Microinjection האינסולין היפוקמפוס ו

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אפנון של זכרון עבודה המרחבי hippocampally תלוי על ידי microinjection intrahippocampal הישיר, מלווה ואחרי

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חילוף חומרים של הגלוקוז הוא סמן שימושי לפעילות עצבית מקומית, ויצר את הבסיס של שיטות כגון הדמיה בתהודה מגנטית 2 deoxyglucose ופונקציונלית. עם זאת, שימוש בשיטות כאלה במודלים של בעלי חיים דורש הרדמה ומכאן גם משנה את מצב המוח ומונע באמצעים התנהגותיים. שיטה חלופית היא השימוש בmicrodialysis vivo לקחת מדידה רציפה של ריכוזי נוזל תאיים מוח של סוכר, חומצת חלב, וקשורים בבעלי חי מטבוליטים ערים, חסרי רסן. טכניקה זו שימושית במיוחד בשילוב עם משימות שנועדו להסתמך על אזורים ספציפיים במוח ו / או מניפולציה תרופתית חריפה, לדוגמה, מדידות היפוקמפוס במהלך משימת זכרון עבודה המרחבי (לסירוגין ספונטני) להראות לטבול בסוכר תאי ועלייה בחומצת חלב שהם רמיזות של 1,2 המשופר הגליקוליזה, וממשל האינסולין intrahippocampal גם משפרת את הזיכרון ומגבירה גליקול היפוקמפוסיסיס 3. חומרים כגון אינסולין יכולים להיות מועברים ליפוקמפוס באמצעות אותה בדיקת microdialysis משמשת למדידת המטבוליטים. השימוש בהתחלפות ספונטנית כמדד לתפקוד היפוקמפוס נועד כדי למנוע כל בלבול ממניעים מלחיצים (footshock למשל), ריסון, או כפרס (למשל מזון), שכולם יכולים לשנות את שני ביצועי משימה ואת חילוף חומרים; משימה זו גם מספקת מדד של פעילות מוטורית שמאפשרת שליטה לתופעות לא ספציפיות של טיפול. משולב, שיטות אלו מאפשרות מדידה ישירה של משתני neurochemical וחילוף חומרי ויסות התנהגות.

Protocol

1. הכנת ניתוח

  1. טיפול. בעלי חיים (הנפוץ ביותר, חולדות או עכברים, למרות שהשיטה לmicrodialysis ושילוב עם בדיקה התנהגותית היא במידה רבה אחד כללי עם התאמות הנדרשות לכל מינים ספציפיים דרושות, למשל עבור הרדמה) מטופלות למינימום של 10 דקות / יום לפחות ימים לפני הניתוח. טיפול נרחב הוכח לעזוב בעלי חיים במדינה בלתי מוטעמת בעת הבדיקה, הימנעות לבלבל אפשרי 2,4,5. אנו נשתמש בחולדות לאורך פרוטוקול זה כמין דוגמה. טיפול צריך להיעשות בלי לחץ שנגרם על ידי משייכת פרווה מלטקס למשל או כפפות nitrile: זו יכולה להיות מושגת הטובה ביותר באמצעות ידות חשופות, בהתייעצות עם הווטרינר של המתקן ופקידי בריאות עובדים. אם זה לא אפשרי, כפפות כותנה רכות יש ללבוש כפפות על מכשול כדי למנוע משייכת הפרווה של החולדות.
  2. הכנת השדה סטרילי. לפני תחילת ניתוח, surgicאזור אל מוכן, שדה סטרילי שהוכן סביב מנגנון stereotaxic ווילון סטרילי פוזר לרוחב המכשיר, כיסוי כרית חימום המשמש לשמירה על חום גוף חולדה. כרית מים חמה במחזור עם תרמוסטט המדויק משמשת למניעת התחממות יתר של בעלי החיים.
  3. אינדוקצית הרדמה. מאדה isoflurane נבדק למכילה רמות אופטימליות של isoflurane ומחובר לתא האינדוקציה. חיבורים נבדקים כדי לאשר לולאה סגורה. מערכת ואקום אוויר הטיפול נבדקת להיות מבצעי. אידוי isoflurane הוא מופעל והחיה להציב לתוך התא באמצעות האינדוקציה 5% isoflurane בתערובת חמצן: כלומר, 5% isoflurane הוסיפו לזרם של חמצן 100%, ונמסרו ללשכת הגיוס.
  4. מיקום במכשיר. בעלי חיים מובטחים במנגנון stereotaxic באמצעות earbars ובר שן. תוצאות נכונות earbar שמה בראש נייח ואוזניים ששוכב במאוזן לאורך earbars. בעלי חייםמובטחים במהירות ואף מוכנסים לתוך מטרה מעוצבת הרדמת מכסה חרטום; המסירה מתאדה isoflurane הוא עבר מחדר לאינדוקצית מכסה החרטום והתמהיל המותאמים להרדמה לספק 2-3% isoflurane לתוך זרם החמצן הולך מכסה החרטום.
  5. אישור של הרדמה. מטוס הרדמה כירורגית אושר על ידי אספקת צביטה קשה לכף הרגל ומשב האוויר לעין, וכך גם צריך לגרום לכל תגובה. בדיקות אלו חזרו בבערך 15 דקות ברחבי מרווחי ניתוח כדי לאשר התחזוקה של מטוס הרדמה כירורגית. שיער יוסר מאתר החתך לפני הכניסה לשדה סטרילי.

2. כירורגיה

  1. טיפול ראשוני בבעלי החיים. משחה לרפואת עיניים מוחלת על כל גלגל עין כדי למנוע התייבשות. סליין סטרילי 1 המ"ל ניתן sc כדי למנוע התייבשות במהלך ניתוח, וגופו מכוסה בוילון סטרילי. פולידין מוחל על הקרקפת, וניקה מהמרכזיצאתי עם מקלון צמר גפן; אתנול 70% הוא חוטא בצורה דומה, ושני הצעדים הסחיטים חוזרים פעמים נוספות כדי להבטיח אתר חתך מתאים. זמן מגע של עור לפולידין ואלכוהול צריך להיות לפחות 3 דקות לפני החתך. הרדמה נשמרה ונבדקת באופן קבוע לאורך כל ניתוח, זריקה אחת של sc carprofen 5 גרם / ק"ג) ניתן ליזום כאבים, וטכניקת aseptic משמשת. שיכוך כאבים ניתן בעקבות אינדוקציה של הרדמה כדי למזער את כל לחץ מהזרקה.
  2. חתך והכנת גולגולת. חתך 3-4 סנטימטר עשוי sagitally במרכז הגולגולת. תמהיל של 01:01 bupivicaine: אפינפרין הוא למריחה על עור כדי לספק שיכוך כאבים נוסף ולמזער את הדימום. הקרקפת מתקיימת הרחק מהחתך ניתוחיים ושימוש בפריטי מטליות סטריליות המשמשות להסרת קרומים שמעליה מהגולגולת. קואורדינטות לקידוח נמדדות באמצעות גבחת כנקודת ייחוס, מסומן באמצעות מקדח סטרילי (או, לחלופין, כווייה דוויה כף ידלסה"נ), ואשר מחדש-לדיוק לפני תחילת קידוח. קואורדינטות לאיזורים מסוימים במוח של עניין (למשל כאן היפוקמפוס) נקבעות באמצעות אטלס מוח. לmicrodialysis היפוקמפוס, אנו משתמשים באתר קידוח על 5.6 מ"מ אחורי לגבחת, 5.0 רוחב, ו 3.0 גחון מדורה.
  3. קידוח. שלושה חורים הם קדחו בגולגולת, בזהירות ננקטת כדי הפעיל כוח מינימאלי בלבד כגון שטראומה לדורה והקרומים בסיסיים היא מינימאלית או לא קיים. חור אחד נמצא באתר הנמדד של צינורית כניסה: שני האחרים ממוקמים כנוח להחדרת ברגים בגולגולת. ברגי מטרה בגודל (למשל 1.17 מ"מ ברגים עצמיים מקישים; הגדרות מדע פיין) מוכנסים לתוך החורים האלה מבלי להשפיע על המוח שמתחת, והם משמשים כנקודתי עיגון ליישום בטון שיניים לאחר מכן.
  4. מיקום וסגירת צינורית. הצינורית ממוקמת בכניסת קואורדינטות, אשר אשרו מחדש כדי להיות באתר של קדח החור,ואז הוא הוריד לאט לעומק המטרה. לאחר שהתמקם בצורה נכונה, הצינורית מאובטחת במקום במלט שיניים. במידת צורך, תפר כירורגי סטרילי יחיד משמש כדי לסגור את הפצע. Stylet מוכנס לתוך הצינורית כדי לשמור patency. בפרוטוקול זה אנו משתמשים CMA12 חללית ומדריך צינורית (/ Microdialysis CMA).
  5. טיפול אקוטי לאחר הניתוח. סליין סטרילי 3 מ"ל ניתן sc להמשיך בנוזלים; הזרקת sc יחידה של carprofen 5 גרם / ק"ג) ניתנת גם ליזום שיכוך כאבים. בעלי חיים הוסרו מהמכשיר והניחו בחדר התאוששות מחוממת, בכלוב נקי, ומעקב עד שהתאוששו לגמרי מהרדמה. החלמה מלאה מוערכת על ידי שיקום של תיקון תנועת רפלקס ונורמלית. בעלי חיים ולאחר מכן הוחזרו לכלוב ביתם וחדר ההמתנה הרגיל.
  6. קצר טווח למעקב טיפול. כלובים של בעלי חיים שעברו ניתוח מסומנים במועד הניתוח. בעלי חיים נמצאים במעקב לפחות פעם אחת בכל יום לפחות thrימי א 'א' לאחר ניתוח, וקבלו את אחת carprofen לעיסת טבליות (2 מ"ג) ביום שלאחר ניתוח, וכל אחד משני הימים הבאים. אם בעלי חיים לא לצרוך carprofen, carprofen זריקות יכול להינתן על מנת להבטיח אלחוש הולם. לפקח גם על הבריאות הכללית של החיה והמצב של אתר הפצע (לדלקת, אדמומיות וכו ') בעקבות הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיות ומחפשים סיוע או ייעוץ מצוות טיפול בבעלי חיים או לווטרינר במידת צורך. חשוב לציין, לציין כי טיפול מתאים והסתגלות לנסיין חיוני: בעלי חיים צריכים להיות מטופל באופן נרחב, כולל מניפולציה של הצינורית, עד ששום סימן של עצבנות או מתח נותר כאשר מטופלים על ידי הנסיין.
  7. טיפול בבעלי חיים ולאחר טיפול. בעלי החיים יעברו הליכי בדיקה והמתת חסד מתאימים על פי הפרוטוקול שאושר וקבוצת הניסוי הספציפית שלהם.

3. Microdialysis (MD)

  1. Perfusאכלתי הכנה. נוזל חוץ תאי מלאכותי (aECF) הוא עשה עם 153.5 המ"מ Na, 4.3 mM K, 0.41 המ"מ Mg, 0.71 mM Ca, 139.4 המ"מ Cl, גלוקוז mM 1.25, שנאגר ב-pH 7.4 6 הערה כי רכב נוזל מדויק חיוני:. אי דיוקים או להשתמש של נוזלים אחרים, פחות פיסיולוגיים כמו צלצול של PBS או לmicrodialysis יביא לתוצאות משמעותיות מוטעות 6. באופן ספציפי, שים לב כי הרכב היוני של נוזל החוץ התאי (ECF) אינו זהה לזה של CSF, כפי שהראינו במחקר מפורט 2004 של ECF היפוקמפוס 6. ביום הבדיקה, שור אלבומין (BSA) יש להוסיף במשקל 2% / משקל והמסה מלאה, זה מפחית אובדן של פפטידים כגון אינסולין מהיצמדות לצינורות, וגם מקטין את הסיכון של איבוד נוזלים (ultrafiltration) בקרום החללית. לאחר הכנה, perfusate צריך להיות מסונן דרך מסנן .2 מיקרומטר.
  2. אם טיפול כגון אינסולין הוא יימסר לחזייהבאזור של עניין (כאן היפוקמפוס), להכין את הטיפול הזה באמצעות aliquot של aECF המוכן עם ריכוז התרופה המתאימה. לאינסולין, ריכוז של 400 ננומטר (66.7 / μl μU) עבור משלוח באמצעות microdialysis ההפוך הוכח משפיע מטבולית היפוקמפוס ותפקוד הקוגניטיבי 7. שים לב שריכוז הרקמה המתקבלת של אינסולין אינו נמדד כאן ונותר עלום.
  3. הגדרת בדיקת MD וקווים. הכן את חללית microdialysis רעננה וקו ביום שלפני הבדיקה. צור שני קווים נפרדים ל" זרימה "ו" יצוא". השתמש PE50 צינורות לחבר שתי חתיכות ארוכות 1 מטר של צינורות FEP ולהבטיח כי יש שטח מת מינימאלי בין השורות. חבור את צינור ההזרמה למזרק 1 מיליליטר המילטון מלא סטרילי בפילטר, H 2 0 deionized (DH 2 0), ולאחר מכן לצרף את החללית.
  4. מסתובב Microdialysis. כדי לאפשר לתנועת בעלי חיים חופשיות בזמן מדידות, להתחבר המסתובב הנוזלnflow וקווי יצוא, קרוב למשאבה, באמצעות צינורות FEP נוספים. זכור לקחת את הנפח הפנימי של סיבוב וצינור זה בחשבון בשוקל עיתוי של איסוף דגימה (להלן).
  5. הגדרת משאבת MD. הפעל את משאבת MD ולהפעיל על 1.5 μl / דקות עד שתראה DH 2 0 יציאת צינור הניקוז בחללית. ואז, בזמן שהמשאבה כבויה, חבר את הקו השני בין צינור הניקוז וצינור איסוף דגימה. הפעלת 5 מ"ל דרך הצינור ולמקם את החללית בבקבוקון המכיל DH 2 0 סטרילי הלילה; להבטיח שבדיקת הקצה תמיד נשאר רטוב.
  6. טרום חיטוט נושא הבדיקה. 24 שעות לפני הבדיקה, הסירו את stylet הדמה מהראש של החולדה ולהכניס MD חללית (משמש רק למטרה זו, ולא לדגימה) למשך 10 דקות. ואז להחליף את stylet הדמה והכניס את העכבר בחזרה לכלוב שלה. הליך זה נועד כדי למזער את ההשפעה של דבק תגובתי ביום בדיקת 8 ובידות שלנו, זה נותן לי resul טובts התואם נתונים מטכניקות אחרות ונראה שמשקפים הפעלת היפוקמפוס 2,5,7,9, אחרים השתמשו בגישה דומה שמשאירה את החללית במקום במשך 24 שעות שקדמו למדידה, שהיא גם גישה טובה אם ניזק חללית הלילה ניתן להימנע מכך.
  7. איזון חללית. ביום microdialysis, למלא את מזרק המילטון ובקבוקון נצנץ עם aECF המסונן ולשאוב דרך לאזן לשעה 1. במידת צורך, למלא מזרק שני המילטון עם טיפול מוכן (למשל, האינסולין aECF) ומקום למשאבת המזרק.
  8. הכנסת חללית. כאשר האיזון הוא מוחלט, הסר את stylet הדמה ועדינות להכניס את חללית MD מתאזן לתוך המוחה של החולדה באמצעות הצינורית. הנח את העכבר לקופסא פלסטיק שקופה המכילה חלק ממצעי הבית של החולדה. הקפד לאזן את הצינורות: צינור לצרף microcentrifuge מ"ל 1.6 מלאים במים לצינורות מחוץ לכלוב בצורה כזו שהכבידה שומרת microdiקווי alysis מגוללים אך לא מתוח. בואו חללית לאזן בחולדה ל2 שעות. בתחילתה של תקופה זו, שמאשר הזרימה של perfusate הוא חסימה: זה נעשה בקלות על ידי איסוף יצוא perfusate בפרק זמן קבוע ובמשקל של הדגימה כדי לוודא שהנפח הצפוי הוא יציאת המערכת. כל חללית שתשואות <90% מהנפח צפוי, ואינו עצמי נכון לאחר הסרה והכנסה מחדש, וצריכות להחליף (אחרת בצקת בבדיקת הקצה תגרום). אם הזרימה היא נמוכה באופן עקבי או חסרה, בדוק את כל החיבורים לדליפה; כושל ש, ניתק צינורות בשלבים כדי לראות האם החסימה יכולה להיות מבודדת. אם הבעיה לא זוהתה, להחליף את הבדיקה, אם הבעיה אינה נפתרת, ייתכן שיהיה צורך להתחיל מחדש עם חללית ושורות מהסעיף 3.3 חדשות. תקופת ההתאזנות של השעות מתירה את מחסום דם מוח reseal סביב הבדיקה ולהימנע מכל השפעה אקוטית של הכנסת חללית.
  9. איסוף דגימות. ודא ששיתוףrrelation בין דיאליזת מדגם (ממוח) ואוסף (לצינור) מחושב באופן מדויק. לדוגמה, באמצעות שני מטרים של צינור FEP בין מסתובב ובדיקה, יש נפח מוחלט בין החללית לבין האוסף של 30 μl ולכן זה לוקח 20 דקות ב -1.5 μl / קצב זרימת דקות למדגם לעבור את הבדיקה, צינורות, מחברים ומסובב להגיע לסוף של צינורות לאוסף. כאשר דגימות איסוף לוודא שאתה לאסוף מספיק נפח ליש ריכוז דרוש עבור המבחנים שלך. כאן, תוכל להשתמש 5 פחי מדגם דקות, וכך לגבות 7.5 μl של dialysate בכל צינור איסוף.
  10. דוגמאות בסיסיות. ברגע שהאיזון הוא מוחלט, מתחיל איסוף דגימה. לאסוף לפחות שלוש דגימות תוך החולדה נמצאת במנוחה בחדר הבית להקים בסיס יציב של מדידות
  11. עיתוי טיפול. תשמור על עצמך כדי לחשב עיתוי הנדרש לתחילת טיפול לפני הניסוי: לזכור כי כשם שיש פער זמן בין טיפולי דיאליזהואיסוף דגימה, יש פיגור (בדרך כלל זהה) בין perfusate עוזב את המזרק ולהגיע ליפוקמפוס של החיה. לפיכך, בהגדרה שלנו עם נפח μl 30 בין מזרק ובדיקה, לשנות את המזרק של20 דקות המכילות טיפול perfusate לפני שאתה רוצה להתחיל להגיע לטיפול ביפוקמפוס.
  12. שינוי מזרקים. מתג נוזל יכול לשמש אם רצוי אך לא הכרחי: בזמן המתאים, פשוט ניתק את קו הזרימה ממזרק הבקרה perfusate ומהירות להתחבר למזרק הטיפול perfusate. זה אמור לקחת לא יותר מ 5 שניות, כדי למנוע הפרעה משמעותית לזרימת perfusate. הערה שתהליך זה צריך להיות הפוך אחרי המינון הרצוי נמסר, אם משלוח מוגבל בזמן של טיפול הוא רצוי. לחלופין, טיפול יכול להמשיך לתקופת דגימה (ראה איור 2). בועות אוויר לא צריכות להיות הציגה לתוך הקו במהלך של מיתוגמזרקים, כפי שהם עשויים להצטבר על קרום הדיאליזה ומפחיתים את היעילות של בדיקה.
  13. בדיקה התנהגותית. אם ביצוע משימה התנהגותית, בצע את ההליך ש( סעיף 4 להלן). הערה שתיאום עם מסירה של טיפול להיפוקמפוס הוא חשוב. למשל, משלוח של אינסולין צריך להיות מתוזמן להתרחש 10 דקות לפני המבחן מתחיל 10. לפיכך, המעבר לperfusate אינסולין המכיל אמורה להתרחש 30 דקות טרם בדיקה התנהגותית (20 דקות לperfusate לעבור את הקווים בתוספת 10 דקות זמן משלוח רצוי לפני הבדיקה).
  14. השלים איסוף דגימה. לאחר איסוף הדגימות הרצויות, להסיר בעדינות את החללית מראשו של בעל החיים, שוב לזכור לקחת בחשבון פער זמן בין טיפולי דיאליזה ואיסוף דגימה. להחזיר את בעל החיים לכלוב בבית שלה ולהתבונן מקרוב על כל שינוי שלאחר ניסיוני בבריאות או בהתנהגות עד שהחיה לא נהרגה והמוח הוסר כדי לאשר נכוןמיקום חללי. אם קורבן לא יתרחש באופן מיידי, לחזור stylet הדמה לצינורית כדי למנוע כל הקדמה של חומר זר.
  15. ניתוח. המתודולוגיה האנליטית תשתנה בהתאם אנליטי (הים) של עניין. בגלל דגימת דיאליזה אינה מאפשרת איזון אנליטי מלא בקרום החללית, ריכוזי מדגם צריכים להיות מתוקנים כדי לתת ריכוזי ECF בשיטת אפס נטו שטף 11,12.

4. בדיקה התנהגותית

  1. מיקום במבוך. לאחר דגימות בסיסיות (כלומר, אחרי לפחות שלוש דגימות השלימו דיאליזה, אבל עדיין עשויה להיות בצינורות הניקוז שנאספו), בעדינות להזיז את העכבר למנגנון הבדיקה התנהגותית. כל משימה המתאימה עשויה לשמש; את הנתונים בתרשים 1 נאספו באמצעות מבוך בצורת תוספת של ארבע זרועות ומדידת התחלפות ספונטנית, שהוא מדד של זכרון עבודה המרחבי: העכברוש בתחילה הוצב בCENטר של המבוך ואפשר לחקור באופן חופשי 9,13. כי ניתן להשתמש בו בכל מבחן התנהגותי, המוקד של פרוטוקול זה הוא לא על משימה המסוימת משמשת כדוגמה כאן (אשר מפורט במקום אחר 9,14,15) אבל בקצרה, להכניס בעלי חיים כדי לחקור את המבוך (התקופה של התיבה האפורה באיור 1) ולהשתמש בתהליכי hippocampally תלויים לשמור על זכרו של אשר זרועות לאחרונה בקר.
  2. תנועת צינורות דיאליזה במהלך בדיקה. החזק את הצינור כך שהוא נע בחופשיות, לא מפריע לתנועה של החולדה ולא להיות מורשה לנוע בחזיתו של בעל החיים ולהסיח את דעתו. הישאר במקום ולמזער את התנועה שלך, כך שאתה לא משפיע על התנהגותו של העכברוש.
  3. אוסף מדגם המשך. כמו בתחילת מחקר, להעביר את צינור הניקוז לצינור אוסף חדש כל 5 דקות.
  4. בדיקות לסירוגין. לאפשר החיה כדי לחקור את המבוך למשך 20 דקות באופן חופשי. רשום את הרצף והתזמון של ערכי זרוע או באמצעותהקלטת וידאו או ביד לניתוח ביצועי משימה מאוחר 9,15.

5. לאחר הבדיקה

  1. אוסף מדגם סופי. בעקבות בדיקה, להסיר בעדינות ממבוך עכברים ולחזור לשלוט בקאמרי. המשך איסוף דגימת microdialysis לפחות ארבע דגימות כדי לכסות את תקופת החלמה מביצוע משימה.
  2. הסרת בדיקה. לאחר שכל הדגימות שנאספו, בעדינות להסיר את החללית מהראש ואת מקומו של בעל החיים לתוך בקבוקון אחסון; להחזיר את בעל חיים לכלוב בבית שלה.
  3. אחסון חללית. לאחר חזרתו לחיים בכלוב הביתה והשלים אוסף של כל dialysate נותר, לשטוף ביסודיות עם חללית DH 2 0 וחנות בבקבוקון נצנץ מלאי DH 2 0 ומכוסים בparafilm. שטוף את הצינור על ידי מעבר למזרק המכיל תמיסה של 1:10,000 Kathon בDH 2 0 כדי למנוע צמיחת חיידקים. בדיקות יכולות להיות שימוש חוזר, כל עוד הם שומרים על זרימה טובה ויש לילא נגרם ניזק לממברנה; עם טיפול זה צריך להיות באופן שגרתי בעודף של 10 שימושים.
  4. היסטולוגיה. להרוג את בעל החיים ולהסיר את המוח. פורס על cryostat ולהשתמש בטכניקות היסטולוגית סטנדרטיות (מכתים סגול cresyl למשל) כדי לאשר את מיקום בדיקה נכונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חולדות צריכות להתאושש במהירות מניתוח ולהיות ערני, ניע ופעיל בתוך ההפסקה הבאה 30 דקות של הרדמה. ההשפעה של כובע הצינורית צריכה להיות מינימאלית אם הניתוח מבוצע באופן נקי ומלט שיניים מינימאלי משמש. אם כל סימן לזיהום הוא הבחין במהלך המעקב שלאחר הניתוח, או העכברוש הוא בכל דרך שמראות סימנים של מצוקה ואי נחת, מייד להפסיק את הניסוי, זה צריך להיות מאוד נדיר. במהלך הטיפול טרם בדיקה, בעלי חיים צריכים להיות ערניים, חופשיות ניע, ידידותיים וסקרנים. חיות שטופלו היטב, צריכות למעשה אין מתח נצפה נותר מניתוח, החלמה לאחר הניתוח, או נוכחותו של הנסיין, זה יכול להיות מאושר אם רצוי על ידי מדידה של הורמוני לחץ פלזמה (אפינפרין, סטרואידים) ו / או גלוקוז 2,4 , 5.

גלוקוז ECF המוח הוא בדרך כלל בטווח 0.5-1.5 מ"מ, משתנה מאזור לאזור במוח, למרות שערכים גבוהים יותרניתן לראות בבעלי חיים חולים סוכרת, ביפוקמפוס, ריכוזי הגלוקוז בסיסי הם בסדר גודל הקרוב של 1.25 מ"מ 6,12. בהעדר כל טיפול אקסוגני, לטבול בסוכר ECF (ו, בדרך כלל, עלייה בחומצת חלב ECF) יש לראות, במהלך ביצוע משימה, באזורים במוח המעורב בתיווך המשימה ש( ראה איור 1 לדוגמה): זה משקף הפעילות מטבולית המוגברת הנגרמת על ידי עומס קוגניטיבי 9,14,16. שינויים דומים עלולים להתפרש כעדות לכך שטיפול מסוים מגביר את חילוף חומרים מקומי, כפי שניתן לראות למשל לאחר מתן אקוטי של אינסולין דרך בנוסף ל7 perfusate (איור 2).

באופן כללי, חיה בעלת ידית גם צריכה לבצע בדיקה התנהגותית ללא כל סימן של מצוקה וללא כל סימן של מודעות של צנרת microdialysis: סימנים של טיפוח מוגזם, חוסר תנועה, כל אינדיקציה לכאב או לניסיונות של בעלי החיים כדי להסיר את החללית מצביעהטיפול סביר מספיק ו / או זיהום סביב אתר החללית, ויש לנקוט כאינדיקציה לסיום ניסוי זה.

בעלי חיים שקבלו ממשל אינסולין, בנוסף לחילוף חומרים מוגברים ביפוקמפוס, מראים זיכרון המרחבי ניכר משופר 7. בקרה, חיות שלא טופלו צריכות ביצועי התחלפות ממוצעים במבוך 4-הזרוע של בין 65 ו 75% 7,9,14.

איור 1
האיור 1. משימות קשורות לטבול בסוכר ECF היפוקמפוס (מעובד מ9). תיבת גריי היא התקופה של בדיקות מבוך בהתחלפות ספונטנית (SA). קו סגול מראה גלוקוז ביפוקמפוס בבעלי חיים ללא בדיקות מבוך (אך שטופלו בדרך אחרת באופן זהה). קו האדום הוא מדידות בבעלי חיים שמבצעים את 4-זרוע SA המשימה; קו כתום מראה מדידות בבעלי חי ביצוע קל יותר3-זרוע גרסה של SA.

איור 2
איור 2. שינויים ברמת סוכר וחומצת חלב ביפוקמפוס לאחר מתן האינסולין דרך ההכללה בperfusate (מותאם מ 7). אינסולין מגיע ליפוקמפוס בנקודה שצוינה על ידי חץ והוא מנוהל ברציפות לאחר מכן. בעלי חיים נבדקו בכלובים הביתיים שלהם, ללא מניפולציות התנהגותיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כל פתרונות המשמשים בmicrodialysis יש לסנן מייד לפני שימוש, באמצעות מיקרומטר .2 מסנן. לאחר ההחדרה של החללית למדריך הצינורית, להתבונן כדי לאשר שזרימה בלתי מופרעת ואיסוף דגימה מתרחש. אם זרימה מפסיקה אחרי החדרה, הסיבה הסבירה ביותר היא פגיעה בקרום החללית הנגרם על ידי טיפול מספיק על הכנסה, וחללית טריה חייבת להיות תחליף.

כפי שצוין לעיל, יתרון מרכזי לשיטות אלה הוא חוסר הבלבול, ומאפשר גם אמצעים התנהגותיים ועצביים בבעלי חיים, ערים שנעו בחופשיות: כדי לנצל את זה, טיפול מקיף טרם בדיקה, הוא חיוני כדי שהחיים יהיו בלתי מוטעמים במהלך מדידות. תקופת האיזון היא בדרך כלל מספיק כדי לספק בסיס יציב מטבולית, אך ניתן להסיר מזון ל1-2 שעות טרם בדיקה, אם ירצה בכך כדי להבטיח את רמות הגלוקוז בדם אחיד על פני בעלי חיים.

ההדואר שתי מגבלות משמעותיות ביותר של MD כטכניקת דגימה הוא (i) גודל מוגבל של חומר האנליטי וכן (ii) פוטנציאל לאובדן אנליטי עקב הידבקות בצינורות. לשעבר ניתן להקל במידה מסוימת על ידי השימוש בבדיקות MD עם סף משקל מולקולרי גדול יותר. בדיקות מסחריות טיפוסיות לאפשר הפסקות של עד 100 KD, כך שהמולקולות של עד 50 KD אולי תעבורנה ללא הפרעה יחסית, עם זאת, שימוש בממברנות חתך נמוכות יותר מומלץ במידת ההאפשר כדי למזער את אובדן מדגם באמצעות ultrafiltration בבדיקת הקצה. הידבקות של מולקולות המטרה לצינורות היא בעיה בעיקר במקרים של מדידות פפטיד, שרבים מהם נוטים לדבוק FEP צינורות ובכך להקטין הן התאוששות אנליטי ודיוק מדידה. בעיה זו ניתן למזער על ידי (ט) טיפול מראש הפנימי של הצינורות באמצעות perfusate ש2% שור סרום אלבומין נוסף, מתנהג כמו סוכן חסימה, וכן (ii) על ידי צמצום אורך צינור התמורה: אם נהeded, בקבוקון אוסף קל יכול להיות מחובר בסמוך ליציאה של הבדיקה, אם כי זה מציב אתגרים נוספים במיתוג צינורות איסוף מבלי להפריע לבעלי החיים, במיוחד בבדיקה התנהגותית. אחד יתרונות של השיטה הוא שהדגימות מתקבלות בצורה חופשיה של פסולת סלולרית או מולקולות גדולות כגון אנזימים, ומתאימים לניתוח באמצעות הזרקה ישיר בדרך כלל לHPLC, טרשת נפוצה או מכונות אנליטית אחרות כפי שהיא, ללא צורך בטיהור נוספת , זה גם מאפשר במקרים רבים הניתוח של analytes המרובה בכל מדגם (כגון גלוקוז ומדידות קטט שמוצג באיור 2).

וריאציה על השימוש בmicrodialysis ההפוך כדי לספק טיפולים תרופתיים היא להשתמש בחלליות microinjection-microdialysis כפולות, זמינות ממספר מקורות. עם זאת, השעמום של נמל הזריקה הוא בדרך כלל צר מאוד ונוטה לחסימה, וזה יכול להיות קשה באופן מדויקלשלוט בעיתוי ו / או נפח משלוח טיפול. חלופה זו ולכן מומלצת רק לטיפולים שאינם ניתן למשלוח באמצעות הכללה בperfusate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDDK (DK077106 לECM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (6), 2881 (2000).
  2. McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56, (2), 66 (2001).
  3. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75, (3), 325 (2001).
  4. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  5. McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53, (2), 418 (2004).
  6. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  7. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75, (3), 325 (2001).
  8. McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55, (4), 1088 (2006).
  9. McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132, (1), 35 (2004).
  10. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  11. Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49, (3), 729 (1987).
  12. Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74, (3), 234 (1987).
  13. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (6), 2881 (2000).
  14. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93, (4), 546 (2010).
  15. Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
  16. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  17. Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26, (1), 91 (2002).
  18. Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5, (4), 358 (1986).
  19. McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87, (2), 298 (2006).
  20. McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18, (10), 3853 (1998).
  21. Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98, (4), 467 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics