Hippocampus insulin Mikroinjektion och

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Modulering av hippocampally-beroende rumsliga arbetsminne genom direkt intrahippocampal mikroinjektion tillsammans och följdes av

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Glukosmetabolismen är en användbar markör för lokal neural aktivitet, som utgör grunden för metoder såsom 2-deoxiglukos och funktionell magnetisk resonanstomografi. Men användning av sådana metoder i djurmodeller kräver narkos och därmed både förändrar hjärnans tillstånd och förhindrar beteendemässiga åtgärder. En alternativ metod är användningen av in vivo-mikrodialys att ta kontinuerlig mätning av hjärnans extracellulära vätska koncentrationer av glukos, laktat, och relaterade metaboliter i Vakna, ohämmad djur. Denna teknik är speciellt användbar när den kombineras med uppgifter som syftar till att förlita sig på specifika delar av hjärnan och / eller akut farmakologisk manipulation, exempelvis hippocampus mätningar under en rumslig arbetsminne uppgift (spontan växling) visar ett dopp i extracellulär glukos och ökad laktat som är tyder på ökad glykolys 1,2 och intrahippocampal insulin administration både förbättrar minnet och ökar hippocampus glykolysis 3. Ämnen såsom insulin kan avges till hippocampus via samma mikrodialyssond används för att mäta metaboliter. Användningen av spontana växling som ett mått på hippocampus funktion är utformad för att undvika förväxla från stressiga motivationsfaktorer (t.ex. fotchock), fasthållning, eller belöningar (t.ex. livsmedel), som alla kan ändra både uppgift prestanda och metabolism, denna uppgift ger också en mått på motorisk aktivitet som medger kontroll för ospecifika effekter av behandling. Tillsammans dessa metoder medger direkt mätning av neurokemiska och metaboliska variabler reglerar beteende.

Protocol

1. Kirurgi Förberedelser

  1. Hantering. Djur (vanligast, råttor eller möss, även om metoden för mikrodialys och kombination med beteendeterapi Testning är till stor del en allmän med begärd behövs artspecifika anpassningar, t.ex. för anestesi) hanteras i minst 10 min / dag i minst två dagar före operation. Omfattande hantering har visat att lämna djur i ett obelastat tillstånd vid tiden för testning, undvika eventuell förväxla 2,4,5. Vi kommer att använda råttor under detta protokoll som exempel art. Hantering måste göras utan stress som orsakas av att dra i päls från t.ex. latex eller nitril: detta kan bäst uppnås med bara händer, i samråd med anläggningen veterinären och anställda tjänstemän hälsa. Om detta inte är möjligt bör mjuk bomullsvantar bäras över barriär handskar för att undvika att dra på råttornas päls.
  2. Steril Fält Framställning. Före början kirurgi, Surgical området framställes ett sterilt fält framställd runt stereotaxisk apparat och en steril drapering placeras över apparaten, som omfattar en värmedyna som används för att upprätthålla temperaturen råtta kropp. Ett cirkulerande varmt vatten pad med noggrann termostat används för att förhindra överhettning av djuret.
  3. Anestesi induktion. Den isofluran förångare kontrolleras att innehålla optimala nivåer av isofluran och ansluten till induktion kammaren. Anslutningar kontrolleras för att bekräfta en sluten slinga. Air-hantering vakuumsystem kontrolleras vara i drift. Isofluran förångningen är påslagen och djuret placeras i induktion kammaren med användning av en 5% isofluran i syre mix: det är, sattes 5% isofluran i en ström av 100% syre och levereras till induktion kammaren.
  4. Placering i apparaten. Djuren är fästa i stereotaxisk apparat med earbars och en tand bar. Korrekt earbar placering resulterar i en orörlig huvud och öron som ligger platt längs earbars. Djursnabbt säkrad och näsan in i en för ändamålet särskilt utformade bedövningsmedel noskon, leverans av förångad isofluran växlas från induktion kammaren till noskonen och narkos blandningen justeras för att leverera 2-3% isofluran i syreströmmen går till noskonen.
  5. Bekräftelse av anestesi. En kirurgisk anestesi planet bekräftas genom att leverera en hård nypa till foten och en puff av luft för ögat, inte heller skulle orsaka något svar. Dessa tester upprepas ungefär 15 minuters intervall under hela operationen för att bekräfta underhåll av en kirurgisk anestesi plan. Hår avlägsnas från snittstället före inträdet i sterila området.

2. Kirurgi

  1. Djur initial behandling. Oftalmisk salva anbringas på varje ögongloben för att förhindra torkning. 1 ml steril saltlösning ges SC att förhindra uttorkning under operation, och kroppen är täckt med en steril duk. Betadine appliceras på hårbotten, och svabbas från centrumut med en bomullstuss, 70% etanol svabbas liknande, och de två badda steg upprepas två gånger till för att säkerställa en lämplig snitt webbplats. Hudkontakt tid för betadin och alkohol bör vara minst 3 min före snitt. Anestesi underhålls och kontrolleras regelbundet under operation, en enda subkutan injektion av karprofen 5 g / kg) ges för att initiera smärtlindring och aseptisk teknik används. Analgesi ges efter induktion av anestesi för att minimera stress från injektion.
  2. Snitt och skalle förberedelse. En 3-4 cm snitt görs sagitally i mitten av skallen. En 1:1 blandning av bupivicaine: epinefrin appliceras topiskt för att ge ytterligare analgesi och minimera blödning. Hårbotten hålls borta från snittet med kirurgiska clips och sterila kompresser används för att avlägsna överliggande membran från skallen. Koordinater för borrning mäts med bregma som referenspunkt, märkt med en steril borr (eller alternativt en handhållen diatermi device), och re-bekräftade för noggrannhet före borrning påbörjas. Koordinater för specifika delar av hjärnan av intresse (t.ex. här hippocampus) bestäms med ett hjärna atlas. För hippocampus mikrodialys använder vi en borrplatsen vid 5,6 mm posteriort bregma, 5,0 sidled och 3,0 ventrala från dura.
  3. Borrning. Tre hål borras genom skallen, med omsorg tas att gälla endast minimal kraft så att trauma till dura och underliggande membran är minimal eller saknas. Ett hål är vid den uppmätta stället för kanylen insättning, de andra två är placerade som praktiskt för införande av skallen skruvar. Syfte och medelstora skruvar (t.ex. 1,17 mm självgängande skruvar, Fine Science Tools) är införda i dessa hål utan att påverka hjärnan under, och används som förankringspunkter för efterföljande tandcement ansökan.
  4. Kanyl placering och stängning. Kanylen är placerad vid insättning koordinater, som åter-bekräftas vara platsen för det borrade hålet,och sedan långsamt sänks till måldjupet. När korrekt placerad, är kanylen fäst på plats med tandcement. Om det behövs, är en enda steril kirurgisk sutur som används för att tillsluta såret. En styrtråd förs in i kanylen för att upprätthålla öppenhet. I detta protokoll använder vi en CMA12 sond och guide kanyl (CMA / Microdialysis).
  5. Akut postoperativ vård. 3 ml steril koksaltlösning ges SC fortsätta hydrering, en enda subkutan injektion av karprofen 5 g / kg) ges också för att initiera smärtlindring. Djuren avlägsnades från anordningen och placerades i en uppvärmd återhämtning rum, i en ren bur och övervakas tills de återhämtat sig helt från anestesi. Fullständig återhämtning bedöms genom restaurering av rätande reflex och normal rörelse. Djuren sedan tillbaka till deras hem bur och regelbunden innehav rum.
  6. Kortfristig uppföljande vård. Burar av djur som har genomgått operation är markerade med datum för operationen. Djuren övervakas minst en gång varje dag i minst three dagar efter operationen, och med tanke ett karprofen tuggtablett (2 mg) dagen efter operationen och var och en av de två följande dagarna. Om djuren inte konsumera karprofen, kan injicerbara karprofen ges för att säkerställa tillräcklig smärtlindring. Övervaka både det allmänna hälsotillståndet i djuret och tillståndet i sårområdet (för infektion, rodnad etc.) efter institutionella riktlinjer djurskötsel och söker hjälp eller råd från djurskötsel personal eller veterinär om det behövs. Viktigt Observera att korrekt hantering och acklimatisering till försöksledaren är viktigt: djur bör behandlas utförligt, inklusive manipulation av kanylen, tills inga tecken på nervositet eller stress är när de hanteras av försöksledaren.
  7. Efterföljande djur vård och behandling. Djuren kommer att följa lämpliga tester och eutanasi förfaranden enligt den godkända protokoll och deras specifika experimentgrupp.

3. Mikrodialys (mD)

  1. Perfusåt beredningen. Konstgjord extracellulär vätska (aECF) görs med 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl 1,25 mM glukos, buffrad vid pH 7,4 6 OBS att korrekt flytande sammansättning är avgörande:. Felaktigheter eller använda av andra, mindre fysiologiska vätskor såsom Ringers eller PBS för mikrodialys kommer att resultera i markant felaktiga resultat 6. Specifikt notera att den joniska sammansättningen av den extracellulära vätskan (ECF) är inte samma som CSF, som vi visade i en 2004 detaljerad undersökning av hippocampus ECF 6. På dagen för testningen, bovint serumalbumin (BSA) bör tillsättas vid 2% vikt / vikt och fullständigt upplöst, vilket minskar förlusten av peptider såsom insulin från vidhäftning till röret, och även minskar risken för vätskeförlusten (ultrafiltrering) vid sondens membranet. Efter beredning ska perfusatet filtreras genom ett 0,2 pm filter.
  2. Om en behandling såsom insulin skall levereras till behåi regionen av intresse (här hippocampus), förbereda denna behandling med en alikvot av den framställda aECF med lämplig läkemedelskoncentration. För insulin, har en koncentration av 400 nM (66,7 pU / il) för leverans via omvänd mikrodialys visats påverka hippocampus metabolisk och kognitiv funktion 7. Notera att den resulterande vävnaden koncentrationen av insulin inte mäts här och förblir okänt.
  3. Ställa in mD sond och linjer. Bered en färsk mikrodialyssond och linje dagen före testning. Skapa två separata rader för "inflöde" och "utflöde". Använd PE50 slang för att ansluta två 1 meter långa bitar av FEP rör och se till att det är minimal dött utrymme mellan raderna. Anslut inflödet slangen till en 1 ml Hamilton spruta fylld med sterilfiltrerad, avjoniserat H 2 0 (dH 2 0), och sedan bifoga till sonden.
  4. Mikrodialys svivel. För att möjliggöra fri djurförflyttningar medan mätningar, anslut en vätska vridbar till inflow och linjer utflöde nära pumpen, med ytterligare FEP slang. Kom ihåg att ta den interna volymen av denna svivel och slang hänsyn överväger tidpunkten för provtagning (nedan).
  5. Ställa in mD pump. Slå på mD pumpen och kördes vid 1,5 | il / min tills man ser dH 2 0 lämnar slutstycket på proben. Sedan när pumpen är avstängd, anslut den andra linjen mellan slutstycket och ett provtagning rör. Kör 5 ml genom röret och placera sonden i en flaska innehållande steril dH 2 0 natten, se till att sondspetsen alltid förblir våt.
  6. Pre-sondering försöksperson. 24 timmar före testning, ta bort dummy sonden från råttans huvud och sätt en MD sond (används endast för detta ändamål, inte för provtagning) i 10 min. Sedan ersätta dummy nålen och sätta råttan tillbaka i sin bur. Detta förfarande är utformat för att minimera eventuella effekter av reaktiv glios på dagen att testa 8 och i våra händer, ger bra Results som matchar data från andra tekniker och verkar återspegla hippocampus aktivering 2,5,7,9, andra har använt en liknande metod som lämnar sonden på plats under 24 timmar före mätningen, som också är en bra metod om skador på sond natten kan undvikas.
  7. Sond jämviktning. På dagen för mikrodialys, fylla Hamilton-spruta och scintillationsampull med filtrerad aECF och pumpa igenom att jämvikt under 1 timme. Om det behövs, fyller en andra Hamilton-spruta med beredd behandling (t.ex., insulin-aECF) och plats i sprutpumpen.
  8. Sond insättning. När jämvikt är klar, ta bort dummy nålen och försiktigt in jämvikt mD sonden i råttans hjärna via kanyl. Placera råttan i en klar plastlåda som innehåller några av råttans hem sängkläder. Se till att motverka slangen: bifoga en 1,6 tub ml mikrocentrifug fylld med vatten till slangen utanför buren på ett sådant sätt att tyngdkraften håller microdialysis linjer unkinked men inte spänd. Låt sonden jämvikt i råtta under 2 timmar. I början av denna period bekräftar att flödet av perfusatet frigöras: detta görs enklast genom att samla perfusat utflöde under en viss period och väga provet för att bekräfta att den förväntade volymen lämnar systemet. Varje sond som ger <90% av förväntat volym och inte själv rätt efter avlägsnande och återinförande bör ersättas (annars ödem vid sondspetsen leder). Om flödet är ständigt låg eller obefintlig, kontrollera alla anslutningar för läckage, i brist därpå kopplar slangen i etapper för att se om blockeringen kan isoleras. Om problemet inte är identifierad, byt sonden, om problemet inte löser, kan det vara nödvändigt att börja om på nytt med nya sond och linjer från avsnitt 3.3. De två timmar jämviktsperiod medger blod-hjärnbarriären för att återförsluta runt sonden och undvika akuta effekten av prob insättning.
  9. Provtagning. Se till att samarbetetrrelation mellan prov dialys (från hjärnan) och insamling (i röret) är exakt beräknas. Till exempel, med användning av två meter FEP rör mellan svivel och sond, finns det en total volym mellan sond och insamling av 30 pl och därmed tar 20 min vid 1,5 | il / min flödeshastighet för prov att passera genom sonden, slangar, anslutningar och sväng för att nå slutet av slangen för indrivning. När insamling av prov se till att du samlar tillräckligt med volym för att ha koncentration som är nödvändig för dina analyser. Här kommer vi att använda 5 lådor min prov och därmed samla 7,5 pl dialysat i varje kollektion rör.
  10. Baseline prover. När jämvikt är klar börjar provtagning. Samla minst tre prover, medan råttan är i vila i hemmet kammaren att etablera en stabil baslinje mätningar
  11. Behandling timing. Var noga med att beräkna erforderlig tidpunkt för initiering av behandling före experimentet: kom ihåg att precis som det finns en tidsförskjutning mellan dialysoch provtagning, det finns en eftersläpning (vanligtvis identiska) mellan perfusat lämnar sprutan och anländer till djurets hippocampus. Därför, i vår installation med en 30 ul volym mellan spruta och sond, ändra sprutan till den som innehåller behandling-perfusat 20 min innan du vill att behandlingen ska börja anländer till hippocampus.
  12. Ändra sprutor. En flytande omkopplare kan användas om så önskas, men är inte nödvändigt: vid lämplig tidpunkt, bara koppla inflödet linje från kontroll-perfusatet spruta och snabbt ansluta till behandling-perfusatet spruta. Detta bör inte ta mer än 5 sekunder för att undvika betydande avbrott i perfusatet flödet. OBS att denna process bör vändas efter den önskade dosen har levererats, om en tidsbegränsad leverans av behandling önskas. Alternativt kan behandlingen fortsätta så länge provtagningen (se figur 2). Luftbubblor bör inte införas i ledningen under omkoppling avsprutor, eftersom de samlas på dialysmembranet och minska sond effektivitet.
  13. Behavioral testning. Om du utför ett beteende uppgift att följa detta förfarande (se avsnitt 4 nedan). OBS att samordning med leverans av behandling hippocampus är viktigt. Till exempel bör tillförsel av insulin kan tidsinställda att inträffa 10 minuter innan du påbörjar testning 10. Därför bör övergången till ett insulin-innehållande perfusat inträffa 30 min före beteendemässiga tester (20 min för perfusat att passera genom ledningarna plus 10 min önskad leveranstid före testning).
  14. Slutförande av provtagning. Efter insamling av önskade proverna försiktigt bort sonden från djurets huvud, återigen ihåg att ta hänsyn till tidsförskjutningen mellan dialys och provtagning. Tillbaka djuret till sitt hem bur och observera noga efter att efter experimentell förändring hälsotillstånd eller beteende till dess att djuret dödas och hjärnan avlägsnas för att bekräfta korrektsond placering. Om offer inte kommer att inträffa omedelbart, återlämna dummy mandrängen till kanylen för att undvika införsel av främmande material.
  15. Analys. Den analytiska metoden kommer att variera beroende på den analyt (er) av intresse. Eftersom dialys provtagning inte tillåter fullständig analyt jämvikt vid sondens membranet, bör provkoncentrationer korrigeras för att ge ECF koncentrationer med användning av noll-net-flux metod 11,12.

4. Behavioral Test

  1. Placering på labyrint. Efter baseline prover (dvs. efter minst tre prover har avslutat dialys, men kan ändå vara i utflödet slang som samlas in), försiktigt flytta råttan i beteendevetenskaplig testapparaten. Varje lämplig uppgift kan användas, data i figur 1 uppsamlades med användning av en fyra-armad plus-labyrint formade och mätning spontan alternering, vilket är ett mått på rumslig arbetsminne: råttan placeras först i cenTER av labyrinten och får utforska fritt 9,13. Eftersom varje beteende test kan användas, är i fokus för detta protokoll inte på den specifika uppgiften används som exempel här (som beskrivs på annat håll 9,14,15), men i korthet djuren får utforska labyrinten (perioden den grå rutan i figur 1) och använd hippocampally-beroende processer för att behålla minne vilka armar har nyligen besökts.
  2. Dialysrör rörelse under testning. Håll slangen så att den kan röra sig fritt, varken hindrar råttans rörelser eller vara tillåtet att röra framför djuret och distrahera den. Stanna på plats och minimera din egen rörelse så att du inte påverkar råttans beteende.
  3. Fortsatt provtagning. Liksom under baslinjen, flytta utflödet slang till en ny kollektion rör varje 5 min.
  4. Alternering testning. Låt djuret fritt undersöka labyrinten under 20 min. Spela sekvensen och tidpunkten för armen poster antingen meden videoinspelning eller för hand för senare uppgiften resultatanalys 9,15.

5. Post-test

  1. Sista provet samling. Efter testning, ta bort råtta försiktigt från labyrinten och återgå till styrkammaren. Fortsätt insamling mikrodialys prov för minst fyra prover för att täcka perioden för återhämtning från uppgift prestanda.
  2. Löstagbar givare. När alla prover har samlats in, försiktigt bort sonden från djurets huvud och plats i ett lager flaska, tillbaka djuret till sitt hem bur.
  3. Sond lagring. Efter att ha återvänt djur till hemmet bur och slutföra insamlingen av kvarvarande dialysat, skölj sonden noggrant med dH 2 0 och förvara i en scintillationsflaska fylld med dH 2 0 och täckt med parafilm. Spola slangen genom att byta till en spruta innehållande en lösning av 1:10.000 Kathon i dH 2 0 för att förhindra mikrobtillväxt. Prober kan återanvändas så länge som de bibehåller bra flöde och haringen skada på membranet, med försiktighet bör detta rutinmässigt vara över tio användningsområden.
  4. Histologi. Döda djur och ta bort hjärnan. Skiva på en kryostat och använda vanliga histologiska metoder (t.ex. kresylviolett färgning) för att bekräfta korrekt sond placering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Råttor bör återhämta sig snabbt från kirurgi och vara alert, rörlig och aktiv inom 30 minuter efter avslutad anestesi. Effekterna av kanylen locket bör vara minimal, om operationen utförs rent och minimal tandcement används. Om tecken på infektion upptäcks under den postoperativa övervakning eller råttan är på något sätt visar tecken på ångest eller obehag, omedelbart avsluta försöket, vilket borde vara extremt sällsynt. Under hanteringen före testning, bör djuren vara uppmärksamma, fritt rörliga, vänlig och nyfiken. Väl hanteras djur ska ha i huvudsak ingen observerbar belastning kvar från operation, postoperativ återhämtning eller förekomst av försöksledaren, vilket kan bekräftas om så önskas genom mätning av plasma stresshormoner (adrenalin, glukokortikoider) och / eller glukos 2,4 , 5.

Brain ECF glukos är typiskt i området 0,5 - 1,5 mM, varierande med hjärnregion, fastän högre värdenkan ses i diabetiska djur, i hippocampus, baseline glukoskoncentrationer är på nära storleksordningen 1,25 mM 6,12. I avsaknad av exogena behandling bör ett dopp i ECF glukos (och, vanligen, en ökning ECF laktat) ses under uppgift prestanda i hjärnan regioner som deltar i förmedling denna uppgift (se figur 1 för exempel): detta återspeglar den ökade metaboliska aktivitet inducerad av kognitiva belastningen 9,14,16. Liknande förändringar kan tas som bevis för att en viss behandling ökar lokal metabolism, såsom framgår t ex efter akut administrering av insulin via tillsats till perfusatet 7 (figur 2).

I allmänhet bör en väl handtag djur utföra beteende tester utan några tecken på ångest och utan tecken på medvetenhet om mikrodialys slangen: tecken på överdrivet putsande, orörlighet, någon indikation på smärta eller försök djuret att ta bort sonden visarsannolikt otillräcklig hantering och / eller infektion runt sonden webbplatsen och bör ses som en indikation på att avsluta experimentet.

Djur som fick insulin administrering bör, utöver förhöjda hippocampus ämnesomsättning, påvisa märkbart ökad fysisk minne 7. Kontroll bör obehandlade djur har genomsnittlig växling prestanda på 4-arm labyrint av mellan 65 och 75% 7,9,14.

Figur 1
Figur 1. Task-associerade dopp i hippocampus ECF glukos (anpassad från 9). Grå box är tiden för labyrinten tester på spontan växling (SA). Lila linjen visar hippocampus glukos hos djur utan labyrint testning (men som var på annat sätt hanteras identiskt). Röd linje är mätningar i djur som utför 4-arm SA uppgift, orange linje visar mätningar i djur utför enklare3-arm version av SA.

Figur 2
Figur 2. Förändringar i hippocampus glukos och laktat efter administrering av insulin genom införandet i perfusatet (anpassad från 7). Insulin når hippocampus vid den punkt som anges av pilen och administreras kontinuerligt därefter. Djuren testades i deras hem burar, utan beteendevetenskaplig manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alla lösningar som används i mikrodialys bör filtreras omedelbart före användning, med användning av en 0,2 | im filter. Efter insättning av sonden i styrningen kanylen, observera att bekräfta att flödet obehindrad och provsamling sker. Om flödet avbryts efter införandet, är den troligaste orsaken skador på sonden membranet som orsakas av otillräcklig vård på insättning, och en ny sond måste ersättas.

Som nämnts ovan är en viktig fördel med dessa metoder bristen på förväxla, tillåter både beteende-och neurokemiska åtgärder i Vakna, fritt rörliga djur att dra fördel av detta, är omfattande hantering före testning nödvändig för att djuret ska obelastat under mätningar. Den jämviktsperiod är i allmänhet tillräcklig för att ge en stabil metabolisk baslinje, men mat kan avlägsnas för 1-2 timmar före testning, om så önskas, för att säkerställa enhetliga blodsockernivåer mellan djur.

The två mest betydande begränsningar av MD som provtagningsteknik är (i) begränsade storlek analyt och (ii) risken för förlust av analyt grund vidhäftning i slangen. Den förstnämnda kan lindras i viss utsträckning genom användning av mD sönder med en större molekylvikt cutoff. Typiska kommersiella sonder tillåter cutoffs upp till 100 kD, så att molekyler av upp kanske 50 kD kommer att passera genom relativt obehindrat, men användningen av lägre cutoff membran rekommenderas där så är möjligt för att minimera eventuella provförlust via ultrafiltrering vid sondens spets. Vidhäftning av målmolekyler till slangen är en fråga främst i fall av peptid mätningar, av vilka många tenderar att följa FEP rör och därmed minska både analyt återhämtning och mätnoggrannhet. Detta problem kan minimeras genom (i) förbehandling av inre av röret med hjälp av en perfusat till vilken 2% bovint serumalbumin har tillsatts, i egenskap som ett blockeringsmedel, och (ii) genom att minimera längden av avkastningen slangen: om neEDED, kan en lätt uppsamlingskärl fästas nära utflödet av sonden, även om detta innebär ytterligare utmaningar byta uppsamlingsrör utan att störa djuret, särskilt under beteendetestning. En fördel med tekniken är att sampel erhålls i en form fri från cellulärt skräp eller stora molekyler, såsom enzymer, och är generellt lämpliga för direkt analys via injektion i HPLC, MS eller annan analytisk maskiner som-är utan behov av ytterligare rening , detta medger också i många fall en analys av flera analyter i varje prov (såsom glukos och laktat mätningar som visas i figur 2).

En variation på användningen av omvänt mikrodialys att leverera farmakologiska behandlingar är att använda dubbla mikroinjektion-mikrodialys prober, tillgängliga från flera källor. Emellertid är hålet i injektionsporten allmänhet mycket smal och benägna att blockering, och det kan vara svårt att exaktstyra tidpunkten och / eller volymen av behandlingen leverans. Detta alternativ är därför rekommenderas endast för behandling som inte är mottagliga för leverans via ingå i perfusatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH / NIDDK (DK077106 till ECM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (6), 2881 (2000).
  2. McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56, (2), 66 (2001).
  3. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75, (3), 325 (2001).
  4. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  5. McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53, (2), 418 (2004).
  6. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  7. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75, (3), 325 (2001).
  8. McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55, (4), 1088 (2006).
  9. McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132, (1), 35 (2004).
  10. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  11. Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49, (3), 729 (1987).
  12. Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74, (3), 234 (1987).
  13. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (6), 2881 (2000).
  14. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93, (4), 546 (2010).
  15. Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
  16. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  17. Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26, (1), 91 (2002).
  18. Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5, (4), 358 (1986).
  19. McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87, (2), 298 (2006).
  20. McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18, (10), 3853 (1998).
  21. Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98, (4), 467 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics