تنقية الرنا الميكروي والتنميط من Exosomes المشتقة من الدم والثقافة وسائل الإعلام

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وقد ولدت وجود microRNAs مستقرة (miRNAs) في exosomes مصلحة هائلة كوسيلة للاتصال بين الخلايا الرواية، لفائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية وكطريق للتدخل العلاجي. نحن هنا لشرح تنقية exosome من الدم والثقافة وسائل الإعلام تليها الكمية PCR لتحديد miRNAs التي يجري نقلها.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294, doi:10.3791/50294 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

miRNAs غير مكود قصيرة تعدل التعبير الجيني عن طريق الربط إلى الهدف مرنا. البذور تسلسل التكامل بين ~ 7 أزواج قاعدة تمكن ميرنا لربط مرنا الهدف مما أدى إلى تثبيط الترجمة أو في انخفاض في استقرار مرنا، وكلاهما يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في التعبير عن بروتين الهدف 1. حيث أثبت بحث علمي على مدى العقد الماضي بشكل لا لبس فيه دورا أساسيا لmiRNAs في التوسط في الوظائف الخلوية. وكان هناك أيضا جهدا كبيرا توجه نحو تشريح ميرنا التغيرات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض المختلفة بوساطة 2،3. وعلاوة على ذلك، وتحديد الأخيرة لل miRNAs مستقرة في سوائل الجسم 4-6 مهدت الطريق لاستخدامهم المؤشرات الحيوية رواية قابلة للتشخيص السريري.

وضع واحدة من وسائل النقل ميرنا في سوائل الجسم هو عبر exosomes، حويصلات صغيرة التي تحمل mRNAs و، البروتينات، الدهون وسطاء، وmiRNAs إلى خلايا المتلقي عبر النظامية circulat الدمأيون 7-14. هذه النتائج في التشكيل التعبير الجيني في الخلايا المتلقية ويمثل آلية جديدة للاتصالات الخلوية. على سبيل المثال، يمكن أن الخلايا المناعية تعدل العمليات التنظيمية عن طريق إفراز و / أو exosomes امتصاص الجزيئات الحيوية التي تحتوي على المشاركة في التهاب مثل انترلوكين 1β (IL1β)، عامل نخر الورم α (TNFα)، وتحويل عامل النمو β5 (TGFβ5)، و وmiRNAs التي تنظم هذه الجينات 13. كما الشاذة التعبير ميرنا هو سمة مشتركة في مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، وهذه الجزيئات فرصا جديدة مثيرة لاكتشاف والتحقق من أهداف علاجية جديدة 2.

miRNAs تعميم موجودة في جميع سوائل الجسم وأنه من المعروف أن تكوين exosomes يختلف استنادا إلى الخلايا المصدر الذي تم الإفراج عنهم. وبالتالي فإنها تقدم وسيلة لدراسة الحالة الفسيولوجية للخلايا وكيف الخلايا يغير إشارة حتىTS ردا على الإجهاد بما في ذلك الأمراض. يمكن دراسة تغيرات في تكوين exosome توفير نظرة ثاقبة نقل الإشارة والتحقيق فائدتها المحتملة والمؤشرات الحيوية أو المسارات التدخل العلاجي.

هنا سوف نظهر تنقية exosomes من مصادر متعددة استنادا إلى البروتوكولات التي تم نشرها. وسوف تستخدم هذه exosomes لعزل الحمض النووي الريبي تليها QPCR لتحديد وقياس مستويات لل miRNAs موجودة في exosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأعدم جميع التجارب باستخدام عينات دم من الإنسان والقوارض في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة. التحق البشر بعد إعطاء الموافقة المسبقة على النحو الذي أقرته جامعة دريكسيل كلية الطب مجلس المراجعة المؤسساتي وجميع إجراءات الدراسات التي أجريت باستخدام حيوانات وافق عليها المؤسسي رعاية الحيوان دريكسيل واستخدام اللجنة.

1. تنقية Exosome من الدم (~ 5.5 ساعة)

TIPS

  • نحن resuspend exosomes من أنبوب واحد من الدم (~ 10 مل دم الإنسان و~ 2 مل دم الماوس) في 300 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي الريبي من mirVana ميرنا عدة العزلة.
  • لتنقية exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الخلية، ونسج وسائل الإعلام في 500 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة الخلايا وتصفيتها أيضا من خلال مرشح 0.22 ميكرون بعد الطرد المركزي في 12،000 ز س. تنقية exosome من وسائل الإعلام ثقافة الخليةلا يتطلب التخفيف في برنامج تلفزيوني، ويغسل PBS أو الخطوة الثانية تنبيذ فائق.
  • إذا كان سيتم استخدام exosomes تنقيته للدراسات البروتينات، إضافة السكروز التدرج خطوة الطرد المركزي بعد خطوة تنبيذ فائق سوف تقلل من كمية البروتين المجاميع والملوثات 15.
  • مورفولوجية المرصودة من exosomes يمكن أن تختلف اعتمادا على كل من المصدر والخطوات اللازم للتجهيز لTEM. نحن لم تراع التشكل على شكل كوب لexosomes التي ويعزى سابقا إلى الاختلافات في تجهيز العينات 9،15. لدينا صور TEM بما في ذلك وضع العلامات immunogold مماثلة لتقارير سابقة من مصادر مختلفة بما في ذلك الدم، الصفراوي والثقافة القشرية المستمدة exosomes 9،16،17.
  1. عكس EDTA أنبوب المغلفة التي تحتوي على الدم 5X ومكان تستقيم في درجة حرارة الغرفة ل10-60 دقيقة.
  2. الطرد المركزي في 2،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. لى>
  3. جمع الطبقة العليا، والبلازما، في 15 مل أنابيب والحفاظ على الجليد.
  4. تمييع السائل مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 2،000 XG في 4 درجات مئوية.
  5. نقل إلى أنابيب الطرد المركزي، إضافة 1X PBS لوحدة تخزين ما مجموعه 24 مل، وأجهزة الطرد المركزي 45 دقيقة في XG 12،000 في 4 درجات مئوية.
  6. نقل إلى أنابيب منبذة فائقة وأجهزة الطرد المركزي 2 ساعة على 110،000 XG في 4 درجات مئوية.
  7. بيليه resuspend في برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي 1 ساعة على 100،000 XG في 4 درجات مئوية.
  8. بيليه resuspend في المخزن المناسب (العازلة تحلل الحمض النووي الريبي).
  9. resuspend في برنامج تلفزيوني أو RIPA العازلة للفحص المجهري الإلكترون وتحليل لطخة غربية على التوالي.

2. RNA تنقية باستخدام mirVana كيت عزل ميرنا التعديل (~ 1 ساعة)

TIPS

  • إعداد المنطقة لعزل الحمض النووي الريبي من خلال ارتداء معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، ومحو الأسطح وماصات مع ريبونوكلياز زاب، واستخدام نصائح تصفية العقيمة والأنابيب.
  • الطبقة = "jove_content"> على الرغم من أن بروتوكول من البائع يعطي الخيار لتنقية ميرنا فقط، ونحن دائما عزل الحمض النووي الريبي مجموع بما في ذلك مرنا وميرنا حتى نتمكن من دراسة كلا من نفس العينة.
  • مضيفا إن على من عمود خطوة العلاج الدناز يزيل آثار من الحمض النووي التي قد تكون موجودة. اعتمادا على مصدر exosomes، تم الإبلاغ عن الحمض النووي لتغيبه في exosomes تنقيته من بعض المصادر بما فيها الماوس وخطوط الخلايا البدينة الإنسان 8 ولكن تم الكشف عن تسلسل الحمض النووي الكروموسومات في exosomes تنقيته من وسائل الإعلام من العضلية مثقف 18.
  • خفضنا حجم محلول الغسيل 1-350 ميكرولتر (الخطوة 2.4 أدناه) لأن البائع يقدم فقط ما يكفي من غسل حل 1 ل700 واحد بالإضافة ميكرولتر. إذا لم يتم خفض حجم ليس هناك حلا كافيا تركت لاستخدام محتويات عدة كامل. أجريت الخطوات المتبقية وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
  1. إضافة 1/10 VOلوم من ميرنا المضافة جناسة (30 ميكرولتر)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  2. استخراج مع حجم حمض الفينول: الكلوروفورم مساويا لحجم المحللة الأولية. أجهزة الطرد المركزي واستعادة المرحلة العليا في أنبوب جديد.
  3. إضافة 1.25 حجم الإيثانول بنسبة 100٪ (375 ميكرولتر). دوامة. تطبيق لتصفية خرطوشة وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
  4. إضافة نصف أوصت حجم ميرنا غسل الحل 1 (350 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
  5. إضافة 10 ميكرولتر الدناز 1-70 ميكرولتر العازلة نشر الإشعاعات (QIAGEN) لكل عينة. إضافة 80 ميكرولتر إلى العمود واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. أضف غسل الحل 1 (350 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س.
  7. أضف غسل الحل 2/3 (500 ميكرولتر) وأجهزة الطرد المركزي 15 ثانية في 10،000 ز س. تكرار.
  8. أزل مع 40 ميكرولتر 95 ° C nuclease خالية-H 2 O.
  9. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي ويخفف من الحمض النووي الريبي إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر.

3. التنميط ميرنا من Exosomes من فيلات الفندقيةد عن طريق Taqman صفيف منخفض الكثافة (TLDA) بطاقات (~ 6.5 ساعة)

TIPS

  • إعداد المنطقة لعزل الحمض النووي الريبي من خلال ارتداء معدات الوقاية الشخصية، ومحو الأسطح وماصات مع ريبونوكلياز زاب، واستخدام نصائح تصفية العقيمة والأنابيب.
  • ينصح قبل التضخيم (قبل أمبير) خطوة ل1-350 نانوغرام الحمض النووي الريبي (350-1،000 عينات نانوغرام لا تتطلب خطوة ما قبل أمبير بعد التوليف [كدنا]). ومن المهم تحديد ما إذا كان ما قبل أمبير هو ضروري لعينتك لأنه يجب معاملة جميع العينات تحت ظروف متساوية. الخطوة ما قبل أمبير يضيف التكلفة والقيم المقطعية لديهم انخفاض خفض قبالة مقبول (32 بدلا من 40).
  • ومن المفيد لإعداد رد فعل [كدنا] في أنابيب الشريط بدلا من لوحة اعتمادا على عدد من البطاقات التي يمكن تشغيلها في يوم واحد. وهذا سيقلل تجميد أذاب عينات من [كدنا] التي لن تتم معالجتها في نفس اليوم.
  • Exosomes تم جمعها من مصادر مختلفة لها diffeاستئجار كميات من الحمض النووي الريبي. هذا البروتوكول يسمح بحد أقصى 3 ميكرولتر قالب الحمض النووي الريبي للتفاعل التوليف [كدنا]. اعتمادا على مصدر، وكمية من الحمض النووي الريبي exosomal التي يمكن أن تكون معزولة محدودة ربما. في حين أن الأنسجة نموذجية سيحقق ما يكفي من الحمض النووي الريبي التي من شأنها أن كدنا] أن تكون مصنوعة من 100 نانوغرام في الحمض النووي الريبي 3 حجم ميكرولتر، exosomes من الدم البشري أو وسائل الإعلام ثقافة الخلية البشرية غالبا ما تحتوي على أقل RNA وكدنا] يجب أن تكون مصنوعة من مواد أقل البداية. exosomes الدم الماوس تحتوي على مستويات أعلى من الحمض النووي الريبي ويمكن الحصول عليها لا يقل عن 100 نانوغرام في 3 ميكرولتر.
  1. لإعداد [كدنا] من تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجمعات ميجابلكس عكس الاشعال الناسخ (A بركة وبركة تحتوي على الاشعال لmiRNAs على بطاقات ميكروفلويديك B صفيف A و B)، أذاب المكونات رد فعل على الجليد.
  2. تسمية اثنين من ريبونوكلياز خالية من 1.5 مل أنابيب لرد فعل RT جانب حمام سباحة للالاشعال أو بركة B الاشعال وإضافة مكونات من أجل التخطيط. إضافة واحد على الأقل حجم اضافية من المكونات لمدة 2 أو أكثر ردود الفعل أو جعل مزيج الرئيسي على النحو الموصى به من قبل رانه بائع.
RT مكون رد فعل تركيز عنصر حجم العينة ل1 (مجموع V / عينة = 4.5 ميكرولتر)
المياه nuclease خالية- 0.20 ميكرولتر
ميجابلكس RT العازلة (10X) 1X 0.80 ميكرولتر
dNTPs (100 ملم) 4.4 ملي 0.20 ميكرولتر
MgCl 2 (25 ملم) 5 ملي 0.90 ميكرولتر
ريبونوكلياز المانع (20U/μl) 2 U 0.10 ميكرولتر
ميجابلكس RT الاشعال A أو B (10X) 1X 0.80 ميكرولتر
MultiScribe الناسخ العكسي 75 U 1.50 ميكرولتر
  1. عكس أنابيب 6 مرات والمائةrifuge لفترة وجيزة. ثم، ماصة 4.5 ميكرولتر RT مزيج التفاعل إلى MicroAmp شرائط 8-أنبوب أو 96 جيدا MicroAmp لوحة رد فعل بصري.
  2. إضافة 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي وضبط مستوى الصوت إلى 3 ميكرولتر مع المياه المعالجة DEPC أو إضافة 3 ميكرولتر الحمض النووي الريبي مجموع، وإثارة مع طرف ماصة، وختم أنابيب أو لوحة. تدور لفترة وجيزة واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
  3. تحميل رد فعل في الجهاز PCR وتشغيله وفقا للشروط التالية (على النحو الموصى به من قبل النظم البيولوجية ميجابلكس بروتوكول مجمعات التطبيقية):
مرحلة درجة الحرارة وقت
دورة (40X) 16 ° C 2 دقيقة
42 ° C 1 دقيقة
50 ° C 1 ثانية
عقد 85 ° C 5 دقائق
عقد 4 ° C
  1. تخزين [كدنا] في -20 ° C (جيد لمدة أسبوع واحد على الأقل) أو الاستمرار في الخطوة ما قبل أمبير التي يمكن تخزينها لمدة أسبوع واحد.
  2. ذوبان الجليد الاشعال PREAMP للسباحة وبركة A B على الجليد وعكس إلى المزيج. دوامة Taqman قبل الأمبير ماستر خلط والحفاظ على الجليد أيضا.
  3. متابعة الرسم البياني إضافة واحدة على الأقل حجم اضافية من المكونات لمدة 2 أو أكثر ردود الفعل أو جعل مزيج الرئيسي على النحو الموصى به من قبل البائع.
قبل أمبير مكون رد الفعل حجم العينة لمدة 1
المياه nuclease خالية- 7.5 ميكرولتر
Taqman ميكس ماستر PREAMP (2X) 12.5 ميكرولتر
الاشعال PREAMP ميجابلكس A أو B (10X) 2.5 ميكرولتر
  1. ماصة 2.5 ميكرولتر RT الم ÙCT في MicroAmp شرائط 8-أنبوب أو 96 جيدا MicroAmp لوحة رد فعل بصري والاستغناء 22.5 ميكرولتر مزيج رد فعل PREAMP في كل بئر.
  2. ختم لوحة، واحتضان على الجليد 5 دقائق ثم تحميل العينة في الجهاز PCR. تعمل تحت الشروط التالية.
مرحلة درجة الحرارة وقت
عقد 95 ° C 10 دقيقة
عقد 55 ° C 2 دقيقة
عقد 72 ° C 2 دقيقة
دورة (12X) 95 ° C 15 ثانية
60 ° C 4 دقيقة
عقد 99.9 ° C 10 دقيقة
عقد 4 ° C
  1. بعد الانتهاء من رد فعل PREAMP، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على أنابيب أو لوحة ثم قم بإضافة 75 ميكرولتر 0.1X TE 8.0 درجة الحموضة إلى كل بئر أو أنبوب.
  2. ختم وخلط وتدور لفترة وجيزة. تخزين المنتج المخفف لمدة أسبوع عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو الاستمرار على لتحميل لوحة.
  3. الجمع بين ما يلي في ريبونوكلياز خالية من 1.5 مل أنبوب على الجليد.
عنصر الصوت لبطاقة 1
Taqman العالمي PCR ماجستير ميكس، لا AmpErase UNG (2X) 450 ميكرولتر
المنتج PREAMP المخفف 9 ميكرولتر
المياه nuclease خالية- 441 ميكرولتر
  1. عكس أنبوب لخلط وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. الاستغناء عن 100 ميكرولتر PCR مزيج التفاعل إلى كل منفذ من الرنا الميكروي بطاقة صفيف Taqman.
  2. أجهزة الطرد المركزي في بطاقة 2 × 1،000 x ج لمدة 1 دقيقة. ختم البطاقة وتشغيلها باستخدام النموذج المقدم مع الاشعال في النظم البيولوجية التطبيقية اليدوي وكذلك Taqman منخفض الكثافة 384 إعدادات صفيف. نحن نستخدم النظم البيولوجية 7900HT سريعة نظام PCR في الوقت الحقيقي التطبيقية.

4. مرنا التحليل من قبل Taqman (~ 1.5 ساعة)

  1. لإعداد رد فعل QPCR، مزج المكونات في رد فعل النظام في التخطيط. وسوف يتم تحليل جميع العينات مع تحقيقات التمهيدي لالجينات في المصالح وكذلك 18S الرنا الريباسي كما الجين الامور الى حالة طبيعية.
Taqman مكون رد الفعل حجم العينة لمدة 1
المياه nuclease خالية- 7 ميكرولتر (ضبط استنادا إلى عينة الفردية)
Taqman سريعة ماستر ميكس (2X) 10 ميكرولتر
تحقيقات التمهيدي Taqman (20X) 1 ميكرولتر
[كدنا] من الحمض النووي الريبي 100 نانوغرام 2 ومو، L (ضبط على عينة الفردية)
  1. تشغيل لوحة جيدا باستخدام 96 بلوك 96 جيدا سريعة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة (النظم البيولوجية التطبيقية 7900HT سريعة نظام PCR في الوقت الحقيقي).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد عزل exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الدم أو خلية، ونقاء exosomes يمكن اختبارها من قبل المجهر الإلكتروني (EM) والغربية وصمة عار (أرقام 1A و 1B). أكدنا الاستعدادات exosome لدينا من مصادر مختلفة مع EM وطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة متعددة. الشكل 1A يظهر EM الصور تؤكد أن exosomes سليمة التي يبلغ قطرها 30 نانومتر ~ -100 وتحتوي على CD81 بواسطة وضع العلامات immunogold. علامات exosomal شيوعا هي بروتينات سكرية الأسرة HSP70 وtetraspannin CD63، CD81 وCD9 14. بعد التأكد من سلامة exosomes تنقيته، أجرينا لطخة غربية لHSP70 في الشكل 1B وأظهرت أن exosomes تحتوي HSP70 بينما وسائل الاعلام وحدها (مراقبة سلبية) لا. تتبع Bioanalyzer يدل على أن exosomes معزولة عن RAW سائل الإعلام والثقافة الخلية تحتوي على مجموعة متنوعة من الرنا، ولكن لا تحتوي على كميات كبيرة من الرنا الريباسي التي هي نموذجية في الحمض النووي الريبي من كلهالخلية (الشكل 1C). يبين الشكل 1D تحليل QPCR من مرنا من الدم الكامل و exosomes المستمدة من الدم. ونحن قادرون على عزل 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي exosomal من ~ 10 مل دم الإنسان باستخدام mirVana ميرنا عدة العزلة. النتائج QPCR تشير إلى وجود mRNAs وترميز عامل نمو بطانة الأوعية الدموية وTNFα A (VEGFA) في تنقية exosomes وكذلك في الدم الكامل.

بالإضافة إلى QPCR للدراسات التعبير الجيني، كما تم استخدام الحمض النووي الريبي مجموع لالتنميط ميرنا. ميرنا TLDA بطاقة الإصدار 3.0 يحتوي على تحقيقات التمهيدي ل~ 758 miRNAs بما في ذلك السيطرة الذاتية RNA U6. مع إضافة الخطوة قبل التضخيم، يوصي بائع 30 نانوغرام الحمض النووي الريبي لتشغيل بطاقة TLDA. وهذا مفيد لتحليل الحمض النووي الريبي من exosomes تنقيته من مصل الدم أو البشرية التي عادة ما يكون انخفاض العوائد من تلك تنقيته من الدم الماوس. تم إجراء تحليل ميرنا هو مبين في الشكل 2 مع 250 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الدم الماوسexosomes و15-30 نانوغرام من الحمض النووي الريبي exosomal دم الإنسان أو الخلايا البطانية الأبهر الإنسان (HAOEC). نتائجنا تشير إلى وجود 89 miRNAs في exosomes تم جمعها من الدم الماوس، 209 miRNAs في exosomes دم الإنسان، و 199 miRNAs في exosomes من وسائل الإعلام ثقافة الخلية البشرية. وتظهر بيانات ممثل لمدة ستة miRNAs كما دلتا قيمة ط م تطبيع إلى RNA U6 الذاتية للدماء القوارض (الشكل 2A)، دم الإنسان (الشكل 2B) وHAOEC خلية ثقافة وسائل الإعلام (الشكل 2C). في حين مير 126-200C ومير كانت غائبة في exosomes من الدم القوارض أو وسائل الإعلام HAOEC على التوالي، وmiRNAs الأربعة المتبقية موجودة في جميع العينات الثلاث بكميات متفاوتة. نسبة إلى exosomes تنقيته من وسائل الإعلام ثقافة الخلية، وأعرب عن مير-223 على مستويات أعلى في exosomes من عينات دم الإنسان والقوارض.

الشكل 1
الشكل 1. TRansmission المجهر الإلكتروني (TEM)، ويسترن طخة تحليل وQRT-PCR لmRNAs واستخدام exosomes تنقيته من مصادر مختلفة. A) صورة TEM من الدم الماوس exosomes معلق في غلوتارالدهيد 1٪ (إلى اليسار) أو RAW خلية exosomes المستمدة معلق في بارافورمالدهيد 4٪، وصفت مع 10 نانومتر الذهب والأرانب مكافحة CD81 (يمين) ورصدت على formvar شبكات الكربون المغلفة لEM . تحليل (شريط مقياس = 100 نانومتر) B) تحليل الغربية من HSP70 في exosomes تنقيته من الدم الماوس أو وسائل الإعلام خالية من exosome + / - 24 ساعة الحضانة مع RAW 264.7 خلايا الفئران ومعلق في RIPA العازلة C) تحليل Bioanalyzer من الحمض النووي الريبي مجموع تنقيته من exosomes المستمدة من RAW 264.7 خلية ثقافة وسائل الإعلام D) الحمض النووي الريبي مجموع تنقيته من الدم الكامل و exosomes تم الحصول عليها من سيطرة الإنسان ممثل كان يستخدم لمقارنة مستويات التعبير عن TNFα وVEGFA. اضغط هنالعرض أكبر شخصية.

الشكل 2
الشكل 2. التعبير النسبي للجزء ميرنا وجدت في exosomes. دورة عتبة (CT القيمة) هو مقياس نسبي للتركيز على ميرنا الفردية في رد فعل PCR، وانخفاض قيمة CT يشير التعبير العالي. تم تطبيع القيم QPCR لمدة ستة miRNAs exosomal كشفها إلى RNA U6 ورسوم بيانية والقيم ط م دلتا للexosomes من ثلاثة مصادر. تشير القيمة السلبية العالي التعبير في هذا الرقم. Exosomes من الدم القوارض (A) والدم البشري (B) أعرب هائل سعيد أنعم مير-223 على مستويات أعلى من التحكم، في حين exosomes من HAOEC خلية ثقافة وسائل الإعلام (C) أعرب هائل سعيد أنعم مير-223 على مستويات أدنى من السيطرة. كان هائل سعيد أنعم مير-226 غائبة عن exosomes الدم القوارض وكان هائل سعيد أنعم مير-200C غائبة عن exosomes HAOEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول، وتبين لنا من القياس الكمي لل miRNAs وmRNAs وتنقيته من exosomes بواسطة الطرد المركزي المغاير من الدم والثقافة وسائل الإعلام. Exosomes على مكونات متنوعة تعتمد على أصلهم وتشارك في عدد من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك الاستجابة المناعية، العرض مستضد، الاتصال بين الخلايا، ونقل الحمض النووي الريبي والبروتينات 9،11،12،19،20. بينما حجم وشكل هو أحد المحددات من النقاء exosome، عددا من ورقات تظهر EM البيانات من exosomes تشير إلى أن هذه الحويصلات يمكن أن تتراوح في الحجم والتشكل استنادا إلى المصدر الذي تفرز أنها فضلا عن الطريقة المستخدمة لتثبيت والتصوير 9 ، 15. حجم المقبولة للexosomes من 30-100 نانومتر هو متوسط ​​النطاق الذي يشمل عدد صغير من السكان من exosomes التي يبلغ قطرها أكبر اعتمادا على مصدر 21،22، أحد الأسباب التي تستخدم أساليب متعددة للتحقق من صحة نقاء exosomal. miRNAs يفرز دينا العديد من الملامح المطلوبةES المؤشرات الحيوية جيدة 23 بالإضافة إلى كونه الأهداف العلاجية المحتملة لمختلف الأمراض 2،3،24. يوفر هذا الأسلوب وسيلة تنقية موسع لوصف التغيرات البيولوجية الزمنية في المحتوى exosomal من مجموعة متنوعة من سوائل الجسم في حين التنميط ميرنا من قبل QPCR يوفر نظرة شاملة للمحتوى ميرنا 2. ومن المعروف أكثر من 4،500 البروتينات، 1،639 mRNAs و، 764 miRNAs و 194 نسبة الدهون في لاقترانه exosomes 25 ( www.exocarta.org ) وفي بعض الحالات، وقد تم بالفعل ربط التغيرات في مستويات هذه الجزيئات الحيوية للدول المرض. في دراساتنا، وكان exosomes تنقيته من الدم البشري العديد من miRNAs مشتركة مع exosomes تنقيته من وسائل الإعلام من خطوط مثقف الخلايا البشرية ولكن فروق ذات دلالة إحصائية من miRNAs exosomal الموجودة في الدم الماوس. في حين أن هناك أمثلة لل miRNAs التي تستهدف مرنا واحد فقط، العديد من miRNAs تعمل للحد جزئيا مستويات multipجنيه يستهدف مما يؤدي إلى الاستجابة الفسيولوجية قوية. تميز كلا مرنا وميرنا الموجودة في exosomes يقدم رؤية فريدة من نوعها في exosome بوساطة نقل المعلومات ودور تعميم miRNAs في التوسط التغيرات في التعبير الجيني. وتنقية وتوصيف exosomes من مجموعة متنوعة من المصادر أن تكون مفيدة في تحديد التوقيعات الجزيئية المرتبطة بهذه حويصلات إفرازية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من جانب صناديق من ريتا منحة مؤسسة ألين لاجيت سينا. فإن الكتاب أود أن أنوه اريكا بالوغ والدكتور سوميترا Ghoshroy من جامعة ولاية كارولينا الجنوبية مركز المجهري إلكترون للاستخدام الصك، المساعدة العلمية والتقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) BD Diagnostics 366643 For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) BD Diagnostics 367841 For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube BD Diagnostics 762165 For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit Ambion AM1561
Acid-Phenol: CHCl3 Ambion 9721G
DNase 1 Qiagen 79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG Applied Biosystems 4326614 For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 Applied Biosystems 4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 Applied Biosystems 4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 Applied Biosystems 4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0 Applied Biosystems 4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0 Applied Biosystems 4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems 4444913
Taqman MicroRNA RT kit Applied Biosystems 4366596
Taqman fast universal PCR master mix Applied Biosystems 4366072 For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe) Applied Biosystems Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) Applied Biosystems Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR Thermo Scientific K1642 For mRNA
HSP70 antibody Abcam ab94368 For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold Sigma G7402 For electron microscopy
Rabbit-anti CD81 Sigma SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  2. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  3. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
  4. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
  5. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
  6. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
  7. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
  8. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
  9. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  10. Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
  11. Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. (2011).
  12. Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
  13. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
  14. Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
  16. Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
  17. Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
  18. Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
  19. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
  20. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
  21. El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
  22. Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
  23. Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. (2011).
  24. Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
  25. Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).

Comments

1 Comment

  1. You suggest that Pre-amplification (pre-amp) step is recommended for samples with 1-350 ng RNA, but what is the minimum amount of miRNA needed not to use pre-amp? (miRNA can be specifically isolated and quantified using small RNA chip from AGILENT).

    Reply
    Posted by: Tannia G.
    September 10, 2013 - 7:15 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics