Donma İnsan ES Hücreler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Burada bizim laboratuvar tonlar insan embriyonik kök hücre hatları donuyor nasıl göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Burada bizim laboratuvar tonlar insan embriyonik kök hücre hatları donuyor nasıl göstermektedir. Sağlıklı, katlanarak genişleyen kültür, aksi takdirde tripsin tepki söndürmeye kalan ortamı çıkarmak için PBS ile yıkanır. Sıcaklaşır% 0.05 tripsin-EDTA sonra hücrelerin eklenir ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe izin plaka. Bu süre içinde hücreleri yuvarlama gözlenen ve koloniler plaka yüzeyinden kaldırırken olabilir. Nazik tekrarlanan pipetleme plaka yüzey hücreleri ve koloniler kaldıracaktır. Tripsinize hücreleri kalan tripsin gidermek için, önceden ısıtılmış embriyonik kök hücre medya içeren bir standart konik bir tüp yerleştirilir ve daha sonra spun. Hücreler medya, bir donmuş kısım 10cm plaka üzerinde bir kültürü yeniden canlandırmak için yeterli olduğu gibi bir konsantrasyon mL konsantrasyonda yaklaşık bir milyon hücre bir büyüme ortamı yeniden süspanse. Hücreleri yeterince yeniden süspanse sonra, buz gibi dondurma medya eşit miktarda eklenir. Hücre süspansiyonları iyice karıştırılır dondurma şişeleri içine aliquoted ve 24 saat içinde yavaş yavaş-80C dondurmak için izin. Donmuş hücreler daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen buhar fazında taşınır, ya da yaklaşık altı ay -80 kalır.

Protocol

  1. Sağlıklı, katlanarak genişleyen kültür, aksi takdirde tripsin tepki söndürmeye kalan ortamı çıkarmak için PBS ile yıkanır.
  2. Sıcaklaşır% 0.05 tripsin-EDTA sonra hücrelerin eklenir ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe izin plaka. Bu süre içinde hücreleri yuvarlama gözlenen ve koloniler plaka yüzeyinden kaldırırken olabilir.
  3. Nazik tekrarlanan pipetleme plaka yüzey hücreleri ve koloniler kaldıracaktır.
  4. Tripsinize hücreleri kalan tripsin gidermek için, önceden ısıtılmış embriyonik kök hücre medya içeren bir standart konik bir tüp yerleştirilir ve daha sonra spun.
  5. Hücreler medya mL konsantrasyonda yaklaşık bir milyon hücre bir büyüme ortamı yeniden süspanse.
  6. Hücreleri yeterince yeniden süspanse sonra, buz gibi Donma Medya eşit miktarda eklenir.
  7. Hücre süspansiyonları iyice karıştırılır dondurma şişeleri içine aliquoted ve 24 saat içinde yavaş yavaş-80C dondurmak için izin.
  8. Donmuş hücreler daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen buhar fazında taşınır, ya da yaklaşık altı ay -80 kalır.

Not: 106 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon gibi donmuş bir kısım 10cm plaka üzerinde bir kültürü yeniden canlandırmak için yeterli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dondurma tonlar hücre hatları için tarif tekniği tonlar hücre hatları ve ayrıca herhangi bir ilgi memeli hücre etkin bir şekilde depolanması ve diriltmek için iyi çalışır. Karyotip anormallikler ortaya çıkabilir ve anormal hücreler hızlı bir hat üzerinden alabilir, embriyonik kök hücre hatları ile çalışırken küçük bir oranda her bir geçit hücrelerinin dondurulması önemli bir husustur. Bu nedenle, dondurulmuş belli pasajlar büyük bankaların yanı sıra her geçit böler son derece arzu edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HuES Medium medium For aq total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium medium 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. thank you!

    Reply
    Posted by: Gaurab C.
    June 23, 2009 - 2:49 PM
  2. Would you like to send me your protocol, how are you freezing the stem cells? We would like to try your protocol on rat mesenchymal stem cells in our laboratory.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 22, 2009 - 4:22 AM
  3. Which freezing medium is the best for freezing iPSCs? Thanks.

    Reply
    Posted by: Zongyou G.
    November 26, 2013 - 2:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics