冻结人类胚胎干细胞

Biology

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Summary

在这里,我们证明了我们的实验室如何冻结色调人类胚胎干细胞系。

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).

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Abstract

在这里,我们证明了我们的实验室如何冻结色调人类胚胎干细胞系。一个健康,成倍扩大培养,用PBS洗,以去除残留的媒体,否则可能淬火胰蛋白酶反应。回暖的0.05%胰蛋白酶EDTA,然后添加到覆盖细胞,板允许在室温下5分钟孵化。在这段时间内可以观察细胞四舍五入,和殖民地抬离板面。温和的反复吹打将删除从钢板表面的细胞和殖民地。放置在一个标准的锥形管,包含预热的胚胎干细胞媒体淬火剩下的胰蛋白酶,胰酶消化细胞,然后纺制。细胞悬浮在大约一百万个细胞的浓度生长介质,在一个媒体毫升,浓度等,一个冻结等分足够的复活一种文化上10厘米板。充分重悬细胞后,冰冷的冻结媒体是在同等体积增加。细胞悬浮液充分混合,分装成冷冻小瓶,允许慢慢冻结超过24小时- 80C。冷冻细胞可以长期贮存的液氮转移到气相,或约6个月保持在-80。

Protocol

  1. 一个健康,成倍扩大培养,用PBS洗,以去除残留的媒体,否则可能淬火胰蛋白酶反应。
  2. 回暖的0.05%胰蛋白酶EDTA,然后添加到覆盖细胞,板允许在室温下5分钟孵化。在这段时间内可以观察细胞四舍五入,和殖民地抬离板面。
  3. 温和的反复吹打将删除从钢板表面的细胞和殖民地。
  4. 放置在一个标准的锥形管,包含预热的胚胎干细胞媒体淬火剩下的胰蛋白酶,胰酶消化细胞,然后纺制。
  5. 细胞悬浮在大约一百万个细胞的浓度在媒体中的生长介质。
  6. 充分重悬细胞后,冰冷的冻结媒体在相同体积的增加。
  7. 细胞悬浮液充分混合,分装成冷冻小瓶,允许慢慢冻结超过24小时- 80C。
  8. 冷冻细胞可以长期贮存的液氮转移到气相,或约6个月保持在-80。

注:在106细胞/ ml的浓度冷冻等分足够的复活一种文化上10厘米板。

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Discussion

冻结色调细胞株中描述的技术,我们有效地存储和复活的色调细胞株和利益的任何哺乳动物细胞。工作时,与胚胎干细胞系,染色体核型异常,可能会出现不正常的细胞可以迅速接管该行,冷冻的细胞在每一个通道的一小部分是一个重要的考虑因素。因此,有冷冻分割在某些段落中除了大银行,在每一个通道是非常可取的。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HuES Medium medium For aq total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium medium 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.

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References

  1. Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. thank you!

    Reply
    Posted by: Gaurab C.
    June 23, 2009 - 2:49 PM
  2. Would you like to send me your protocol, how are you freezing the stem cells? We would like to try your protocol on rat mesenchymal stem cells in our laboratory.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 22, 2009 - 4:22 AM
  3. Which freezing medium is the best for freezing iPSCs? Thanks.

    Reply
    Posted by: Zongyou G.
    November 26, 2013 - 2:52 PM

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