्रण परमिट. संयुक्त, इन तरीकों neurochemical और चयापचय चर व्यवहार के विनियमन के प्रत्यक्ष माप की अनुमति.

Protocol

1. सर्जरी तैयारी

  1. हैंडलिंग. पशु (सबसे अधिक चूहों या चूहों, हालांकि और व्यवहार परीक्षण के साथ microdialysis संयोजन के लिए विधि मोटे तौर पर किसी भी आवश्यक प्रजाति विशेष की जरूरत रूपांतरों के साथ एक सामान्य एक है, जैसे संज्ञाहरण के लिए) के लिए कम से कम 10 मिनट / दिन की एक न्यूनतम के लिए नियंत्रित किया जाता है दो दिनों सर्जरी से पहले. व्यापक से निपटने के लिए परीक्षण के समय में एक निर्बल राज्य में पशुओं को छोड़ संभव 2,4,5 उलझाना से परहेज करने के लिए दिखाया गया है. हम एक उदाहरण प्रजाति के रूप में इस प्रोटोकॉल भर में चूहों का प्रयोग करेंगे. यह सबसे अच्छा नंगे हाथों का उपयोग कर प्राप्त कर सकते हैं सुविधा पशुचिकित्सा और कर्मचारी स्वास्थ्य अधिकारियों के साथ विचार - विमर्श: हैंडलिंग जैसे लाटेकस या nitrile दस्ताने से फर पर खींच की वजह से तनाव के बिना किया जाना चाहिए. यदि यह संभव नहीं है, नरम सूती दस्ताने बाधा दस्ताने पर पहना जा 'चूहों के फर पर खींच से बचने चाहिए.
  2. बाँझ क्षेत्र तैयार. पहले सर्जरी शुरुआत, Surgicअल क्षेत्र के लिए तैयार है, एक बाँझ क्षेत्र stereotaxic तंत्र और चारों ओर एक बाँझ उपकरण भर में रखा कपड़ा तैयार है कि चूहे शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है एक हीटिंग पैड को कवर. एक परिसंचारी सटीक थर्मोस्टेट के साथ गर्म पानी पैड पशु के overheating रोकने के लिए किया जाता है.
  3. संज्ञाहरण प्रेरण. isoflurane vaporizer isoflurane के इष्टतम स्तर को नियंत्रित करने के लिए जाँच की है और प्रेरण कक्ष से जुड़ा है. कनेक्शन के लिए एक बंद लूप की पुष्टि करने के लिए जाँच कर रहे हैं. निर्वात एयर हैंडलिंग सिस्टम चालू होने की जाँच की है. Isoflurane वाष्पीकरण पर बंद है और पशु प्रेरण कक्ष में रखा ऑक्सीजन मिश्रण में एक 5% isoflurane का उपयोग: कि, 5 isoflurane% 100% ऑक्सीजन की एक धारा में जोड़ा और प्रेरण चैम्बर के लिए दिया.
  4. तंत्र में नियुक्ति. पशु stereotaxic earbars और एक दांत पट्टी का उपयोग तंत्र में सुरक्षित हैं. एक स्थिर सिर में सही earbar नियुक्ति परिणाम और कान कि earbars साथ फ्लैट झूठ. पशुतेजी से सुरक्षित और नाक एक उद्देश्य से डिजाइन संवेदनाहारी nosecone में डाला, vaporized isoflurane के प्रसव प्रेरण कक्ष से nosecone और चतनाशून्य करनेवाली औषधि मिश्रण ऑक्सीजन nosecone करने के लिए जा रहा धारा में 2-3 isoflurane% देने के लिए समायोजित करने के लिए बंद है.
  5. संज्ञाहरण की पुष्टि. एक शल्य चतनाशून्य करनेवाली औषधि विमान पैर और आंख के लिए हवा का एक कश एक कठिन चुटकी देने से पुष्टि की है, न तो किसी भी प्रतिक्रिया का कारण होना चाहिए. इन परीक्षणों सर्जरी भर में लगभग 15 मिनट के अंतराल पर दोहराया जाता है एक शल्य संवेदनाहारी विमान के रखरखाव की पुष्टि कर रहे हैं. बालों का चीरा साइट से हटा दिया है बाँझ क्षेत्र में प्रवेश करने से पहले.

2. सर्जरी

  1. पशु प्रारंभिक उपचार. नेत्र मरहम प्रत्येक नेत्रगोलक सुखाने को रोकने के लिए लागू किया जाता है. सुप्रीम कोर्ट 1 मिलीलीटर बाँझ खारा दिया जाता है करने के लिए सर्जरी के दौरान किसी भी निर्जलीकरण को रोकने के लिए, और शरीर एक बाँझ कपड़ा के साथ कवर किया जाता है. Betadine खोपड़ी के लिए लागू किया जाता है, और केंद्र से swabbedबाहर एक कपास झाड़ू से, 70% इथेनॉल swabbed इसी तरह है, और दो swabbing चरणों में दो बार दोहराया जाता है के लिए एक उपयुक्त चीरा साइट सुनिश्चित. त्वचा Betadine और शराब के लिए संपर्क समय कम से कम 3 मिनट चीरा के पहले होना चाहिए. संज्ञाहरण बनाए रखा है और नियमित रूप से जाँच सर्जरी भर carprofen 5 ग्राम / किग्रा) के एक ही सुप्रीम कोर्ट इंजेक्शन analgesia आरंभ करने के लिए दिया जाता है, और सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग किया जाता है. Analgesia संज्ञाहरण के अधिष्ठापन के लिए इंजेक्शन से किसी भी तनाव को कम करने के बाद दिया जाता है.
  2. चीरा और खोपड़ी तैयारी. एक 3-4 सेमी कटौती sagitally खोपड़ी के बीच में किया जाता है. Bupivicaine की एक 1:1 मिश्रण: एपिनेफ्रीन topically लागू है आगे analgesia प्रदान खून बह रहा है और कम से कम. खोपड़ी दूर चीरा शल्य क्लिप और बाँझ swabs खोपड़ी से overlying झिल्ली को दूर करने के लिए उपयोग किया जाता है का उपयोग से आयोजित किया जाता है. ड्रिलिंग के लिए निर्देशांक एक संदर्भ बिंदु के रूप में शीर्षस्थान का उपयोग कर मापा जाता है, एक बाँझ ड्रिल बिट (या, वैकल्पिक, एक हाथ से आयोजित दाग़ना देवी का उपयोग कर के रूप में चिह्नितसीई), और ड्रिलिंग शुरू होने से पहले सटीकता के लिए फिर से पुष्टि की. ब्याज (उदाहरण के यहाँ हिप्पोकैम्पस) के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए निर्देशांक एक मस्तिष्क एटलस का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं. Hippocampal microdialysis के लिए, हम 5.6 मिमी शीर्षस्थान के पीछे, पार्श्व 5.0, और 3.0 ड्यूरा से उदर में एक ड्रिल साइट का उपयोग करें.
  3. ड्रिलिंग. तीन छेद drilled खोपड़ी के माध्यम से कर रहे हैं, के साथ देखभाल करने के लिए केवल न्यूनतम ऐसी है कि ड्यूरा और अंतर्निहित झिल्ली को आघात कम या अनुपस्थित है बल लागू करने के लिए लिया जा रहा है. प्रवेशनी प्रविष्टि मापा साइट पर एक छेद है, अन्य दो खोपड़ी शिकंजा की प्रविष्टि के लिए सुविधाजनक के रूप में तैनात हैं. प्रयोजन आकार शिकंजा (उदाहरण के लिए 1.17 मिमी शिकंजा आत्म दोहन, ललित विज्ञान उपकरण) मस्तिष्क को प्रभावित नीचे बिना इन छेद में डाला जाता है, और बाद दंत सीमेंट आवेदन के लिए लंगर अंक के रूप में उपयोग किया जाता है.
  4. प्रवेशनी प्लेसमेंट और बंद. प्रवेशनी प्रविष्टि निर्देशांक, जो कर रहे हैं छेद drilled की साइट फिर पुष्टि पर तैनात है,और फिर धीरे धीरे लक्ष्य गहराई तक उतारा है. एक बार सही ढंग से तैनात प्रवेशनी दंत सीमेंट के साथ जगह में सुरक्षित है. यदि आवश्यक हो, एक एकल बाँझ सर्जिकल सिवनी घाव को बंद करने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रत्यक्षता बनाए रखने के एक ख़ंजर प्रवेशनी में डाला जाता है. इस प्रोटोकॉल में हम एक CMA12 जांच और गाइड प्रवेशनी (CMA microdialysis /) का उपयोग करें.
  5. शल्य चिकित्सा के बाद तीव्र देखभाल. सुप्रीम कोर्ट के 3 मिलीलीटर बाँझ खारा दिया जाता है जलयोजन जारी; carprofen 5 ग्राम / किलोग्राम की एक ही सुप्रीम कोर्ट इंजेक्शन) भी analgesia आरंभ करने के लिए दिया जाता है. पशु तंत्र से हटा रहे हैं और एक साफ पिंजरे में एक गर्म वसूली के कमरे में रखा, और निगरानी की, जब तक वे पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद कर रहे हैं. पूर्ण वसूली पलटा और सामान्य हरकत को ठीक करने की बहाली के द्वारा मूल्यांकन किया है. पशु तो उनके घर पिंजरे और नियमित होल्डिंग कमरे को लौट रहे हैं.
  6. लघु अवधि के देखभाल का पालन. जानवरों के पिंजरों है कि सर्जरी आया है सर्जरी की तारीख के साथ चिह्नित हैं. पशु प्रत्येक दिन कम से कम एक बार कम से कम thr के लिए निगरानी कर रहे हैंee दिनों सर्जरी के बाद, और सर्जरी और निम्नलिखित दो दिनों में से प्रत्येक के बाद एक दिन carprofen chewable गोली (2 मिलीग्राम) दिया. अगर पशुओं carprofen उपभोग नहीं करते, इंजेक्शन carprofen पर्याप्त analgesia को सुनिश्चित करने के लिए दी जा सकती है. दोनों जानवर और घाव संस्थागत जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों का पालन और जानवरों की देखभाल के कर्मचारियों या पशु चिकित्सक से सहायता या सलाह की मांग अगर जरूरत साइट (संक्रमण, लालिमा, आदि के लिए) के राज्य के समग्र स्वास्थ्य की निगरानी. महत्वपूर्ण बात ध्यान दें, कि उचित हैंडलिंग और experimenter दशानुकूलन आवश्यक है: जानवरों बड़े पैमाने पर नियंत्रित किया जाना चाहिए, प्रवेशनी हेरफेर सहित, घबराहट या तनाव का कोई संकेत तक रहता है जब experimenter द्वारा संभाला.
  7. बाद में पशुओं की देखभाल और उपचार. पशु अनुमोदित प्रोटोकॉल और उनके विशिष्ट प्रायोगिक समूह के अनुसार उपयुक्त परीक्षण और इच्छामृत्यु प्रक्रियाओं का पालन करेंगे.

3. Microdialysis (MD)

  1. Perfusतैयारी खा लिया. कृत्रिम कोशिकी द्रव (aECF) 153.5 मिमी ना, 4.3 मिमी, कश्मीर 0.41 मिमी मिलीग्राम, 0.71 मिमी Ca, 139.4 मिमी सीएल, 1.25 मिमी ग्लूकोज, पीएच 7.4 6 में buffered साथ किया जाता है कि सही द्रव संरचना जरूरी है. Inaccuracies या का उपयोग करें घंटी या microdialysis के लिए पीबीएस के रूप में अन्य, कम शारीरिक तरल पदार्थ की स्पष्ट रूप से गलत 6 परिणामों में परिणाम देगा. विशेष रूप से ध्यान दें, कि बाह्य द्रव (ECF) के ईओण संरचना सी.एस.एफ. की कि के रूप में ही नहीं है, क्योंकि हम एक 2004 hippocampal 6 ECF के विस्तृत अध्ययन में पता चला है. परीक्षण के दिन, गोजातीय सीरम albumin (BSA) 2% वजन / वजन में जोड़ा किया जाना चाहिए और पूरी तरह से भंग, यह पालन से टयूबिंग के लिए इंसुलिन के रूप में पेप्टाइड्स के नुकसान को कम कर देता है, और भी द्रव नुकसान होने का खतरा (ultrafiltration शामिल हैं) को कम कर देता है जांच झिल्ली पर. तैयारी के बाद, perfusate एक .2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए.
  2. यदि इंसुलिन के रूप में एक के इलाज के लिए ब्रा के लिए दिया जा रहा हैब्याज (यहाँ हिप्पोकैम्पस) के क्षेत्र में, इस उपचार का उपयोग कर उचित दवा एकाग्रता साथ तैयार aECF की अशेष भाजक तैयार. इंसुलिन के लिए, 400 एनएम के एक रिवर्स microdialysis के माध्यम से वितरण के लिए एकाग्रता (66.7 μU μl /) hippocampal चयापचय और संज्ञानात्मक समारोह 7 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है. ध्यान दें कि इंसुलिन के परिणामस्वरूप ऊतक एकाग्रता यहाँ मापा नहीं है और अनजान बनी हुई है.
  3. MD जांच और लाइनों की स्थापना. एक ताजा microdialysis जांच और परीक्षण से पहले दिन लाइन तैयार. इनफ्लो "और" बहिर्वाह "के लिए दो अलग - अलग लाइनों बनाएँ. FEP टयूबिंग 1 दो मीटर लंबे टुकड़े कनेक्ट करने के लिए और सुनिश्चित करें कि लाइनों के बीच कम से कम मृत अंतरिक्ष PE50 टयूबिंग का उपयोग करने के लिए. इनफ्लो एक 1 मिलीलीटर हैमिल्टन बाँझ फ़िल्टर, विआयनीकृत एच 2 0 (0 2 DH) के साथ भर सिरिंज के लिए टयूबिंग कनेक्ट है, और फिर जांच करने के लिए देते हैं.
  4. Microdialysis कुंडा. नि: शुल्क पशु आंदोलन के लिए अनुमति देते समय माप लेने के लिए, मैं एक तरल कुंडा कनेक्टnflow और बहिर्वाह लाइनों, पंप के करीब है, अतिरिक्त FEP टयूबिंग उपयोग कर. खाते में नमूना संग्रह के समय (नीचे) पर विचार करने में इस कुंडा और टयूबिंग के आंतरिक मात्रा लेने के लिए याद रखें.
  5. MD पंप की स्थापना. एमडी पंप पर मुड़ें और 1.5 / μl मिनट पर चलाने के लिए जब तक आप DH 0 2 पर जांच बहिर्वाह ट्यूब निकल. तब, जबकि पंप बंद कर दिया है, बहिर्वाह ट्यूब और एक नमूना संग्रह ट्यूब के बीच अन्य लाइन कनेक्ट. ट्यूब के माध्यम से 5 मिलीग्राम चलाने के लिए जांच और एक बाँझ DH 2 0 रातोंरात युक्त शीशी में जगह सुनिश्चित करना है कि जांच टिप हमेशा गीला रहता है.
  6. पूर्व परीक्षण के विषय जांच कर रही है. परीक्षण से पहले 24 घंटे, चूहा के सिर से डमी ख़ंजर हटाने और 10 मिनट के लिए एक एमडी जांच (नमूना लेने के लिए नहीं है, इस उद्देश्य के लिए ही प्रयोग किया जाता) सम्मिलित है. तो डमी ख़ंजर की जगह और चूहा अपने पिंजरे में वापस डाल दिया. इस प्रक्रिया के लिए 8 परीक्षण के दिन पर और हमारे हाथ में प्रतिक्रियाशील gliosis के किसी भी प्रभाव को कम करने के लिए बनाया गया है, यह अच्छा resul देता हैटीएस कि अन्य तकनीकों से डेटा मैच और hippocampal 2,5,7,9 सक्रियण को प्रतिबिंबित करने के लिए दिखाई देते हैं, दूसरों को एक समान दृष्टिकोण है कि जगह में माप है, जो भी एक अच्छा तरीका है करने के लिए पहले 24 घंटे के लिए जांच के पत्तों का इस्तेमाल किया है अगर क्षति रातोंरात जांच से बचा जा सकता है.
  7. जांच संतुलन. Microdialysis के दिन पर, फ़िल्टर्ड aECF के साथ हैमिल्टन सिरिंज और जगमगाहट शीशी भरने के लिए और के माध्यम से पंप करने के लिए 1 घंटे के लिए संतुलन में लाना. यदि आवश्यक हो, तो तैयार है (उदाहरण के लिए, इंसुलिन aECF) और सिरिंज पंप में उपचार जगह के साथ एक 2 हैमिल्टन सिरिंज भरें.
  8. जांच प्रविष्टि. जब प्रतितोलन पूरा हो गया है, डमी ख़ंजर हटाने और धीरे से चूहे के मस्तिष्क में प्रवेशनी के माध्यम से जांच equilibrated mD डालने. एक स्पष्ट प्लास्टिक बॉक्स जिसमें चूहा घर बिस्तर के कुछ में चूहे रखें. एक 1.6 मिलीलीटर microcentrifuge टयूबिंग पानी के साथ इस तरह है कि गुरुत्वाकर्षण microdi रहता में पिंजरे के बाहर भरा ट्यूब देते: counterbalance करने के लिए सुनिश्चित टयूबिंगalysis लाइनों unkinked लेकिन नहीं तना हुआ. जांच 2 घंटा के लिए चूहे में संतुलन में लाना. इस अवधि के शुरू में, perfusate के प्रवाह की पुष्टि को अनवरोधित कर है: यह सबसे अधिक आसानी से एक निर्धारित अवधि के पर perfusate बहिर्वाह संग्रह और नमूना वजन पुष्टि करते हैं कि उम्मीद की मात्रा प्रणाली निकल जाता है के द्वारा किया जाता है. किसी भी जांच है कि पैदावार की उम्मीद की मात्रा का 90%, और हटाने और फिर से प्रविष्टि के बाद खुद को सही नहीं है, प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए (edema जांच टिप पर अन्यथा परिणाम होगा). यदि प्रवाह लगातार कम या अनुपस्थित है, रिसाव के लिए सभी कनेक्शनों की जांच, असफल कि, चरणों में टयूबिंग काट करने के लिए देखने के लिए कि क्या रुकावट को अलग किया जा सकता है. यदि समस्या ठीक नहीं की पहचान की है, जांच की जगह, अगर समस्या का समाधान नहीं है, यह नया जांच और 3.3 धारा से लाइनों के साथ नए सिरे से शुरू करने के लिए आवश्यक हो सकता है. दो घंटे की अवधि के संतुलन रक्त मस्तिष्क बाधा जांच के आसपास reseal और जांच प्रविष्टि के किसी भी तीव्र प्रभाव से बचने के परमिट.
  9. नमूने इकट्ठा. सुनिश्चित करें कि सहनमूना (मस्तिष्क) से डायलिसिस और संग्रह (ट्यूब में) के बीच rrelation सही गणना की है. उदाहरण के लिए, कुंडा और जांच के बीच FEP टयूबिंग दो मीटर का उपयोग कर, जांच और 30 μl का संग्रह के बीच कुल मात्रा है और इसलिए यह 1.5 μl / नमूना के लिए न्यूनतम प्रवाह की दर में 20 मिनट लगते हैं जांच, टयूबिंग connectors के माध्यम से पारित और संग्रह के लिए टयूबिंग के अंत तक पहुँचने के लिए कुंडा. जब इकट्ठा करने नमूने सुनिश्चित करें कि आप पर्याप्त अपने assays के लिए आवश्यक एकाग्रता मात्रा एकत्रित. यहाँ, हम 5 मिनट नमूना डिब्बे का उपयोग होगा और इस प्रकार प्रत्येक संग्रह ट्यूब में 7.5 dialysate की μl इकट्ठा.
  10. आधारभूत नमूने हैं. एक बार संतुलन पूरा हो गया है, नमूना संग्रह शुरू करते हैं. कम से कम तीन नमूने ले लीजिए जबकि चूहे घर चैम्बर में आराम में है मापन की एक स्थिर आधारभूत स्थापित
  11. उपचार के समय. देखभाल करने के लिए उपचार की दीक्षा के लिए आवश्यक समय प्रयोग करने के लिए पहले गणना: याद है कि बस के रूप में वहाँ डायलिसिस के बीच एक समय अंतराल हैऔर नमूना संग्रह, सिरिंज छोड़ने और perfusate पशु हिप्पोकैम्पस पर पहुंचने के बीच एक अंतराल (आमतौर पर समान) है. इसलिए, सिरिंज और जांच के बीच एक 30 μl मात्रा के साथ हमारे सेटअप में, कि युक्त उपचार perfusate 20 मिनट पहले आप हिप्पोकैम्पस पर पहुंचने शुरू करने के लिए उपचार की कामना करने के लिए सिरिंज बदल जाते हैं.
  12. सीरिंज बदल रहा है. एक तरल स्विच अगर वांछित है, लेकिन जरूरी नहीं है इस्तेमाल किया जा सकता है: उचित समय पर, बस सिरिंज नियंत्रण perfusate से प्रवाह लाइन काट और तेजी से उपचार के perfusate सिरिंज से कनेक्ट. यह कोई अधिक से अधिक 5 सेकंड लेने के लिए perfusate प्रवाह महत्वपूर्ण रुकावट से बचना चाहिए. नोट है कि इस प्रक्रिया के बाद वांछित खुराक दिया गया है, अगर उपचार के प्रसव के समय सीमित वांछित है उलट जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, उपचार नमूने की अवधि के लिए जारी (चित्रा 2 देखें) हो सकता है. एयर लाइन में बुलबुले के स्विचन के दौरान नहीं पेश किया जाना चाहिएसीरिंज, के रूप में वे डायलिसिस झिल्ली पर जमा होता है और जांच की क्षमता को कम कर सकते हैं.
  13. व्यवहार परीक्षण. यदि एक व्यवहार कार्य प्रदर्शन, कि प्रक्रिया का पालन नोट (नीचे अनुभाग 4 देखें). कि हिप्पोकैम्पस को उपचार के वितरण के साथ समन्वय के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, इंसुलिन की डिलीवरी के लिए शुरुआत 10 का परीक्षण करने के लिए पहले 10 मिनट होती है समय पर किया जाना चाहिए. इसलिए, स्विच एक perfusate इंसुलिन युक्त व्यवहार का परीक्षण करने के लिए पहले 30 मिनट (20 मिनट के लिए perfusate लाइनों से अधिक 10 मिनट के माध्यम से वांछित वितरण आगे परीक्षण के समय पारित करने के लिए) हो जाना चाहिए.
  14. नमूना संग्रह के समापन. वांछित नमूने इकट्ठा करने के बाद, धीरे पशु सिर से जांच निकालने, फिर खाता डायलिसिस और नमूना संग्रह के बीच समय अंतराल में रखना याद. अपने घर पिंजरे पशु लौटें और स्वास्थ्य या व्यवहार में किसी भी परिवर्तन के बाद प्रयोगात्मक के लिए बारीकी से निरीक्षण जब तक जानवर को मार डाला है और मस्तिष्क के लिए सही की पुष्टि हटायाजांच प्लेसमेंट. यदि बलिदान तुरंत नहीं हो जाएगा, प्रवेशनी डमी ख़ंजर लौटने के लिए विदेशी सामग्री के किसी भी परिचय से बचने.
  15. विश्लेषण. विश्लेषणात्मक पद्धति ब्याज की analyte (ओं) पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. क्योंकि डायलिसिस नमूना जांच झिल्ली पर पूरा analyte संतुलन के लिए अनुमति नहीं है, नमूना सांद्रता ECF शून्य शुद्ध प्रवाह 11,12 विधि का उपयोग सांद्रता देने के लिए सही किया जाना चाहिए.

4. व्यवहार परीक्षण

  1. भूलभुलैया पर प्लेसमेंट. आधारभूत नमूने के बाद (यानी, के बाद से कम से कम तीन नमूनों डायलिसिस पूरा कर लिया है, लेकिन अभी भी एकत्र की जा रही बहिर्वाह टयूबिंग में हो सकता है), धीरे व्यवहार परीक्षण उपकरण में चूहा चाल है. उपयुक्त किसी भी काम में इस्तेमाल किया जा सकता है; चित्र 1 में डेटा का उपयोग कर एक चार हाथ भूलभुलैया से अधिक आकार और सहज प्रत्यावर्तन, जो स्थानिक काम स्मृति की एक उपाय है मापने एकत्र किए गए थे: चूहा शुरू केंद्रों में रखा गया हैभूलभुलैया के आतंकवाद और आज़ादी से 9,13 लगाने की अनुमति दी. क्योंकि किसी भी व्यवहार परीक्षण का इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल का एक उदाहरण यहाँ (है जो कहीं 9,14,15 विस्तृत है) के रूप में, लेकिन संक्षिप्त में इस्तेमाल किया विशिष्ट कार्य पर ध्यान केंद्रित नहीं है, जानवरों भूलभुलैया का पता लगाने (अवधि की अनुमति दी जाती है चित्रा 1 में ग्रे बॉक्स) और hippocampally निर्भर प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए हथियार जो की स्मृति बनाए रखने के लिए हाल ही में दौरा किया गया है.
  2. डायलिसिस परीक्षण के दौरान टयूबिंग आंदोलन. पकड़ो टयूबिंग ऐसी है कि यह स्वतंत्र रूप से चलता है, न तो चूहे के आंदोलन में बाधा उत्पन्न किया जा रहा है और न ही पशु के सामने में कदम है और यह विचलित करने की अनुमति दी. जगह में रहो और अपने खुद के आंदोलन को कम से कम इतना है कि आप चूहे के व्यवहार को प्रभावित नहीं करते.
  3. लगातर नमूना संग्रह. आधारभूत दौरान के रूप में, एक नया संग्रह ट्यूब बहिर्वाह टयूबिंग हर 5 मिनट चाल.
  4. प्रत्यावर्तन परीक्षण. पशु मुक्त रूप से 20 मिनट के लिए भूलभुलैया का पता लगाने के लिए अनुमति दें. अनुक्रम और हाथ प्रविष्टियों का समय या तो का उपयोग रिकार्डएक वीडियो रिकॉर्डिंग या बाद में कार्य प्रदर्शन 9,15 विश्लेषण के लिए हाथ से.

5. परीक्षण के बाद

  1. अंतिम नमूना संग्रह. परीक्षण के बाद, चूहा धीरे भूलभुलैया और कक्ष को नियंत्रित करने के लिए वापसी से दूर. कार्य प्रदर्शन से वसूली की अवधि को कवर करने के लिए कम से कम चार नमूनों के लिए microdialysis नमूना संग्रह जारी.
  2. जांच हटाने. के बाद सभी नमूनों को एकत्र किया गया है, धीरे पशु के सिर और जगह से एक भंडारण शीशी में जांच हटाने के लिए, अपने घर पिंजरे पशु वापसी.
  3. जांच भंडारण. घर पिंजरे पशु लौटने और किसी भी शेष dialysate के संग्रह को पूरा करने के बाद, जांच 2 0 DH और एक जगमगाहट साथ DH 2 0 भरा और parafilm के साथ कवर शीशी में दुकान के साथ अच्छी तरह कुल्ला. एक सिरिंज 2 0 DH में 1:10,000 kathon के एक समाधान युक्त सूक्ष्म जीव वृद्धि को रोकने के के लिए स्विचन द्वारा टयूबिंग फ्लश. जांच किया जा सकता है लंबे समय के रूप में फिर से इस्तेमाल किया जाता है, के रूप में वे अच्छा प्रवाह बनाए रखने औरझिल्ली को कोई नुकसान नहीं, इस देखभाल के साथ नियमित रूप से दस का उपयोग करता है की अधिक होना चाहिए.
  4. प्रोटोकॉल के. जानवर को मार डालो और मस्तिष्क को हटा दें. Cryostat पर स्लाइस और मानक histological तकनीक (जैसे cresyl बैंगनी धुंधला हो जाना) का उपयोग करने के लिए सही जांच नियुक्ति की पुष्टि करते हैं.

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Representative Results

चूहे तेजी से सर्जरी से उबरने और चेतावनी, गतिशील और 30 मिनट निम्नलिखित समाप्ति संज्ञाहरण के भीतर सक्रिय होना चाहिए. प्रवेशनी टोपी का प्रभाव कम से कम हो सकता है अगर सर्जरी सफाई से किया जाता है और न्यूनतम दंत सीमेंट का प्रयोग किया जाता है चाहिए. यदि संक्रमण के किसी भी संकेत पोस्ट ऑपरेटिव निगरानी के दौरान देखा जाता है, या चूहा किसी संकट या बेचैनी के संकेत दिखा रहा है, तुरंत प्रयोग को समाप्त कर रास्ते में है, यह अत्यंत दुर्लभ होना चाहिए. परीक्षण करने के लिए पहले से निपटने के दौरान जानवरों चेतावनी, स्वतंत्र रूप से गतिशील, दोस्ताना और जिज्ञासु होना चाहिए. अच्छी तरह से संभाला जानवरों अनिवार्य रूप से कोई नमूदार शल्य चिकित्सा, शल्य चिकित्सा के बाद वसूली, या प्रयोगकर्ता की उपस्थिति से शेष तनाव होना चाहिए, इस अगर प्लाज्मा तनाव हार्मोन के माप द्वारा वांछित की पुष्टि की जा सकता है (एपिनेफ्रीन, glucocorticoids) और / या 2,4 ग्लूकोज 5.

ब्रेन ECF ग्लूकोज 0.5 रेंज में आम तौर पर होता है - 1.5 मिमी, मस्तिष्क क्षेत्र द्वारा अलग, हालांकि उच्च मूल्योंमधुमेह पशुओं में देखा जा सकता है, हिप्पोकैम्पस में आधारभूत ग्लूकोज सांद्रता 1.25 6,12 मिमी के पास आदेश पर कर रहे हैं. किसी भी exogenous उपचार के अभाव में, ECF ग्लूकोज में एक डुबकी (और, आमतौर पर, ECF लैक्टेट में वृद्धि) कार्य प्रदर्शन के दौरान देखा जाना चाहिए, मस्तिष्क कि कार्य (उदाहरण के लिए देखें चित्र 1) mediating में शामिल क्षेत्रों में: यह दर्शाता है वृद्धि की चयापचय गतिविधि संज्ञानात्मक 9,14,16 लोड द्वारा प्रेरित किया. इसी तरह के परिवर्तन सबूत है कि एक विशेष उपचार (चित्रा 2) सात perfusate के अलावा के माध्यम से उदाहरण के लिए इंसुलिन की तीव्र प्रशासन के बाद देखा स्थानीय चयापचय बढ़ जाती है के रूप में लिया जा सकता है.

सामान्य में, एक अच्छी तरह से संभाला पशु संकट का कोई संकेत नहीं के साथ व्यवहार और microdialysis टयूबिंग के बारे में जागरूकता के किसी भी हस्ताक्षर के बिना परीक्षण प्रदर्शन करना चाहिए: अत्यधिक सौंदर्य, गतिहीनता, दर्द के कोई संकेत या जानवरों द्वारा प्रयास करने के लिए जांच निकालने से संकेत मिलता है के लक्षणअपर्याप्त होने की संभावना से निपटने और / या जांच स्थल के चारों ओर, संक्रमण और एक है कि प्रयोग को समाप्त करने के संकेत के रूप में लिया जाना चाहिए.

इंसुलिन प्रशासन प्राप्त पशु, बुलंद hippocampal चयापचय अलावा में, स्पष्ट रूप से बढ़ाया स्थानिक स्मृति 7 दिखाना चाहिए. नियंत्रण, अनुपचारित जानवरों के बीच 65 और 75% 7,9,14 की भूलभुलैया 4-हाथ पर मतलब प्रत्यावर्तन प्रदर्शन करना चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1 कार्य जुड़े hippocampal ECF ग्लूकोज (9 से अनुकूलित) में डुबकी. ग्रे बॉक्स सहज प्रत्यावर्तन (एसए) पर भूलभुलैया परीक्षण की अवधि है. बैंगनी लाइन कोई भूलभुलैया परीक्षण (लेकिन जो अन्यथा हूबहू संभाल रहे थे) के साथ पशुओं में hippocampal ग्लूकोज से पता चलता है. लाल रेखा 4 हाथ SA कार्य प्रदर्शन जानवरों में माप, नारंगी रेखा पशुओं में माप से पता चलता है आसान प्रदर्शन3 - हाथ एसए के संस्करण.

चित्रा 2
चित्रा 2 hippocampal और इंसुलिन की perfusate में शामिल किए जाने (7 से अनुकूलित) के माध्यम से प्रशासन के बाद ग्लूकोज लैक्टेट में बदलाव. इंसुलिन तीर द्वारा संकेत बिंदु पर हिप्पोकैम्पस तक पहुँच जाता है और उसके बाद लगातार प्रशासित. पशु उनके घर पिंजरों में कोई व्यवहार हेरफेर के साथ परीक्षण किया गया.

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Discussion

Microdialysis में इस्तेमाल समाधान तुरंत फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए और उपयोग करने के लिए पूर्व, एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग कर. गाइड प्रवेशनी में जांच की प्रविष्टि के बाद, पुष्टि करने के प्रवाह और बेरोक नमूना संग्रह हो रहा है कि निरीक्षण करते हैं. यदि प्रवाह प्रविष्टि के बाद बंद हो जाता है, सबसे संभावित कारण जांच प्रविष्टि पर अपर्याप्त देखभाल की वजह से झिल्ली को नुकसान है, और एक नए सिरे से जांच प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, इन तरीकों के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ उलझाना की कमी है, जाग, स्वतंत्र रूप से बढ़ने जानवरों में दोनों व्यवहार और neurochemical उपायों की अनुमति: इस का लाभ लेने के लिए, परीक्षण के लिए पहले व्यापक निपटने के क्रम में आवश्यक है कि पशु के दौरान बलरहित जा माप. संतुलन अवधि आम तौर पर एक स्थिर चयापचय आधारभूत प्रदान करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन भोजन 1-2 घंटे के लिए हटाया जा सकता है पूर्व परीक्षण करने के लिए अगर क्रम में पशुओं भर में एक समान रक्त शर्करा के स्तर को सुनिश्चित करने के लिए वांछित है.

गुएक नमूना तकनीक के रूप में दो सबसे महत्वपूर्ण एमडी की सीमाओं ई (i) analyte के आकार और टयूबिंग में आसंजन के कारण analyte के नुकसान के लिए संभावित (ii) प्रतिबंधित कर रहे हैं. पूर्व एमडी जांच के उपयोग के द्वारा एक बड़ा आणविक वजन cutoff के साथ कुछ हद तक alleviated किया जा सकता है. ठेठ वाणिज्यिक जांच केडी 100 अप करने के लिए cutoffs की अनुमति है, इतना है कि अप करने के अणुओं शायद 50 केडी अपेक्षाकृत बेरोक के माध्यम से पारित करेंगे, लेकिन, कम cutoff झिल्ली के उपयोग जहां संभव सिफारिश करने के लिए जांच टिप ultrafiltration के माध्यम से किसी भी नमूना नुकसान को कम करने के. टयूबिंग लक्ष्य अणुओं की आसंजन पेप्टाइड माप, जिनमें से कई टयूबिंग FEP और इसलिए दोनों analyte वसूली और माप सटीकता को कम करने का पालन करते हैं जाएगा के मामलों में मुख्य रूप से एक मुद्दा है. : (I) टयूबिंग की इंटीरियर पूर्व इलाज के लिए जो 2% गोजातीय सीरम albumin जोड़ दिया गया है, एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में अभिनय, और (ii) वापसी टयूबिंग की लंबाई कम से कम एक perfusate का उपयोग कर इस समस्या को कम किया जा सकता है अगर पूर्वोत्तरeded, एक हल्के संग्रह शीशी जांच के बहिर्वाह संलग्न किया जा सकता है, हालांकि यह जानवर व्यवहार परीक्षण के दौरान विशेष रूप से परेशान करने के बिना संग्रह ट्यूबों स्विचन में अतिरिक्त चुनौतियों poses. एमएस या अन्य विश्लेषणात्मक मशीनरी, तकनीक का एक फायदा यह है कि नमूने एक सेलुलर मलबे या एंजाइमों जैसे बड़े अणुओं के रूप में प्राप्त कर रहे हैं, और आम तौर पर HPLC में इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं आगे शोधन के लिए आवश्यकता के बिना के रूप में है , यह भी कई मामलों में प्रत्येक नमूने में एकाधिक analytes (जैसे ग्लूकोज और लैक्टेट माप 2 चित्र में दिखाया के रूप में) का विश्लेषण परमिट.

रिवर्स microdialysis का उपयोग करने के लिए औषधीय उपचार देने पर एक बदलाव के लिए दोहरी microinjection microdialysis जांच, कई स्रोतों से उपलब्ध का उपयोग करने के लिए है. हालांकि, इंजेक्शन बंदरगाह के बोर आम तौर पर बहुत ही संकीर्ण है और रुकावट की संभावना है, और यह करने के लिए सही मुश्किल हो सकता हैसमय और / या उपचार वितरण की मात्रा को नियंत्रित करते हैं. यह विकल्प इसलिए केवल उपचार है कि perfusate में शामिल किए जाने के माध्यम से वितरण के लिए उत्तरदायी नहीं हैं के लिए सिफारिश की है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम NIH / NIDDK (DK077106 ईसीएम के लिए) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

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References

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