עיצוב ושימוש במערכי Chemostat Multiplexed

Published 2/23/2013
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

פתחנו ומאומתים מערך טביעת רגל הקטנה של chemostats מיניאטורי שנבנה מחלקים בקלות רבה זמינים עבור עלות נמוכה. תוצאות התפתחות פיסיולוגיות וניסוייות היו דומות לchemostats נפח הגדול יותר. מערך ministat מספק פלטפורמה קומפקטית, זולה ונגישה לניסויים מסורתיים chemostat, גנומיקה תפקודית, ויישומי הקרנה כימית.

Cite this Article

Copy Citation

Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262, doi:10.3791/50262 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Chemostats הם מערכות תרבות מתמשכות שבו תאים גדלים בסביבת פיקוח הדוקה, כימי קבועה שבו צפיפות התרבות היא מוגבלת על ידי הגבלת מרכיבי מזון מסוימים. 1,2 נתונים מchemostats הם לשעתק ביותר למדידת פנוטיפים כמותיים כמו שהם מספקים שיעור צמיחה מתמדת ואיכות הסביבה במצב יציב. מסיבות אלה, chemostats הפכו כלים שימושיים לאפיון בקנה מידה זעיר של פיזיולוגיה באמצעות ניתוח של ביטוי גנים 3-6 ומאפיינים אחרים של תרבויות באיזון המצב יציב. 7 ניסויים ארוכי הטווח בchemostats יכולים לסמן מסלולים ספציפיים שאוכלוסיות של חיידקים לאמץ במהלך האבולוציה אדפטיבית בסביבה מבוקרת. למעשה, chemostats שמשה במשך אבולוציה ניסיונית מאז המצאתם. 8 תוצאה נפוצה בניסויי אבולוציה היא עבור כל לשכפל ביולוגי לרכוש רפרטואר ייחודי של מוטציות. 9-13 גיוון זה מצביע על כך שלא נותר הרבה כדי שיתגלה על ידי ביצוע ניסויי אבולוציה עם תפוקה גדולה בהרבה.

אנו מציגים כאן העיצוב ותפעול של מערך פשוט יחסית, בעלות נמוך של chemostats או מיניאטוריים ministats-ולאמת את השימוש בם בנחישות לפיזיולוגיה ואבולוציה בניסויים עם שמרים. גישה זו כרוכה בגידול של עשרות chemostats לברוח אחת multiplexed משאבת peristaltic. התרבויות נשמרות בנפח 20 מיליליטר עבודה, שהוא מעשי עבור מגוון רחב של יישומים. תקוותנו היא כי הגדלת תפוקה, להקטין הוצאות, ומתן בניין מפורט והוראות הפעלה יכולה גם להניע את המחקר ויישום תעשייתי של העיצוב הזה כפלטפורמה כללית לאפיון מספר גדול של זנים, מינים ופרמטרי צמיחה פונקציונלית, כמו גם גנטי או ספריות סמים.

Introduction

הדינמיקה של צמיחה והתפתחות חיידקים הן יסוד למיקרוביולוגיה, אקולוגיה, גנטיקה, וביוטכנולוגיה. השיטה הנפוצה ביותר של חיידקי culturing היא ביצווה, שבו תאים מחוסנים בצפיפות נמוכה לתוך מרק מזין עשיר וגדלו לרוויה. למרות שברור לביצוע תוך שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי, תרבויות יצוו לחוות סביבה כימית משתנית ובמקביל משתנות פיזיולוגיה סלולרית. סביבת גידול הטרוגנית זה יכול לגרום לתופעות גדילה ולחץ משתי שיכול להסוות הבדלים פיסיולוגיים עדינים. אבולוציה ניסויית על ידי העברה יצווה סידורית יכולה לבחור לתערובות מורכבות של אוכלוסיות ספציפיות צמיחה-שלב, מסבכת את הניסיונות להתאמות לתנאים סלקטיבית ספציפיים. מדידה של פנוטיפים כמותיים יכולה להיות קשה בשל רעש מעיתוי מדויק לדוגמה וגיוון בתכונות כגון זמן השהיה. תרבויות רציפות לספק חלופהמשטר שבו תאי גידול יכול להיות מתורבת reproducibly בסביבה כימית הומוגנית בקצב צמיחה מוגדרת כדי להגיע למצב יציב פיסיולוגי. בגלל היתרונות הללו, מחקרים של אבולוציה ואפיון ניסיוני של מדינה סלולרית לעתים קרובות לנצל את הסביבה המבוקרת של תרבויות רציפות כמו chemostat 14.

הערכה של יתרונות אלה הביאה להתעוררות מחודשת בעניין בתרבויות chemostat 15. מאז ההיכרות שלהם בשנת 1950, 1,2 מערכות chemostat פותחו לתפקד במגוון של קשקשים הנעים בין ליטר לmicroliters ועבור מגוון רחב של יישומים. 16 -19 עיצובים אלו שונים, אשר נעו בין bioreactors מיוצר באופן מסחרי לכלי glassblown לפלטפורמות מותאמות אישית מיקרופלואידיקה, עקרונות עיצוב כלליים מניות. קאמרי תרבות עורר ואוורר (בדרך כלל על ידי מבעבע האוויר דרכו) ואת החיידקים הכלולים בו נשמרים הומוגניתly התפזר בכל רחבי חדר התרבות בכל העת. מדיום חדש של הרכב מוגדר הוסיף רף והשיעור בנוסף שולט ומשפיע על קצב צמיחה לסביבה הכימית שחוותה את התרבות. הצפה מגדירה את נפח התרבות בצינור הצמיחה, ובאמצעות גלישה זה התרבות תהיה תדגם באותו הקצב שבו מדיום טרי נכנס. בדרך זו תרבויות להגיע למצב יציב פיסיולוגי שבו פרמטרים רבים ביולוגיים יישארו קבועים במהירות. למרות היתרונות של chemostats ודיווחים של פלטפורמות השונות אלה בספרות, אימוץ נרחב היה מוגבל על ידי קשיים בבנייה והפעלה של מערכות אלו, ועלויות גבוהות הקשורות עם אפשרויות מסחריות. יתר על כן תיאורים של איך לעשות ולהשתמש במכשירים אלה יכולים להיות אטומים.

אנו מציגים עיצובים והנחיות לשימוש במערך טביעת רגל הקטנה של chemostats מיניאטורי שנבנה מחלקים הזמינים בקלות רבה בעלות נמוכה. אנו בדיקות מסerve פרמטרים ניסיוניים עקביים מאוד ותוצאות לשעתק כאשר משווים המכשיר שלנו לנתונים שדווחו לשמרים בתרבית בbioreactors המסחרי בנפח הגדול יותר. זה כולל שחזור של פיזיולוגיה תאית כמו לראות דרך להגיע לאיזון מצב יציב בתוך 10-15 דורות וקבלת צפיפויות תרבות דומות בשיווי משקל. בנוסף, דפוסי ביטוי גנים הם עקביים בין ministats ופלטפורמה מסחרית בנפח גדול יותר. יציבות של שיעור דילול, צפיפות אופטית ושחזור של ביטוי גנים בין שלוש תרבויות לשכפל להפגין את החוסן של הפלטפורמה שלנו. אנו גם מראים כי מוטציות מסתגלות אותם עולות על לוחות זמני אבולוציה ניסיוניים דומים כמו עם chemostats נפח גדול יותר.

Protocol

השתמש בטכניקה סטרילית מתאימה לאורך הפרוטוקול.

1. הרכבת חלקים ולהכנת מערך Ministat

  1. להזמין את כל החלקים.
  2. לנקות צינורות זכוכית. סמן מבחנות בנפח מ"ל 20.
  3. הפוך מכלולי שעם עם אוויר, מדיה, ויציאות קולחות ולמקם אותם בחלק העליון של צינורות תרבות הזכוכית הנקיה.
  4. הכן את תאי Humidifying ולסדר את כל החלקים שאינם autoclaved
  5. הפוך אוויר, שפכים וצינורות מדיה באמצעות אורכי צינורות מספיקים וזיווגים תואמים.
  6. חבר כל סוג של צינור (אוויר, תקשורת, ושפכים) למכלולי השעם והמסננים לסכל ותקשורת מהירה להתחבר כדי להכין אותם לחיטוי.
  7. הכן בקבוק לשימוש בייצור בינוני chemostat סטרילי.
  8. הכן את בקבוקי דגימת התרבות על ידי החדרת פקק גומי שני חור עם אבזרים מתאימים. לסכל כל מסנן כדי להכין אותם לחיטוי.
  9. Fiלא הורכב מערך יפה לתוך מגשי חיטוי אחת או יותר וחיטוי כל החלקים.
  10. הפוך ולסנן תקשורת chemostat לcarboys autoclaved.

2. הגדרת ניסוי

  1. ממלא כל בקבוק שתייה של 700 המ"ל DDH 2 O.
  2. הנח את ministats autoclaved לקבוצת בלוק החימום בטמפרטורה הרצויה.
  3. הנח את חברות התעופה לסעפת 4-port ולהפעיל את משאבת האוויר.
  4. חבור את קווי השפכים ל100 בקבוקי איסוף המ"ל.
  5. מוריד את נייר הכסף מקצה צינור התקשורת וקרונית תקשורת ולחבר את שתי תנועות המהירות מתחבר. השחל כל אורכו של צינור משאבה דרך מחסנית משאבת peristaltic ולחץ עליהם למקומם. הפעל את משאבת התקשורת.
  6. בואו למלא את התאים. כבה את משאבת התקשורת.
  7. לרסס את מכלולי שעם עם אתנול 70% ולחסן את התרבויות באמצעות מזרק. שמור מדגם של הבידוד כמניית גליצרול קפואאם ארצה בכך. בואו תרבויות לגדול במשך 30 שעות.
  8. התאם את גובה מחט השפכים עד נפח התרבות מוגדר 20 מ"ל עם זרימת האוויר כבויה. זה עלול לקחת מספר התאמות במשך שעה. כשסיימתי לכבות את זרימת האוויר על גב.
  9. הפעל את המשאבה בתקשורת.
  10. רוקן את בקבוקי דגימת שפכים, המכילים תקשורת נאספה תוך קביעת נפח תרבות העבודה, ולהקליט את הזמן.
  11. לקחת מקום מדידת הזמן אפס קווי השפכים לצינורות איסוף סטריליים לשעות 15 דקות-2 (תלוי מה נפח אתה רוצה לטעום ניתוח ה-DNA). כמו כן שפרתי את המנייה קפוא גליצרול לכל תרבות בשלב זה אם רוצה.

3. מדידות יומיות

  1. כמו במדידה שלך בזמן אפס, לדוגמא על קרח במשך 15 דקות-2 שעה (כפי שנדרש לניסוי שלך) על קרח ולהקליט את זמן דגימה של דנ"א ודגימות מניות קפואות.
  2. לדגימות RNA או לאסוף כרך קטןUme שימוש במזרק ומחט 22g 5 "מהתרבות או פקק כל ministat לקצור כל התרבות. דוגמאות חייבות להילקח במהירות, שנאסף על ידי סינון, והוקפאו מייד בחנקן נוזלי.
  3. מדוד את השפכים שנאספו מאז הדגימה האחרונה לכל ministat לכמת שיעור דילול. התאם שיעורי דילול אם יש צורך בהתאמה מחדש את הגדרת המשאבה או כוונון עדין לכוון על קווי משאבה בודדות.
  4. החלף קווי שפכים בבקבוקים ריקים לאיסוף.
  5. לכמת תאים / מ"ל ​​וכן נקודתי קצה אחרות של עניין ולהפוך את מנייה קפוא גליצרול.

4. ניקוי שלאחר הניסוי

  1. מניח את כל הצינורות במגשים נפרדים ולשטוף מוגזמים עם DDH 2 O. צינורות יבשים באמצעות משאבת אקווריום.
  2. נקה את מכלולי שעם עם DDH 2 O ולהשתמש להכניס מחט לנקות את המחטים, aspirating וחלק מים בתורו. נגב את החלק החיצוני של המחטים והשעם להסיר כלתקשורת שיורית.
  3. נקה את צינורות זכוכית עם מים ואתנול, ולהסיר מזהמים פיסיים עם 3 כידר Kimwipes ומלקחיים.
  4. יש לשטוף ולייבש את כל החלקים שוב לפני השימוש.

Representative Results

מערך ministat שתואר לעיל וב( איור 1 א ', ב') שמש לתרבות זן הפלואידים מאטת מעבדה של שמרי ניצנים (S288c) תחת סולפט מגביל את התנאים כפי שתואר לעיל. 10 בדקנו יעילות עבור יישומי chemostat נפוצים בכלל זה קביעת הפיסיולוגיה ו אבולוציה ניסיונית. כדי לאמת את ministats, אנו חוזרים על עצם מספר ניסויים שבוצעו בעבר בfermentors התעשייתי שונים לשימוש chemostat. 10,20,21 fermentors ATR Sixfors היה לרוץ בנפח 300 מ"ל בעבודה, על פי עשרה מההיקף ministats, ויש מצבים שונים במידה ניכרת אוורור של התרבות והסתה. אנחנו ניסינו לשחזר יציבות ציוד, פיזיולוגית מצב יציבה, אבולוצית תוצאות ניסיוניות, ודפוסי ביטוי גנים שהושגו עם fermentors אלה.

מאז אחידות שיעור דילול והאוורור הן היבטים חשובים של עיצוב chemostat, אנוasured שיעור הדילול בפועל על פני 32 ministats לאחר 15 דורות של צמיחה ומצא כי בשיעור דילול היעד של 0.17 כרך / שעה (4-5 טיפין / דקה) השגנו שיעור דילול ממוצע של 0.17208 עם סטיית תקן של 0.0075 מול 32 משכפל. טווח זה היה בתוכנו הסובלנות האופיינית של + הבדל / -0.01 כרך / שעה מהגדרת המטרה, שמעבר לו שינויים גדולים בביטוי גנים שנצפו. 22-23 מעבר 4 ministats קצב זרימת האוויר נקבע להיות 307.5 מ"ל / דקות עם סטיית תקן של 9.57 מ"ל / דקה. הדבר מצביע על כך זרימת האוויר לתוך התאים היא איתנה וחצויה בין 4 התאים ושווי דומה לזה שתואר לאוורור בfermentors התעשייתי. 20

נצפינו קודם הגברה חוזרת של SUL1 טרנספורטר גופרית היון גבוהה זיקה ב8 / 8 ניסויי אבולוציה סולפט-מוגבלים בשמרים. בהינתן 10 עקביות של תוצאות תחת thiמצב שלנו בחר סולפט-הגבלה כדי לבחון את יכולתה של המערכת שלנו. אלמנט נחוץ של תרבות chemostat הוא הצורך לשמור על סביבה כימית קבועה. תנודות בשפע של שינויים תזונתיים או אחרים מגבילים בסביבה בדרך כלל לגרום לשינוי במספר התאים בתרבות נתונה. אנחנו מדדנו את צפיפות אופטית כתחליף למספר תא (איור 2 א) ו שחזור מדוד על פני 16 תרבויות לשכפל, מציאת A600 ממוצע של 1.12 (~ 10 9 תאים) לאחר ~ 15 דורות של צמיחה עם סטיית תקן של 0.057 יחידות, או 5.1 %. לשם השוואה, מדידות שנלקחו מגיל 4 תרבויות לשכפל גדלו בfermentors התעשייתי הראו סטיית תקן של 2.5%. התאים היו מעורבים היטב בחדר הצמיחה: מדידות של OD וספירת תאים שנלקחה ממסלול השפכים היו שווות ערך לדגימות שנלקחו ישירות משפופרת התרבות (מידע לא מוצג). תוצאות אלו מראות את החוסן של הפלטפורמה שלנויכולת ד לשמור על סביבה כימית קבועה בתוך סובלנות דומה כמו fermentor התעשייתי.

כreadout רגיש יותר לפיזיולוגיה, השוו ביטוי הגנום מצב יציב גן מהתרבויות גדלו תחת מגבלת סולפט בministats ובfermentor התעשייתי. ביטוי גנים בministats הראה מידה רבה של דמיון על פני 3 ביולוגיים משכפל (2B איור). ציינו בעבר כי לרנ"א נגזר משני chemostats Sixfors לשכפל ושיתוף הכלאה לmicroarray, ביטוי של 99% מגנים נפל בטווח 1.5-לקפל, המאפשר שימוש של 1.5x כניתוק משמעות אמפירית. ביטוי 21 גנים מ 3 ministats לשכפל, pairwise השוואה, הראה 99% מגנים נפלו בטווח 1.5-1.7 קיפול, בדומה לתוצאות מfermentors התעשייתי. השלוש דגימות הכלאת מערכים בודדים ואת שיעורי pairwise המחושב אחר כך, אז אלה vaלוקים היו כוללים רעש מערך בין בנוסף לרעש ביולוגי, פוטנציאל הערכת יתר הווריאציה בין משכפל בהשוואה לתוצאות שפורסמה, שיתוף ההכלאה. 138 גנים התבטאו באופן דיפרנציאלי> 1.5-לקפל בכל השלוש ministat משכפל לעומת דגימה שנאספה מתרבות תאמה גדלה בfermentor התעשייתי. גני הירידה בביטוי בministats היו מועשרים בכבדות לחילוף חומרי ברזל. חתימה זו עשויה לשקף את הרכב המתכת השונה של כל תצורת מכשיר: מכשיר Sixfors כולל מאיץ מתכת והרכבת אוורור השקוע בתרבות, וcarboys התקשורת השתמשה בעבר נדרש גם חומרת מתכת. Ministat מנצל מחטי נירוסטה, אך ללא רכיבי מתכת אחרות. גנים עם ביטוי מוגבר היו קשורים במידה רבה עם קרום תא, למרות שהמשמעות הביולוגית של קשר זה אינו ברורה.

לבסוף, בדק unde אבולוציה הניסיוניתr תנאים אלה. לאחר 250 דורות של צמיחת סולפט מוגבל, 4/4 משיבוטים נבדקו 4 אוכלוסיות מתפתחות עצמאיות הראו הגברה של SUL1 זוהה על ידי הכלאת הגנום השוואתית מערך (CGH, האיור 2C). תוצאה זו עולה בקנה אחד עם ממצאים בchemostats הנפח הגדול יותר על מרווחי זמן דומים. 10

איור 1
איור 1. עיצוב א 'והסדר של מערך ministat. עיצוב ב' של חדר התרבות.

איור 2
איור 2. א Experimeנתונים מראים כי תרבויות ntal להגיע שיווי משקל בתוך עשרה דורות של גידול (n = 16). נתוני ביטוי B. ל3 ביולוגיים משכפלים S1-3 נדגמו במהלך המצב יציב תחת מגבלת סולפט בהשוואה להתייחסות משותפת גדלה בchemostat Sixfors סולפט מוגבל תאם ג. Amplifications SUL1 התאושש בministats לאחר 250 דורות של צמיחה בסביבה סולפט מוגבלת. הדנ"א הגנומי מכל שיבוט התפתח היה בהשוואה ל-DNA על ידי אבות CGH כמתואר. Mean 21 מספר העותק חושב עבור כל אזור מוגבר ומוצג ליד כל amplicon כל נתוני microarray מופקדים במסד נתוני GEO תחת הצטרפות GSE36691. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

טיפוח Chemostat בministats, כמו בכל chemostat, דורש תשומת לב לפרטים ובעיות ירי. מאז הזיהום הוא המקור לדאגה רבה בניסויי התרבות רציפים, אנחנו בדרך כלל מסתכלים דרך מיקרוסקופ לזיהום חיידקים ופטריות על חיסון וכל 50 דורות במהלך ניסויי אבולוציה לטווח הארוך. נכון להיום יש לנו לא נצפה זיהום על פני 96 ניסויי אבולוציה של יותר מ 300 דורות (מידע לא מוצג). לבדיקת זיהום צולב בין ministats והפוטנציאל לחיידקים להתנחל קאמרי התרבות בדרך של קו השפכים רצנו 16 ministats כאלה שכל ministat האחר היה מחוסן עם שמרים כאמורים לעיל והשאר לא מחוסן בכל תרבות. תרבויות נדגמו לתוך מכולת אשפה קהילתית, שהתרוקנה בכל יום אחר. לכן, אם זה היה אפשרי למזהמים להיכנס דרך קו השפכים שסבירים היה שנצפה בexperim זהאף אוזן גרון. במהלך שלושה שבועות ויותר מ 100 דורות של צמיחה בדפוס שחמט זה של תרבויות מחוסנות ולא מחוסנים, לא חגג את הצמיחה בצינורות שאינם מחוסנים-ministat תרבות, טוען כי זיהום שמרים או חיידקים אחרים מחוץ הוא שלא להתרחש בניסויים של מסגרות זמן דומים.

למרות ministats תוכננו לפעול בצורה דומה לchemostats המסחרי, האופי המודולרי של הסדר זה מאפשר לאופטימיזציה שיתאים לצרכימים ולתקציב של המשתמשים. משאבת peristaltic שימוש בפרוטוקול זה יכול להשיג ספיקות בין 0.0186 כרך / שעה ל -3.6 כרך / שעה (מידע לא מוצג). שליטה מוגברת של שיעורי דילול יכולה להתבצע עם משאבת מודלים חלופיים. שים לב שפעולה בשיעורי דילול נמוכים עשויה לדרוש החלפה של מחט מד גבוה יותר כדי להשיג את אותה התדירות של משלוח טיפה. גודל אוכלוסייה הוא שיקול חשוב לעיצוב נכון של ניסויי אבולוציה.התעריף הסטנדרטי הדילול וריכוז חומר מזין שמספקים כאן גודל אוכלוסייה גדול יחסית (~ 10 9 תאים) באותו סדר הגודל כמו לימודי אבולוציה שפורסם. גדולות או קטנות יותר אוכלוסיות 11 יכולות להישמר על ידי שינוי נפח העבודה או הגבלת ריכוז חומר מזין. אספקת מוטציה מוגברת גם יכולה להיות מושגת על ידי עבודה עם זנים בעלי שיעורי מוטציה גבוהות.

את ministats גם יכול להיות שיפור על העיצוב הנוכחי שלנו. לעיבוי למשל יכול לאסוף על קירות צינור התרבות ויכול להיות מופחת באופן משמעותי על ידי שימוש waterbath עמוק, חממה, או חדר טמפרטורה קבועה. למרות clumping וצמיחת קיר בתרבויות המוגבלות סולפט נראית נדיר יחסית, המופיעה ב5/48 ניסויי אבולוציה על 300 דורות (מידע לא מוצג), מגוון של חומרים פעילים שטח זמין שעשוי לסייע בהפחתה או לעכב תכונה זו. במקרה שclumping מפריע לתרבות הנאותהתסיסת ערבוב, מוגברת יכולה להיות מושגת על ידי צמצום מספר הדרכים כל משאבת אוויר מחולקת, או על ידי הוספת מנגנון ערבוב. בדיקות נוספות לריכוז מומס גז, pH, או פרמטרים אחרים יכולות להיות גם כלל, כמו בכמה דגמים אחרים 17.

למרות שינויים פוטנציאליים, תוך שימוש בministats כמתואר בפרוטוקול זה, אנו נצפינו פרמטרים ניסיוניים עקביים מאוד ותוצאות לשעתק כאשר משווים המכשיר שלנו לנתונים שדווח לchemostats המסחרי בנפח גדול יותר. זו כללה שחזור של פיזיולוגיה תאית כמו לראות דרך להגיע לאיזון מצב יציב בתוך 10-15 דורות (איור 2 א) וקבלת צפיפויות תרבות דומות בשיווי משקל. דפוסי ביטוי גנים היו עקביים לאורך 3 ביולוגיים משכפלים בministats ובין ministats ופלטפורמות מסחר בנפח גדול (איור 2 ב '), למעט בגנים של חילוף חומרים של ברזל. אלה expהבדלי ression נגרמים ככל הנראה על ידי שינויים בתכולת מתכות של שני המכשירים או השיפורים באיכות מרכיבי תקשורת. הנתונים שלנו מראים שministats יהיה שימושי עבור ניסויי פיזיולוגיה או תחרות בי סביבה עקבית נדרשת.

כדי לבדוק אם עיצוב ministat מספיק עבור יישומים ניסיוניים אבולוציה התפתחנו תרבויות תחת מגבלת סולפט במשך 250 דורות ושמשנו CGH לאפיין הגברה במוקד SUL1 -. היכר של אבולוציה לטווח הארוך בתנאים אלה בנפח הגדול יותר chemostats 10 אנחנו נצפינו הגברה של SUL1 בשיבוטים מ4 / 4 ניסויי אבולוציה עצמאיים בתקשורת סולפט-מוגבלת (האיור 2C). צילום בכללות נתונים אלה מראים כי ministats הם פלטפורמה יציבה שעשויה להיות שימושיים עבור מגוון רחב של יישומי chemostat מסורתיים. למרות שאנחנו הוכחנו את השימוש בם בשמרי ניצני culturing, את צריך ministatsגם בקנה אחד עם אורגניזמים אחרים ועיצובים דומים שלמעשה שמשו במשך חיידקי culturing ומיני שמרים אחרים. 16,17,25 יתר הנפח הקטן יותר התרבות וצורך ירידה בקורלציה לתקשורת עשויות להפוך ministats חלופה אטרקטיבית לניסויים הדורשים יקר או אקזוטי ריאגנטים כיכולים להיות המקרה במסכים כימיים או גנטיים.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgements

יצירת הווידאו נתמכת על ידי מענקים מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר (5P41RR011823-17) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (8 P41 GM103533-17) מהמכונים הלאומיים לבריאות. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק NSF 1120425. MJD הוא ריטה אלן קרן Scholar. AWM נתמך בחלקו על ידי NIH T32 HG00035. אנו מודים סאנשיין אנה לסיוע בשיפור פרוטוקולים. בנוסף, אנו מכירים בכך שרה DiRienzi, סיליה Payen, ואיים אדונים? כמשתמשים ראשונים של ministats.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3/32" x 7/32" silicone tubing VWR 63009-260 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/2" x 5/8" silicone tubing (extra large) VWR 63009-299 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/4" x 3/8" silicone tubing (medium) VWR 63009-279 Tubing: Order: (50' coil pack)
Orange green marprene pump tubing Watson-Marlow 978.0038.00+ Tubing: Order: 6x(pack of 6)
Female luer, 1/8" barb Cole Parmer HV-45500-04 Connectors: Order: 4x(pack of 25)
Male luer lock, 1/8" barb Cole Parmer HV-45503-04 Connectors: Order: 1x (pack of 25)
Reducing connector, PVDF, 1/4" to 1/8" Cole Parmer EW-30703-50 Connectors: Order: 1x (pack of 10)
Barbed Y connector, 1/8" ID Cole Parmer HV-30703-92 Connectors: Order: 3x(pack of 10)
Medium tubing clamps VWR 63022-405 Clamps: Order: 1x(pack of 12)
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) VWR 21730-001 Clamps: Order: 1x(pack of 10)
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. Fisher 05-112-39 Connectors: Order: 1x(pack of 25)
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene Fisher 05-112-37 Connectors: Order: 1x(pack of 5)
Silent Air Pumps Aquarium Guys.com 212422 Air Supply: Order: 4 pumps
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration Cole Parmer HV-02915-22 Air Supply: Order: 1x(box of 100)
1L Flask with sidearm Fisher 10-181F Air Supply: Order: 2x(Pack of 6)
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks Fisher K953715-0801 Air Supply: Order: 8 stoppers
4-Port manifold Cole Parmer EW-06464-85 Air Supply: Order: 8 manifolds
55 ml Screw cap culture tubes Corning Life Sciences 9825-25 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48)
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line Fisher 14-817-105 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Spinal tap needle VWR BD40836 Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10)
Regular hypodermic pink needle Fisher 14-817-104 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Foam Silicone stopper size "2", pink Cole Parmer EW-06298-06 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20)
8-Well tube Rack VWR 82024-452 Culture Chamber: Order: 4 racks
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe VWR 89001-530 Media: Order: 2 or more
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 Cole Parmer EW-06298-22 Media: Order: 2 or more
Carboy Venting Filter Fisher SLFG 050 10 Media: Order: 1x(pack of 10)
Electrical tape, green Amazon.com 10851-BA-10 Media: Order 1 roll.
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm VWR 29442-978 Media: Order: (1 case of 12)
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe VWR 89003-384 Media: (Optional)
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 Cole Parmer EW-06298-18 Media: (Optional)
205S/CA16, 16 Cartridge pump Watson-Marlow 020.3716.00A Media Pump: Order: 1
16-channel 205CA Extension pump head Watson-Marlow 023.1401.000 Media Pump: Order: 2 extension pump heads
Silicone aquarium sealer Fisher S18180B Media Pump: Order: 1
6-block dry bath VWR 12621-120 Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16.
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block VWR 12621-120 Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16.
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm Fisher R04SP02500 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm Fisher R04SP04700 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
47 mm, large filter apparatus Fisher XX10 047 30 Harvesting: Order: 1 (optional)
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus VWR 26316-692 Harvesting: Order: 1 (optional)
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen VWR 63380-052 Harvesting: Order: 1 (optional)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monod, J. Récherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  2. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 15, 715-716 (1950).
  3. Daran-Lapujade, P., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast. Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).
  4. ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).
  5. Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  6. Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation. 101, 3148-3153 (2004).
  7. Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).
  8. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  9. Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors. Mutation Res. 1, 113-120 (1964).
  10. Gresham, D., Dunham, M. J., et al. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
  11. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  12. Kvitek, D. J., Sherlock, G. Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape. PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).
  13. Helling, R. B., Adams, J. Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment. Genetics. 116, 349-358 (1987).
  14. Dunham, M. J. Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide. Methods Enzymol. 470, (2010).
  15. Hoskisson, P. A., Hobbs, G. Continuous culture - making a comeback. Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).
  16. Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).
  17. Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas. Biotechnol. and bioeng. (2012).
  18. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  19. Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  20. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures. Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).
  21. Torres, E. M., Amon, A., et al. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317, 916-924 (2007).
  22. Regenberg, B., Nielsen, J., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology. 7, R107 (2006).
  23. Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. Journal of Biology. 6, 4 (2007).
  24. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  25. Ferenci, T. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).

Comments

3 Comments

  1. Our more detailed lab manual for building and running the ministats is also posted on my lab website:
    http://dunham.gs.washington.edu/protocols.shtml
    We'd love to hear from anyone who builds a set, especially if you improve on our design!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    March 1, 2013 - 4:28 PM
  2. This is great! I was about to email you and ask about small chemostats (I used to run chemostat experiments for F Rosenzweig, so I know about those custom-blown glass babies!). I'll be building a set of these ministats to use in experiments with Chlamydomonas reinhardtii. Have you had any problems with the effluent needle clogging, or with back growth up the needle? Since the vessel is under slight positive pressure, I guess that I could clean the exterior of the needle every so often with EtOH -- this is going to be a very long long experiment!

    Heidi Kuehne, U Edinburgh

    Reply
    Posted by: Heidi K.
    August 26, 2013 - 9:43 AM
  3. Hi Heidi. I'm excited you're building a setup for Chlamydomonas! We have not had backflow problems, as long as the pump head is fastened down. You do need to clamp the media lines if you are loosening the pump heads. However, we have had growth in the needle on occasion (never on the exterior of the needle). One nice thing is that the setup is modular, so if it happens, you can just swab the cork with ethanol and swap in another piece of sterile tubing with a new needle. However, for yeast, line growth is highly correlated with the evolution of clumping/wall growth, so we do get recolonization at some frequency. We have not gotten effluent needle clogging, even with cultures that evolve large clumps, and we have never seen back-contamination via the effluent lines. The air flow seems to be sufficient to empty the line efficiently and keep it cleared. Let me know if you have any other questions, and I'd love to hear how it turns out. Good luck!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    August 26, 2013 - 4:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats