Multiplexed kemostat Diziler Tasarımı ve Kullanımı

Published 2/23/2013
3 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Biz geliştirdi ve düşük maliyet için hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizi doğrulanmış. Fizyolojik ve deneysel evrim sonuçları büyük hacimli chemostats benzerdi. Ministat dizi geleneksel kemostat deneyler, fonksiyonel genomik ve kimyasal tarama uygulamaları için, kompakt, ucuz ve erişilebilir bir platform sağlar.

Cite this Article

Copy Citation

Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262, doi:10.3791/50262 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Chemostats hücreler kültür yoğunluğu belirli besinlerin sınırlandırılması ile kısıtlı bir sıkı kontrol, kimyasal sabit ortamda yetiştirilen olduğu sürekli kültür sistemleri vardır. Chemostats gelen 1,2 Veri onlar sabit bir büyüme hızı sağlamak gibi nicel fenotiplerinin ölçümü için son derece tekrarlanabilir Kararlı durumda ve çevre. Chemostats Bu sebeplerden dolayı, chemostats gen ekspresyonu 3-6 ve kararlı durum denge kültürlerin diğer özelliklerinin analizi yoluyla fizyolojisi ince ölçekli karakterizasyonu için yararlı araçlar haline gelmiştir. 7 Uzun süreli deneylerde mikrobiyal populasyonların benimsemesini belirli yörüngeleri vurgulayabilirsiniz kontrollü bir ortamda uyumsal evrimi sırasında. Aslında, chemostats onların icadından beri deneysel evrim için kullanılmaktadır. 8 evrim deneyleri yaygın bir sonuç her biyolojik çoğaltmak için mutasyonlar eşsiz bir repertuar elde etmek. 9-13 Bu çeşitlilik çok çok daha büyük throughput ile evrim deneyleri gerçekleştirerek orada keşfedilmeyi kaldığını göstermektedir.

Biz burada minyatür chemostats-veya nispeten basit, düşük maliyetli dizi tasarımı ve işletimi sunmak ministats-ve fizyoloji belirlenmesinde ve maya ile evrim deneylerde kullanımlarına doğrulamak. Bu yaklaşım chemostats onlarca peristaltik pompa çoğaltılmış tek bir kaçıp büyümesini gerektirir. Kültürler çeşitli uygulamalar için kullanışlı olan bir 20 ml'lik bir çalışma hacmi, tutulur. Bu, üretilen artan giderleri azalmakta ve detaylı bina ve çalıştırma talimatlarını veren de işlevsel suşları, türler, ve büyüme parametrelerini çok sayıda karakterize yanı sıra genetik için genel bir platform olarak bu tasarım araştırma ve endüstriyel uygulama motive edebilir umut ediyoruz veya uyuşturucu kütüphaneler.

Introduction

Mikrobiyal büyüme ve evrim dinamiği mikrobiyoloji, ekoloji, genetik ve biyoteknoloji için gereklidir. Kültür mikropların en yaygın yöntem hücrelerin besin açısından zengin suyu içine düşük yoğunluklu inoküle ve doygunluğunu yetiştirilen toplu, içinde. Standart laboratuar ekipmanları kullanarak gerçekleştirmek için basit olsa da, toplu kültürleri dalgalı bir kimyasal ortamda yaşamaya ve buna hücresel fizyoloji değişiyor. Bu heterojen büyüme ortamı ince fizyolojik farklılıklar maskeleyebilir ikincil büyüme ve stres etkilere neden olabilir. Seri toplu transferi Deneysel evrim belirli seçici koşullarına uyarlamaları bağlanmaya çalışırsa, komplike, büyüme fazına özel alt popülasyonlarının kompleks karışımlar için seçebilirsiniz. Kantitatif fenotipleri ölçümü gibi gecikme süresi gibi özellikleri kesin örnek zamanlama ve varyasyon gelen gürültü nedeniyle zor olabilir. Sürekli kültürlerin bir alternatif sağlamakbüyüme rejimi nereye hücreleri tekrarlanabilir fizyolojik bir kararlı duruma ulaşmak için tanımlanmış bir büyüme oranı bir kimyasal homojen bir ortamda yetiştirilebilir. Bu avantajları nedeniyle, hücresel devlet deneysel evrim ve karakterizasyon çalışmaları genellikle kemostat gibi sürekli kültürlerin kontrollü bir ortamda kullanmaktadır. 14.

Bu avantajlardan Takdir kemostat kültürlerde ilgi bir canlanma yol açmıştır. 15 1950 yılındaki çıkışlarından bu yana, 1,2 kemostat sistemleri litreden mikrolitre değişen ölçeklerde çeşitli ve çeşitli uygulamalar için fonksiyon geliştirilmiştir. 16. Ticari olarak üretilen biyoreaktörler gelen özel mikroakışkanları platformlara glassblown gemilerin payı genel tasarım ilkeleri arasındadır -19 Bunlar çeşitli tasarımlar,. Bir kültür odası karıştırıldı havalanmış ve (genellikle hava yoluyla köpüren tarafından) ve burada yer alan mikroplar homojen tutulur edilirly her zaman kültür odası boyunca dağınık. Tanımlanan bileşimin sürekli olarak taze ortam ilave edildi ve ilave bir büyüme oranını kontrol eden ve kültür tarafından tecrübe kimyasal çevre etkiler. Bir taşma büyüme tüp içinde kültür hacim belirler ve bu taşma yoluyla kültür, taze ortam girdiği de aynı hızda numuneler alınacaktır. Bu şekilde kültürler hızla birçok biyolojik parametreler sabit kalır hangi bir fizyolojik kararlı bir duruma ulaşması. Chemostats ve literatürde bu çeşitli platformlarda raporlar avantajlara rağmen, yaygınlaşmasının bu sistemleri kurma ve işletme zorlukları ve ticari seçenekler getirdiği yüksek maliyetleri ile sınırlı kalmıştır. Ayrıca bu cihazlar yapmak ve nasıl kullanılacağını açıklamaları opak olabilir.

Biz tasarımları ve düşük maliyetle hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizinin kullanım talimatlarını sunuyoruz. Biz atılbüyük hacimli ticari biyoreaktörlerde kültüre maya için bildirilen verilere bizim cihaz karşılaştırırken oldukça tutarlı deneysel parametreleri ve tekrarlanabilir sonuçlar Erve. Bu 10-15 nesiller içinde kararlı durum dengeye ulaşması ve denge benzeri kültür yoğunlukları elde aracılığıyla görüldüğü gibi hücresel fizyoloji tekrarlanabilirliği içerir. Ayrıca, gen ekspresyonu ministats ve bir ticari daha büyük hacimli bir platform ile tutarlı. Üç tekerrürlü kültürleri arasında seyreltme oranı, optik yoğunluk ve gen ekspresyon tekrarlanabilirliği kararlılığı bizim platformu sağlamlığını göstermek. Biz de aynı adaptif mutasyonların büyük hacimli chemostats ile benzer deneysel evrim zaman ölçeğinde ortaya olduğunu göstermektedir.

Protocol

Protokol boyunca uygun steril tekniği kullanın.

1. Parçaları Montaj ve Ministat Array hazırlanması

  1. Tüm parçaları sipariş edin.
  2. Cam tüpler temizleyin. 20 ml hacimli tüpler işaretleyin.
  3. Mantar hava ile meclisleri, medya ve atık limanlar olun ve temizlenmiş cam kültürü tüplerinin üstünde koyun.
  4. Nemlendirme odaları hazırlayın ve tüm non-otoklavlanmış parçaları düzenlemek.
  5. Yeterli boru uzunlukları ve uyumlu kaplinler kullanarak hava, atık ve medya tüp olun.
  6. Mantar meclisleri ve folyo filtreleri ve medya otoklav için onları hazırlamak için hızlı bağlantı. Tüpün her türü (hava, ortam ve deşarj) bağlayın
  7. Steril kemostat orta yapımında kullanılmak üzere bir damacana hazırlayın.
  8. Uygun bağlantı parçaları ile iki delikli lastik tıpa takarak kültürü örnekleme şişeleri hazırlayın. Otoklav için onları hazırlamak için her filtreyi Folyo.
  9. Fit düzgünce bir veya daha fazla otoklav tepsilerine dizi montajı ve tüm parçaları otoklavlamayın.
  10. Yapmak ve otoklavlanmış bidonlarda içine kemostat medya filtre.

2. Deneme Oluşturma

  1. 700 ml GKD 2 O. ile her hidrasyon şişeyi doldurun
  2. Istenen sıcaklıkta ısıtma bloğu seti içine otoklavlanmış ministats yerleştirin.
  3. 4-port manifoldu içine havayolları yerleştirin ve hava pompasını açmak.
  4. 100 ml toplama şişe atık hatları bağlayın.
  5. Medya boru ve medya damacana sonundan folyoyu çıkartın ve iki hızlı bağlanır bağlayın. Bir peristaltik pompa kartuş aracılığıyla pompa hortumunu her uzunluğu geçirin ve yerine onlara tıklayın. Medya pompa açın.
  6. Haznelerine edelim. Medya pompa kapatın.
  7. % 70 etanol ile mantar derlemeler sprey ve bir şırınga kullanılarak kültürler inoküle. Donmuş bir gliserol stok olarak inokulum bir örnek katılımİstenirse. Kültürleri 30 saat için büyümek istiyorum.
  8. Hava akışının kapatılması ile kültür hacmi 20 ml'ye ayarlanır kadar atık iğne yüksekliğini ayarlar. Bu bir saat boyunca çeşitli ayarlamalar sürebilir. Ne zaman tekrar hava akışını açın tamamladı.
  9. Üzerine medya pompası çevirin.
  10. Ortam çalışma kültürü hacmi kurarken toplanan ve saati kaydedebilmek içeren atık örnekleme şişeleri, boşaltın.
  11. Bir zaman sıfır ölçümü yer almak 15 dakika-2 saat (DNA analizi için örnek istediğimiz hacmine bağlı olarak) için steril toplama tüpleri içine atık hatları. İsterseniz aynı anda her iki kültür için bir gliserol dondurulmuş stok yapmak.

3. Günlük Ölçümler

  1. Buz üzerinde 15 dakika-2 saat (gibi deney için gerekli) için buz üzerinde zaman sıfır ölçüm, numune ile DNA ve dondurulmuş stok numune için numune zamanı kaydetmek gibi.
  2. RNA örnekleri ya küçük vol toplamak içinkültür bir şırınga ve 22G 5 "iğne kullanılarak ume ya da tüm kültür hasat etmek için her bir ministat atmak. Numuneler, filtrasyon ile toplandı, hızlı bir şekilde alınır ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurulur.
  3. Seyreltme oranı ölçmek için her ministat için son örnekleme yana toplanan atık ölçün. Pompa ayarı yeniden ayarlayarak gerekirse seyreltme oranları ayarlayın veya ince tekil pompa hatları ayarlayın ayarlama.
  4. Boş bir koleksiyon şişelerde atık hatları değiştirin.
  5. Hücre / ml yanı sıra diğer ilgi noktaları ölçmek ve gliserol dondurulmuş stok yapmak.

4. Post-deney Temizleme

  1. Ayrı tepsiler içinde tüm tüp yerleştirin ve GKD 2 O. ile aşırı yıkayın Bir akvaryum pompası ile Kuru tüp.
  2. GKD 2 O ile mantar derlemeler temizleyin ve sırayla su aspirasyon ve dağıtım, iğneleri temizlemek için iğne ucu kullanın. Herhangi kaldırmak için iğne ve mantar dışını silinrezidüel medya.
  3. Su ve etanol ile cam tüp temizleyin ve 3 ile fiziksel kirleri çıkarmak Kimwipes ve forseps kadar tıkıştırılmış.
  4. Durulayın ve kullanmadan önce tekrar tüm parçaları kurulayın.

Representative Results

Ministat dizisi üzerinde ve içinde (Şekil 1A, B) altında kültür tomurcuklanma maya bir haploid mata laboratuvar suşu (S288c) sülfat sınırlayıcı önce tarif edildiği gibi durumlar. 10. Ortak kemostat uygulamalar için etkinliğinin test fizyoloji belirlenmesi de dahil olmak üzere kullanıldı ve tanımlanmıştır Deneysel evrim. Ministats doğrulamak için, 10,20,21 ATR Sixfors fermentörler ministats on kat büyük bir hacim içinde, bir 300 ml çalışma hacmi çalıştırmak edildi. Önce endüstriyel fermentörler yapılan çeşitli deneyler kemostat kullanım için modifiye tekrarladı ve oldukça farklı mod var kültür havalandırma ve ajitasyon. Biz bu fermentörler elde ekipmanları kararlılık, devlet fizyoloji, deneysel evrim sonuçları ve gen ekspresyonu çoğaltmak için çalıştı.

Seyreltme oranı ve havalandırma tekdüzelik kemostat tasarım önemli yönleri olduğundan, biz benibüyüme 15 kuşak sonra 32 ministats genelinde gerçek seyreltme oranı ölçülü ve 0.17 hacim / saat (4-5 damla / dak) bir hedef seyrelme oranı ile biz 32 üzerinde 0,0075 bir standart sapma ile 0,17208 arasında ortalama seyrelme oranı elde ettiklerini bulundu çoğaltır. Bu aralık, gen ekspresyonu büyük ölçekli değişimler gözlenmiştir ötesinde hedef belirleme, gelen + / -0.01 hacim / saat farkı bizim tipik hoşgörü içinde oldu. 22-23 Nisan ministats karşısında hava debisi 307.5 ml olarak belirlendi 9.57 ml / dak 'lık bir standart sapma ile / dak. Bu odalar içine hava-akış sağlamdır ve eşit 4 odacık arasında bölünmüştür göstermektedir ve endüstriyel fermentörler içinde havalandırma için tarif edilene benzer bir değerdir. 20

Biz daha önce maya 8/8 sülfat sınırlı evrim deneylerinde yüksek benzeşim kükürt-iyon taşıyıcı SUL1 tekrarlayan amplifikasyonu görülmüştür. 10. thi altında sonuçların tutarlılığı göz önüne alındığındas durumu bizim sistemde yeteneğini test etmek sülfat sınırlaması seçti. Kemostat kültürünün bir koşul öğesi sürekli kimyasal ortam sağlamak için ihtiyaç vardır. Ortam içinde bir sınırlayıcı besin ya da diğer değişiklikler bolluk dalgalanmalar, tipik olarak, belirli bir kültür içinde hücreleri sayısında bir değişiklik ile sonuçlanır. Biz 0.057 adet standart sapma ile büyüme ~ 15 kuşak sonra 1.12, ortalama A600 (~ 10 9 hücreleri) bulunması, 16 tekrarlı kültürler arasında hücre sayısı (Şekil 2A) ve ölçülen tekrarlanabilirlik için bir proxy olarak optik yoğunluk ölçülür, veya 5.1 %. Karşılaştırma için, endüstriyel fermentörler yetiştirilen 4 tekrarında kültürlerden alınan ölçümlerin% 2.5 standart sapma gösterdi. Hücreler büyüme odasında iyice karıştırılır edildi: OD ve atık parça alınan hücre sayısının ölçülmesi kültür tübüne (veriler gösterilmemiştir) tarafından doğrudan alınan numuneler için eşdeğer olmuştur. Bu sonuçlar bizim platform sağlamlığı bir göstermekendüstriyel fermentör benzer bir tolerans içinde sabit bir kimyasal ortamı sağlamak için d yeteneği.

Fizyolojisinin daha duyarlı bir gösterge olarak, ministats ve endüstriyel fermentör sülfat sınırlaması altında yetiştirilen kültürler genom kararlı durum gen ekspresyonu karşılaştırıldı. Ministats gen ekspresyonu üç biyolojik (Şekil 2B) çoğaltır karşısında yüksek bir benzerlik derecesi göstermektedir. Biz daha önce RNA için iki tekrarında Sixfors chemostats türetilen ve bir mikroarray için co-melezleşmiştir kaydetti, genlerin% 99 ifadesi ampirik bir önemi kesim olarak 1.5x kullanımı sağlayan, 1,5 kat aralığında düştü. 21 Gen ekspresyonu üç tekerrürlü ministats karşılaştırıldığında, ikili, genlerin% 99 sanayi fermentörler sonuçları ile kıyaslanabilir bir 1.5-1.7 kat aralığında düştü gösterdi. Üç örnekleri Tek tek dizileri ve sonrasında hesaplanan ikili oranlarına hibridize edildi, böylece bu vafrengi biyolojik gürültü ek olarak arası bir dizi ses, potansiyel olarak yayınlanan, ortak melezleştirilmiş sonuçları ile karşılaştırıldığında çoğaltır arasında değişim abartmanin içerir. 138 genleri farklı açılardan her üç ministat> 1.5 kat olarak endüstriyel fermentör yetişen bir eşleştirilmiş kültürden toplanan bir örnek ile karşılaştırıldığında tekerrürlü ifade edildi. Ministats ifade azalma Genler ağır demir metabolizması için zenginleştirilmiştir. Bu imza her cihazın konfigürasyonu farklı metal kompozisyonu yansıtıyor olabilir: Sixfors aparatı kültürü dalmış bir metal fan ve havalandırma düzeneği içerir ve önceden kullanılan ortam bidonlarda zamanda metal donanım gereklidir. Ministat paslanmaz çelik iğneler, ancak başka metal bileşenleri kullanır. Bu dernek biyolojik önemi açıklığa olsa artmış ekspresyonu ile Genler büyük ölçüde, hücre zarları ile ilişkili bulunmuştur.

Son olarak, deneysel evrim unde testr bu koşullar. Dizi Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH, Şekil 2C) tarafından tespit edilen sülfat-sınırlı büyüme 250 nesil sonra 4 bağımsız gelişen nüfus testinden 4/4 klon SUL1 amplifikasyonu gösterdi. Bu sonuç, benzer zaman aralıkları boyunca büyük hacimli chemostats bulgularla tutarlıdır. 10

Şekil 1
Kültür odası Şekil ministat dizisi 1. A. Tasarım ve düzenleme. B. Tasarım.

Şekil 2,
Şekil 2. A. experimeBu kültürler arası ntal veri büyüme on nesiller (n = 16) içinde dengeye ulaşması. biyolojik üç eşleşen bir sülfat sınırlı Sixfors kemostat yetişen yaygın bir referans ile karşılaştırıldığında sülfat sınırlaması altında kararlı durum sırasında örneklenen S1-3 çoğaltır B. İfade verileri . C. SUL1 amplifikasyonlar bir sülfat-sınırlı bir ortamda büyümenin 250 kuşak sonra ministats kurtarıldı. Tarif edildiği gibi her bir gelişti klon genomik DNA CGH ile ata DNA ile karşılaştırılmıştır. 21 kopya sayısı, her bir bölgenin amplifiye için hesaplandı ve her bir amplikon yanında gösterilmektedir hesaplandı. Tüm mikroarray veri üyelik GSE36691 altında GEO veritabanında depolanmıştır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

Discussion

Herhangi kemostat olduğu gibi ministats içinde kemostat ekimi, ayrıntı ve sorun giderme dikkat gerektirir. Kontaminasyon sürekli kültür deneylerinde büyük bir endişe olduğu için, biz genellikle bakteri ve mantar aşılama sırasında kirlenme ve uzun vadeli evrim deneyleri sırasında her 50 nesiller için mikroskop üzerinden bakmak. Biz 300'den yüksek nesiller (veriler gösterilmemiştir) 96 evrim deneyi üzerinde kontaminasyon tespit değil bugüne kadar. Ministats ve atık su hattı yoluyla kültür odası kolonize mikropların potansiyeli arasındaki çapraz kirlenme için test etmek için, her bir diğer ministat yukarıdaki gibi maya ve geri kalan herhangi bir kültürü ile inoküle değil ile inoküle edildiği gibi 16 ministats bitti. Kültürleri her gün boşaltılmış bir ortak atık kabına örneklenmiştir. Kirletici atık çizgisi üzerinden girmek için mümkün olsaydı Böylece biz büyük olasılıkla gözlenen olurdu bu experim içindeent. Üç hafta ve biz sigara inoküle ministat kültür tüpleri büyüme gözlemlemek vermedi inoküle ve non-inoküle kültürlerin bu dama tahtası deseni büyüme 100'den büyük nesiller dışında maya ya da diğer mikroplar kontaminasyon deneylerinde olasl düşündüren sırasında benzer zaman dilimlerini.

Ministats ticari chemostats benzer bir moda çalışmak üzere tasarlanmış olmasına rağmen, bu düzenlemenin modüler yapısı optimizasyonu için kullanıcıların ihtiyaçlarına ve bütçelerine uygun sağlar. Bu protokolde kullanılan peristaltik pompa 0.0186 vol / saat 3.6 hacim / saat (veriler gösterilmemiştir) arasındaki akış hızlarına ulaşabilirsiniz. Seyreltme oranları artmış kontrolü alternatif pompa modelleri ile elde edilebilir. Düşük seyreltme oranlarda işlem damlacık teslim aynı frekansı elde etmek için daha yüksek bir iğne arasında ikame gerektirebilir. Nüfus büyüklüğü evrim deneyleri uygun tasarımı için önemli bir husustur.Burada kullanılan standart dilüsyon oranı ve besin konsantrasyonu yayınlanan evrim çalışmaları olarak büyüklükte aynı düzenin nispeten büyük bir nüfus büyüklüğü (~ 10 9 hücreleri) içerir. 11. Büyük veya küçük kitlelerin çalışma hacmini değiştirerek veya besin konsantrasyonu sınırlayarak muhafaza edilebilir. Artan mutasyon kaynağı da yüksek mutasyon oranlarına sahip suşlar ile çalışarak elde edilebilir.

Ministats da mevcut tasarımı üzerinde geliştirilebilir. Örneğin yoğuşma kültürü tüp duvarları üzerinde toplamak ve büyük derin su banyosunda, inkübatör veya sabit sıcaklık odasında kullanılarak azaltılabilir için. Topaklanma ve sülfat sınırlı kültürlerde duvar büyüme 300 nesiller (veriler gösterilmemiştir), yüzey çeşitli 5/48 evrim deneylerde ortaya çıkan, nispeten nadir görülür rağmen bu özelliği azalan veya geciktirmek yardımcı olabilir mevcuttur. Topaklanma uygun kültür müdahale durumundaKarışım, yüksek ajitasyon her bir hava pompası ayrılır yolu sayısını azaltarak ya da bir karıştırma aparatı ekleyerek elde edilebilir. Çözünmüş gaz konsantrasyonu, pH, ya da diğer parametreler için ek probları, aynı zamanda, bazı başka tasarımlarda olduğu gibi, dahil edilebilir. 17

Büyük hacimli ticari chemostats için bildirilen verilere bizim cihaz karşılaştırırken potansiyel değişim rağmen, bu protokolde belirtilen ministats kullanarak, biz son derece tutarlı deneysel parametreleri ve tekrarlanabilir sonuçlar gözlenmiştir. Bu 10-15 nesiller (Şekil 2A) içinde kararlı durum dengeye ulaşması ve denge benzeri kültür yoğunlukları elde aracılığıyla görüldüğü gibi hücresel fizyoloji tekrarlanabilirlik dahil. Gen ekspresyonu demir metabolizması genetik dışında, biyolojik üç ministats çoğaltır genelinde ve ministats ve ticari büyük hacimli platformlar (Şekil 2B) arasında tutarlıydı. Bu expdışarı yansıması farklılıklar muhtemelen iki aygıt veya medya maddeler kalitesinde iyileştirmeler metal içeriği değişikliklerden kaynaklanır. Bizim veri ministats tutarlı bir ortam gereklidir fizyoloji veya rekabet deneyler için yararlı olacağını düşündürmektedir.

Ministat tasarımı biz 250 nesiller için sülfat sınırlaması altında kültürler gelişti ve SUL1 loküsündeki amplifikasyon karakterize etmek CGH kullanılan deneysel evrim uygulamalar için yeterli olup olmadığını test etmek için -. Daha büyük hacimli chemostats bu koşullar altında uzun-dönemli evrimi bir işaretidir 10 Biz gözlenen sülfat sınırlı medya 4/4 bağımsız bir evrim deneyleri (Şekil 2C) adlı klonlar SUL1 amplifikasyonu. Bir bütün olarak ele alındığında bu veriler, ministats geleneksel kemostat çeşitli uygulamalar için yararlı olabilecek güçlü bir platform olduğunu göstermektedir. Biz kültür tomurcuklanan maya kullanımı gözlenmekle birlikte, ministats gerekirAyrıca aslında kültür bakterileri ve diğer maya türleri için kullanılmış diğer organizmalar ve benzer tasarımları ile uyumlu olması. 16,17,25 Dahası küçük kültür düzeyi ve medya için korelasyon azalmıştır ihtiyaç gerektiren deneyler için ministats cazip bir alternatif hale getirebilir pahalı ve egzotik reaktifler olarak kimyasal ya da genetik ekranlarında söz konusu olabilir.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

Video Yaratılış Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (5P41RR011823-17) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Sağlık Bilimleri Ulusal Enstitüsü (8 P41 GM103533-17) hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda NSF hibe 1120425 tarafından desteklenmiştir. MJD Bir Rita Allen Vakfı Akademik olduğunu. AWM NIH T32 HG00035 tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz protokolleri geliştirmek için yardım Anna Sunshine ederim. Ayrıca, ministats erken kullanıcıları olarak Sara DiRienzi, Celia Payen ve Amy Sirr kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3/32" x 7/32" silicone tubing VWR 63009-260 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/2" x 5/8" silicone tubing (extra large) VWR 63009-299 Tubing: Order: (50' coil pack)
1/4" x 3/8" silicone tubing (medium) VWR 63009-279 Tubing: Order: (50' coil pack)
Orange green marprene pump tubing Watson-Marlow 978.0038.00+ Tubing: Order: 6x(pack of 6)
Female luer, 1/8" barb Cole Parmer HV-45500-04 Connectors: Order: 4x(pack of 25)
Male luer lock, 1/8" barb Cole Parmer HV-45503-04 Connectors: Order: 1x (pack of 25)
Reducing connector, PVDF, 1/4" to 1/8" Cole Parmer EW-30703-50 Connectors: Order: 1x (pack of 10)
Barbed Y connector, 1/8" ID Cole Parmer HV-30703-92 Connectors: Order: 3x(pack of 10)
Medium tubing clamps VWR 63022-405 Clamps: Order: 1x(pack of 12)
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) VWR 21730-001 Clamps: Order: 1x(pack of 10)
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. Fisher 05-112-39 Connectors: Order: 1x(pack of 25)
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene Fisher 05-112-37 Connectors: Order: 1x(pack of 5)
Silent Air Pumps Aquarium Guys.com 212422 Air Supply: Order: 4 pumps
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration Cole Parmer HV-02915-22 Air Supply: Order: 1x(box of 100)
1L Flask with sidearm Fisher 10-181F Air Supply: Order: 2x(Pack of 6)
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks Fisher K953715-0801 Air Supply: Order: 8 stoppers
4-Port manifold Cole Parmer EW-06464-85 Air Supply: Order: 8 manifolds
55 ml Screw cap culture tubes Corning Life Sciences 9825-25 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48)
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line Fisher 14-817-105 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Spinal tap needle VWR BD40836 Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10)
Regular hypodermic pink needle Fisher 14-817-104 Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100)
Foam Silicone stopper size "2", pink Cole Parmer EW-06298-06 Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20)
8-Well tube Rack VWR 82024-452 Culture Chamber: Order: 4 racks
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe VWR 89001-530 Media: Order: 2 or more
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 Cole Parmer EW-06298-22 Media: Order: 2 or more
Carboy Venting Filter Fisher SLFG 050 10 Media: Order: 1x(pack of 10)
Electrical tape, green Amazon.com 10851-BA-10 Media: Order 1 roll.
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm VWR 29442-978 Media: Order: (1 case of 12)
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe VWR 89003-384 Media: (Optional)
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 Cole Parmer EW-06298-18 Media: (Optional)
205S/CA16, 16 Cartridge pump Watson-Marlow 020.3716.00A Media Pump: Order: 1
16-channel 205CA Extension pump head Watson-Marlow 023.1401.000 Media Pump: Order: 2 extension pump heads
Silicone aquarium sealer Fisher S18180B Media Pump: Order: 1
6-block dry bath VWR 12621-120 Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16.
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block VWR 12621-120 Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16.
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm Fisher R04SP02500 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm Fisher R04SP04700 Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional)
47 mm, large filter apparatus Fisher XX10 047 30 Harvesting: Order: 1 (optional)
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus VWR 26316-692 Harvesting: Order: 1 (optional)
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen VWR 63380-052 Harvesting: Order: 1 (optional)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monod, J. Récherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
  2. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 15, 715-716 (1950).
  3. Daran-Lapujade, P., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast. Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).
  4. ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).
  5. Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
  6. Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation. 101, 3148-3153 (2004).
  7. Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).
  8. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  9. Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors. Mutation Res. 1, 113-120 (1964).
  10. Gresham, D., Dunham, M. J., et al. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
  11. Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
  12. Kvitek, D. J., Sherlock, G. Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape. PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).
  13. Helling, R. B., Adams, J. Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment. Genetics. 116, 349-358 (1987).
  14. Dunham, M. J. Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide. Methods Enzymol. 470, (2010).
  15. Hoskisson, P. A., Hobbs, G. Continuous culture - making a comeback. Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).
  16. Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).
  17. Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas. Biotechnol. and bioeng. (2012).
  18. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  19. Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  20. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures. Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).
  21. Torres, E. M., Amon, A., et al. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317, 916-924 (2007).
  22. Regenberg, B., Nielsen, J., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biology. 7, R107 (2006).
  23. Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. Journal of Biology. 6, 4 (2007).
  24. Brauer, M. J., Botstein, D., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  25. Ferenci, T. Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment. Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).

Comments

3 Comments

  1. Our more detailed lab manual for building and running the ministats is also posted on my lab website:
    http://dunham.gs.washington.edu/protocols.shtml
    We'd love to hear from anyone who builds a set, especially if you improve on our design!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    March 1, 2013 - 4:28 PM
  2. This is great! I was about to email you and ask about small chemostats (I used to run chemostat experiments for F Rosenzweig, so I know about those custom-blown glass babies!). I'll be building a set of these ministats to use in experiments with Chlamydomonas reinhardtii. Have you had any problems with the effluent needle clogging, or with back growth up the needle? Since the vessel is under slight positive pressure, I guess that I could clean the exterior of the needle every so often with EtOH -- this is going to be a very long long experiment!

    Heidi Kuehne, U Edinburgh

    Reply
    Posted by: Heidi K.
    August 26, 2013 - 9:43 AM
  3. Hi Heidi. I'm excited you're building a setup for Chlamydomonas! We have not had backflow problems, as long as the pump head is fastened down. You do need to clamp the media lines if you are loosening the pump heads. However, we have had growth in the needle on occasion (never on the exterior of the needle). One nice thing is that the setup is modular, so if it happens, you can just swab the cork with ethanol and swap in another piece of sterile tubing with a new needle. However, for yeast, line growth is highly correlated with the evolution of clumping/wall growth, so we do get recolonization at some frequency. We have not gotten effluent needle clogging, even with cultures that evolve large clumps, and we have never seen back-contamination via the effluent lines. The air flow seems to be sufficient to empty the line efficiently and keep it cleared. Let me know if you have any other questions, and I'd love to hear how it turns out. Good luck!

    Reply
    Posted by: Maitreya D.
    August 26, 2013 - 4:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats