Frysning Mänskliga ES-celler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här kan vi visa hur vårt labb fryser nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Här kan vi visa hur vårt labb fryser nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer. En frisk, exponentiellt växande kultur tvättas med PBS att avlägsna rester av media som annars skulle kunna släcka Trypsin reaktion. Uppvärmd 0,05% Trypsin-EDTA tillsätts sedan för att täcka celler, och plattan får inkubera i upp till 5 minuter i rumstemperatur. Under denna tid celler kan observeras avrundning, och kolonier lyfta av plattan. Gentle upprepad pipettering kommer att ta bort celler och kolonier från plåtytan. Trypsinized celler placeras i ett vanligt koniskt rör som innehåller förvärmda hES cell media för att släcka resterande trypsin och sedan spunnits. Celler är återsuspenderade tillväxt media vid en koncentration av cirka en miljon celler i en ml av media, en koncentration så att en frusen alikvot är tillräcklig för att återuppväcka en kultur på en 10cm tallrik. Efter att cellerna är tillräckligt återsuspenderade, är iskall frysning media läggas till samma volym. Cellsuspensioner blandas ordentligt, alikvoteras till frysning flaskor, och får långsamt frysa till-80C under 24 timmar. Frysta celler kan sedan flyttas till gasfasen av flytande kväve för långtidsförvaring, eller ligger kvar på -80 i ungefär sex månader.

Protocol

  1. En frisk, exponentiellt växande kultur tvättas med PBS att avlägsna rester av media som annars skulle kunna släcka Trypsin reaktion.
  2. Uppvärmd 0,05% Trypsin-EDTA tillsätts sedan för att täcka celler, och plattan får inkubera i upp till 5 minuter i rumstemperatur. Under denna tid celler kan observeras avrundning, och kolonier lyfta av plattan.
  3. Gentle upprepad pipettering kommer att ta bort celler och kolonier från plåtytan.
  4. Trypsinized celler placeras i ett vanligt koniskt rör som innehåller förvärmda hES cell media för att släcka resterande trypsin och sedan spunnits.
  5. Celler är återsuspenderade tillväxt media vid en koncentration av cirka en miljon celler i en ml av media.
  6. Efter att cellerna är tillräckligt återsuspenderade, är iskall Frysning Media läggas till samma volym.
  7. Cellsuspensioner blandas ordentligt, alikvoteras till frysning flaskor, och får långsamt frysa till-80C under 24 timmar.
  8. Frysta celler kan sedan flyttas till gasfasen av flytande kväve för långtidsförvaring, eller ligger kvar på -80 i ungefär sex månader.

Obs: en sådan frusen alikvot vid en koncentration av 106 celler / ml är tillräckligt för att återuppväcka en kultur på en 10cm tallrik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tekniken vi beskriver för frysning nyanser cellinjer fungerar bra för att effektivt lagra och återuppväcka nyanser cellinjer och även eventuella däggdjursceller av intresse. Frysning en liten andel av celler vid varje passage är en viktig faktor när man arbetar med HES cellinjer som karyotyp avvikelser kan uppstå och onormala celler kan snabbt ta över linjen. Således är att ha fryst spricker vid varje passage förutom stora bankerna på vissa ställen mycket önskvärt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HuES Medium medium For aq total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium medium 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. thank you!

    Reply
    Posted by: Gaurab C.
    June 23, 2009 - 2:49 PM
  2. Would you like to send me your protocol, how are you freezing the stem cells? We would like to try your protocol on rat mesenchymal stem cells in our laboratory.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 22, 2009 - 4:22 AM
  3. Which freezing medium is the best for freezing iPSCs? Thanks.

    Reply
    Posted by: Zongyou G.
    November 26, 2013 - 2:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics