रक्त और संस्कृति मीडिया से प्राप्त exosomes के शोधन और microRNA रूपरेखा

Biology

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Summary

exosomes में स्थिर (miRNAs) microRNAs की उपस्थिति बायोमार्कर के रूप में और चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए एक मार्ग के रूप में अपनी क्षमता उपयोगिता के लिए, कहनेवाला संचार का एक उपन्यास विधा के रूप में अपार रुचि उत्पन्न की है. यहाँ हम ले जाया जा रहा miRNAs की पहचान करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर द्वारा पीछा रक्त और संस्कृति मीडिया से exosome शुद्धि प्रदर्शित करता है.

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McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294, doi:10.3791/50294 (2013).

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Abstract

Introduction

लघु noncoding miRNAs लक्ष्य mRNA के बंधन से जीन अभिव्यक्ति मिलाना. ~ 7 बेस जोड़े के बीज अनुक्रम पूरक अनुवाद के निषेध में या लक्ष्य 1 प्रोटीन की कमी हुई अभिव्यक्ति में परिणाम कर सकते हैं, जो दोनों की mRNA की स्थिरता में कमी में जिसके परिणामस्वरूप लक्ष्य mRNA के लिए बाध्य करने के लिए miRNA के लिए सक्षम बनाता है. पिछले दशक में अनुसंधान स्पष्ट सेलुलर कार्यों मध्यस्थता में miRNAs के लिए एक मौलिक भूमिका साबित कर दी है. भी विभिन्न रोगों 2,3 अंतर्निहित miRNA मध्यस्थता आणविक परिवर्तन विदारक ओर निर्देशित काफी प्रयास किया गया है. इसके अलावा, शारीरिक तरल पदार्थ 4-6 में स्थिर miRNAs की ही पहचान नैदानिक ​​निदान करने के लिए उत्तरदायी उपन्यास बायोमार्कर के रूप में उनके उपयोग के लिए रास्ता बनाया.

शारीरिक तरल पदार्थ में miRNA परिवहन की एक विधा प्रणालीगत रक्त circulat के माध्यम से प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को exosomes, mRNAs ले कि छोटे फफोले, प्रोटीन, लिपिड मध्यस्थों और miRNAs माध्यम हैआयन 7-14. प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के मॉडुलन में और यह परिणाम सेलुलर संचार का एक उपन्यास तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं वृद्धि कारक β5 (TGFβ5) बदलने, स्रावित और / या ऐसे इंटरल्यूकिन 1β (IL1β), ट्यूमर परिगलन कारक-α (TNFα) के रूप में सूजन में शामिल biomolecules युक्त अवशोषित exosomes द्वारा प्रतिरक्षा नियामक प्रक्रियाओं को व्यवस्थित करना है, और कर सकते हैं इन जीनों में 13 को विनियमित कि miRNAs. न्यायपालिका miRNA अभिव्यक्ति मानव रोगों की एक किस्म में एक आम सुविधा है, इन अणुओं उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्य 2 की खोज और सत्यापन के लिए रोमांचक नए अवसर प्रदान करते हैं.

घूम miRNAs सब शरीर के तरल पदार्थ में मौजूद हैं और यह exosomes की रचना वे जारी किए गए जिसमें से स्रोत कोशिकाओं के आधार पर अलग है कि जाना जाता है. इस प्रकार वे कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति का अध्ययन करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं और कैसे कोशिकाओं को भी संकेत को बदलरोगों सहित तनाव के जवाब में टीएस. Exosome संरचना में परिवर्तन का अध्ययन करने के संकेत पारगमन में अंतर्दृष्टि प्रदान और बायोमार्कर या चिकित्सकीय हस्तक्षेप के मार्गों के रूप में अपनी क्षमता उपयोगिता की जांच कर सकते हैं.

यहाँ हम प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित कई स्रोतों से exosomes की शुद्धि प्रदर्शन करेंगे. इन exosomes exosomes में मौजूद miRNAs के स्तर की पहचान और मापने के लिए qPCR के द्वारा पीछा शाही सेना अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.

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Protocol

मानव और rodents से रक्त के नमूनों का उपयोग करते हुए सभी प्रयोगों सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के साथ अनुपालन में मार डाला गया. मानव विषयों चिकित्सा संस्थागत समीक्षा बोर्ड के Drexel विश्वविद्यालय कॉलेज और पशुओं का उपयोग कर प्रदर्शन के अध्ययन के लिए सभी प्रक्रियाओं है Drexel संस्थागत पशु की देखभाल द्वारा अनुमोदित किया गया और समिति का प्रयोग कर रहे थे द्वारा अनुमोदित के रूप में सूचित सहमति देने के बाद पंजीकृत किए गए.

1. रक्त से exosome शोधन (~ 5.5 घंटे)

टिप्स

  • हम mirVana miRNA के अलगाव किट से 300 μl शाही सेना lysis बफर में रक्त की एक ट्यूब (~ 10 मिलीलीटर मानव रक्त और ~ 2 मिलीलीटर माउस खून) से exosomes resuspend.
  • सेल संस्कृति मीडिया से exosomes को शुद्ध करने के लिए, मीडिया कोशिकाओं को दूर करने के लिए 10 मिनट के लिए 500 XG पर घूमती है और भी 12,000 एक्स जी पर centrifugation के बाद फिल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है. सेल संस्कृति मीडिया से exosome शुद्धिपीबीएस, पीबीएस धोने या दूसरे ultracentrifugation कदम में एक कमजोर पड़ने की आवश्यकता नहीं है.
  • शुद्ध exosomes ultracentrifugation कदम के बाद एक sucrose ढाल centrifugation कदम जोड़ने, प्रोटिओमिक्स पढ़ाई के लिए उपयोग किया जाएगा, तो प्रोटीन समुच्चय और contaminants 15 की मात्रा में कमी होगी.
  • exosomes की मनाया आकारिकी स्रोत और मंदिर के लिए प्रसंस्करण कदम दोनों के आधार पर अलग कर सकते हैं. हम पहले से नमूना प्रसंस्करण 9,15 में मतभेद के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है जो exosomes के कप के आकार का आकारिकी का पालन नहीं किया. Immunogold लेबलिंग सहित हमारे मंदिर छवियों exosomes 9,16,17 व्युत्पन्न पित्त और cortical संस्कृति रक्त, सहित विभिन्न स्रोतों से पिछली रिपोर्टों के समान हैं.
  1. 10-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ईमानदार 5x और जगह खून युक्त EDTA लेपित ट्यूब पलटना.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र 15 मिलीलीटर ट्यूब में ऊपर परत, प्लाज्मा, ले लीजिए और बर्फ पर रख.
  3. पीबीएस के एक बराबर मात्रा के साथ तरल पदार्थ पतला. 4 में 2,000 XG पर 30 मिनट अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर, ट्यूब अपकेंद्रित्र 24 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए 1X पीबीएस जोड़ने, और 12,000 XG पर 45 मिनट अपकेंद्रित्र पर स्थानांतरण
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब ultracentrifuge और 110,000 XG पर 2 घंटा अपकेंद्रित्र पर स्थानांतरण
  6. Resuspend पीबीएस में गोली और 4 डिग्री सेल्सियस से कम 100,000 XG पर 1 घंटा अपकेंद्रित्र
  7. उचित बफर में resuspend गोली (आरएनए lysis बफर).
  8. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण क्रमशः के लिए पीबीएस या RIPA बफर में Resuspend.

2. एक संशोधित mirVana miRNA के अलगाव किट (~ 1 घंटा) का उपयोग आरएनए शोधन

टिप्स

  • , व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहन कर आरएनए अलग RNase जैप के साथ सतहों और pipettes पोंछते, और बाँझ फिल्टर सुझावों और ट्यूबों का उपयोग करने के लिए क्षेत्र तैयार.
  • एक पर स्तंभ DNase उपचार कदम जोड़ना मौजूद हो सकता है कि डीएनए के निशान को हटा. Exosomes की स्रोत पर निर्भर करता है, डीएनए माउस और मानव मस्तूल सेल लाइनों 8 लेकिन गुणसूत्र डीएनए दृश्यों सुसंस्कृत cardiomyocytes 18 की मीडिया से शुद्ध exosomes में पाया गया है सहित कुछ स्रोतों से शुद्ध exosomes में अनुपस्थित होने की सूचना दी गई है.
  • विक्रेता केवल पर्याप्त एक 700 μl इसके लिए समाधान 1 धो प्रदान करता है क्योंकि हम धोने समाधान 1-350 μl (नीचे चरण 2.4) की मात्रा कम हो. मात्रा कम नहीं है, तो पूरे किट सामग्री का उपयोग करने के लिए छोड़ दिया पर्याप्त उपाय नहीं है. बचे हुए चरणों निर्माता की सिफारिशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.
  1. 1/10 वो जोड़ें10 मिनट के लिए बर्फ पर miRNA के homogenate यौगिक (30 μl) और सेते की lume.
  2. एसिड phenol के एक मात्रा के साथ निकालें: प्रारंभिक lysate मात्रा के बराबर क्लोरोफॉर्म. अपकेंद्रित्र और एक ताजा ट्यूब में ऊपरी चरण की वसूली.
  3. 1.25 संस्करणों 100% इथेनॉल (375 μl) जोड़ें. भंवर. कारतूस फिल्टर और 10,000 x जी पर 15 सेकंड अपकेंद्रित्र को लागू करें.
  4. की सिफारिश की मात्रा miRNA धो समाधान 1 (350 μl) के आधे से जोड़ें और 10,000 x जी पर 15 सेकंड अपकेंद्रित्र.
  5. प्रत्येक नमूने के लिए 10 μl DNase 1-70 μl बफर RDD (Qiagen) जोड़ें. स्तंभ के लिए 80 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट सेते हैं.
  6. समाधान 1 धो (350 μl) और 10,000 x जी पर 15 सेकंड अपकेंद्रित्र जोड़ें.
  7. समाधान धो जोड़ें 2/3 (500 μl) और 10,000 x जी पर 15 सेकंड अपकेंद्रित्र. दोहराएँ.
  8. 40 μl 95 के साथ Elute डिग्री सेल्सियस nuclease मुक्त एच 2
  9. शाही सेना की एकाग्रता का निर्धारण और 100 एनजी / μl को शाही सेना पतला.

3. Bloo से exosomes की miRNA रूपरेखाघ TaqMan कम घनत्व सरणी (TLDA) कार्ड (~ 6.5 घंटे) का उपयोग करना

टिप्स

  • , पीपीई पहनने से शाही सेना को अलग RNase जैप के साथ सतहों और pipettes पोंछते, और बाँझ फिल्टर सुझावों और ट्यूबों का उपयोग करने के लिए क्षेत्र तैयार.
  • पूर्व प्रवर्धन (पूर्व amp) कदम 1-350 एनजी शाही सेना (350-1,000 एनजी नमूने सीडीएनए संश्लेषण के बाद पूर्व amp कदम की आवश्यकता नहीं है) के लिए सिफारिश की है. यह आप समान शर्तों के तहत सभी नमूनों का इलाज करना होगा क्योंकि पूर्व amp अपने नमूने के लिए आवश्यक है कि यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. पूर्व amp कदम लागत कहते हैं और सीटी मूल्यों एक कम स्वीकार्य कटौती बंद (32 के बजाय 40) है.
  • यह एक ही दिन में चलाया जा सकता है कि कार्ड की संख्या के आधार पर एक थाली के बजाय पट्टी ट्यूब में सीडीएनए प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए उपयोगी है. यह वही दिन पर कार्रवाई नहीं की जाएगी कि सीडीएनए नमूनों की फ्रीज पिघलना कम कर देंगे.
  • विभिन्न स्रोतों से एकत्र exosomes diffe हैशाही सेना की मात्रा किराया. इस प्रोटोकॉल सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया के लिए 3 μl शाही सेना टेम्पलेट की एक अधिकतम अनुमति देता है. स्रोत पर निर्भर करता है, अलग किया जा सकता है कि exosomal शाही सेना की राशि शायद सीमित. एक ठेठ ऊतक सीडीएनए 3 μl मात्रा में 100 एनजी शाही सेना, मानव रक्त या मानव सेल संस्कृति मीडिया से exosomes से बनाया जाएगा कि पर्याप्त शाही सेना उपज होगा जबकि अक्सर कम आरएनए होते हैं और सीडीएनए कम प्रारंभिक सामग्री से बनाया जाना चाहिए. माउस रक्त exosomes शाही सेना के उच्च स्तर होते हैं और 3 μl में कम से कम 100 एनजी प्राप्त किया जा सकता है.
  1. Megaplex ताल का उपयोग करते हुए शाही सेना शुद्ध से सीडीएनए तैयार करने के लिए ट्रांसक्रिपटेस प्राइमरों (पूल ए और पूल बी microfluidic के कार्ड पर miRNAs करने के लिए प्राइमर होते ऐरे ए और बी) रिवर्स, बर्फ पर प्रतिक्रिया घटकों पिघलना.
  2. लेबल आरटी पूल ए प्राइमर या पूल बी प्राइमरों के साथ प्रतिक्रिया और चार्ट क्रम में घटकों को जोड़ने के लिए दो RNase मुक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों. 2 या अधिक प्रतिक्रियाओं के लिए घटकों की कम से कम एक अतिरिक्त मात्रा जोड़ें या के रूप में टी द्वारा सिफारिश की एक मास्टर मिश्रण बनानेवह विक्रेता.
आरटी प्रतिक्रिया घटक घटक एकाग्रता 1 नमूना के लिए वॉल्यूम (कुल वी / नमूना = 4.5 μl)
Nuclease मुफ्त पानी 0.20 μl
Megaplex आरटी बफर (10X) 1X 0.80 μl
dNTPs (100 मिमी) 4.4 मिमी 0.20 μl
2 MgCl (25 मिमी) 5 मिमी 0.90 μl
RNase एफडीए (20U/μl) 2 यू 0.10 μl
Megaplex आरटी प्राइमर ए या बी (10X) 1X 0.80 μl
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस MultiScribe 75 यू 1.50 μl
  1. ट्यूब उलटें 6 बार और प्रतिशतसंक्षेप rifuge. फिर, पिपेट 4.5 microamp में μl आरटी प्रतिक्रिया मिश्रण 8 ट्यूब स्ट्रिप्स या एक 96 अच्छी तरह microamp ऑप्टिकल प्रतिक्रिया थाली.
  2. शाही सेना के 100 एनजी जोड़ें और DEPC इलाज पानी के साथ 3 μl के लिए मात्रा समायोजित या 3 μl कुल शाही सेना जोड़ने, पिपेट टिप के साथ हलचल, और ट्यूब या थाली मुहर. संक्षेप में स्पिन और 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  3. पीसीआर मशीन में प्रतिक्रिया लोड और (के रूप में एप्लाइड Biosystems Megaplex ताल प्रोटोकॉल द्वारा अनुशंसित) निम्न शर्तों के तहत इसे चलाने:
मंच अस्थायी समय
साइकिल (40x) 16 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
42 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
50 डिग्री सेल्सियस 1 सेकंड
पकड़ 85 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस
  1. -20 डिग्री सेल्सियस (कम से कम एक सप्ताह के लिए अच्छा) पर सीडीएनए स्टोर या एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है, जो पूर्व एम्प कदम जारी है.
  2. बर्फ पर पूल ए और पूल बी के लिए preamp प्राइमरों गला लें और मिश्रण को पलटना. भंवर TaqMan पूर्व एम्प मास्टर मिश्रण और भी बर्फ पर रहते हैं.
  3. 2 या अधिक प्रतिक्रियाओं के लिए घटकों की कम से कम एक अतिरिक्त मात्रा जोड़ने चार्ट का पालन करें या के रूप में विक्रेता द्वारा सिफारिश की एक मास्टर मिश्रण बनाने.
पूर्व एम्प रिएक्शन घटक 1 नमूना के लिए वॉल्यूम
Nuclease मुफ्त पानी 7.5 μl
TaqMan preamp मास्टर मिक्स (2X) 12.5 μl
Megaplex preamp प्राइमर ए या बी (10X) 2.5 μl
  1. पिपेट 2.5 μl आरटी उत्पादों होगासीटी microamp में 8 ट्यूब स्ट्रिप्स या एक 96 अच्छी तरह microamp ऑप्टिकल प्रतिक्रिया थाली और प्रत्येक कुएं में 22.5 μl preamp प्रतिक्रिया मिश्रण बांटना.
  2. बर्फ 5 मिनट पर सेते प्लेट, सील और फिर पीसीआर मशीन में नमूना लोड. निम्नलिखित परिस्थितियों में चलाएँ.
मंच अस्थायी समय
पकड़ 95 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट
पकड़ 55 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
पकड़ 72 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
साइकिल (12x) 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
60 डिग्री सेल्सियस 4 मिनट
पकड़ 99.9 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस
  1. Preamp की प्रतिक्रिया के बाद समाप्त हो, संक्षेप में ट्यूब या थाली अपकेंद्रित्र और फिर एक अच्छी तरह से या ट्यूब के लिए 75 μl 0.1X ते 8.0 पीएच जोड़ें.
  2. सील और मिश्रण और संक्षेप में स्पिन. -20 डिग्री सेल्सियस से कम एक सप्ताह के लिए पतला उत्पाद स्टोर या प्लेट लोड करने के लिए पर जारी है.
  3. बर्फ पर एक RNase मुक्त 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में निम्नलिखित गठबंधन.
घटक 1 कार्ड के लिए वॉल्यूम
TaqMan यूनिवर्सल पीसीआर मास्टर मिक्स, कोई AmpErase UNG (2X) 450 μl
पतला preamp उत्पाद 9 μl
Nuclease मुफ्त पानी 441 μl
  1. मिश्रण और संक्षिप्त अपकेंद्रित्र ट्यूब पलटना. TaqMan MicroRNA ऐरे कार्ड के प्रत्येक बंदरगाह में 100 μl पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण बांटना.
  2. 1 मिनट के लिए कार्ड 2 एक्स 1,000 XG अपकेंद्रित्र. कार्ड सील और एप्लाइड Biosystems मैनुअल और 384 भी TaqMan कम घनत्व ऐरे सेटिंग्स में प्राइमरों के साथ प्रदान की टेम्पलेट का उपयोग कर चला रहे हैं. हम एप्लाइड Biosystems 7900HT फास्ट वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली का उपयोग करें.

4. TaqMan (~ 1.5 घंटे) द्वारा विश्लेषण mRNA

  1. QPCR प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए, चार्ट में आदेश में प्रतिक्रिया घटकों का मिश्रण. सभी नमूनों नॉर्मलाइज़र जीन के रूप में ब्याज के रूप में भी 18S rRNA के जीन के लिए प्राइमर जांच के साथ विश्लेषण किया जाएगा.
TaqMan रिएक्शन घटक 1 नमूना के लिए वॉल्यूम
Nuclease मुफ्त पानी 7 μl (व्यक्ति के नमूने के आधार पर समायोजित)
TaqMan फास्ट मास्टर मिक्स (2X) 10 μl
TaqMan प्राइमर जांच (20x) 1 μl
100 एनजी शाही सेना से सीडीएनए 2 और म्यू, एल (व्यक्ति के नमूने के आधार पर समायोजित)
  1. निर्माता (Biosystems 7900HT फास्ट वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम एप्लाइड) द्वारा सिफारिश के रूप में तेजी से 96 अच्छी तरह से ब्लॉक का उपयोग करते हुए 96 अच्छी तरह से थाली चलाएँ.

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Representative Results

रक्त या सेल संस्कृति मीडिया से exosomes अलग करने के बाद, exosomes की पवित्रता इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) और पश्चिमी धब्बा (आंकड़े 1 ए और 1 बी) द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. हम उन्हें और कई एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा साथ विभिन्न स्रोतों से हमारे exosome तैयारी की पुष्टि की. चित्रा 1 ए exosomes ~ का व्यास 30 -100 एनएम के साथ बरकरार हैं और immunogold लेबलिंग द्वारा CD81 होते पुष्टि है कि ईएम छवियों से पता चलता है. आमतौर पर इस्तेमाल exosomal मार्करों Hsp70 और tetraspannin परिवार ग्लाइकोप्रोटीन CD63, CD81 और CD9 14 हैं. शुद्ध exosomes की अखंडता की पुष्टि करने के बाद, हम चित्रा 1 बी में Hsp70 के लिए पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन किया और मीडिया अकेले (नकारात्मक नियंत्रण) नहीं करता है, जबकि exosomes Hsp70 होते हैं कि पता चला है. Bioanalyzer ट्रेस रॉ सेल संस्कृति मीडिया से अलग exosomes RNAs के एक किस्म के होते हैं पता चलता है, लेकिन पूरे से शाही सेना में विशिष्ट हैं कि ribosomal RNAs के बड़ी मात्रा में शामिल नहीं हैसेल (चित्रा 1C). चित्रा -1 खून से व्युत्पन्न पूरे रक्त और exosomes से mRNA की qPCR विश्लेषण से पता चलता है. हम mirVana miRNA के अलगाव किट का उपयोग ~ 10 मिलीलीटर मानव रक्त से exosomal शाही सेना के 500 एनजी अलग करने में सक्षम हैं. qPCR परिणाम TNFα और संवहनी endothelial वृद्धि कारक एन्कोडिंग mRNAs की उपस्थिति का संकेत एक (VEGFA) के रूप में अच्छी तरह से पूरे रक्त में के रूप में exosomes शुद्ध में.

जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए qPCR के लिए इसके अलावा, कुल शाही सेना भी miRNA रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया गया था. miRNA के TLDA कार्ड संस्करण 3.0 अंतर्जात नियंत्रण आरएनए U6 सहित ~ 758 miRNAs करने के लिए प्राइमर जांच में शामिल है. पूर्व प्रवर्धन कदम के साथ इसके अलावा, विक्रेता एक TLDA कार्ड को चलाने के लिए 30 एनजी शाही सेना की सिफारिश की. यह आमतौर पर माउस खून से शुद्ध उन लोगों की तुलना में कम पैदावार है जो सीरम या मानव रक्त से शुद्ध exosomes से शाही सेना का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है. चित्रा 2 में दिखाया miRNA के विश्लेषण माउस खून से 250 एनजी शाही सेना के साथ प्रदर्शन किया गया थाexosomes और मानव रक्त या मानव महाधमनी endothelial कोशिकाओं (HAOEC) 15-30 एनजी exosomal आरएनए. हमारे परिणाम माउस खून, मानव रक्त exosomes में 209 miRNAs, और मानव सेल संस्कृति मीडिया से exosomes में 199 miRNAs से एकत्र exosomes में 89 miRNAs की उपस्थिति का संकेत मिलता है. छह miRNAs करने के लिए प्रतिनिधि डेटा डेल्टा सीटी कृंतक रक्त के लिए अंतर्जात U6 शाही सेना के लिए सामान्यीकृत मूल्य (2A चित्रा), मानव रक्त (चित्रा 2 बी) और HAOEC सेल संस्कृति मीडिया (चित्रा -2) के रूप में दिखाया गया है. मीर 126 और मीर 200c क्रमशः कृंतक रक्त या HAOEC मीडिया से exosomes में अनुपस्थित थे, जबकि शेष चार miRNAs अलग मात्रा में सभी तीन नमूने में मौजूद हैं. सेल संस्कृति मीडिया से शुद्ध exosomes के सापेक्ष, मीर 223 मानव और कृंतक रक्त के नमूनों से exosomes में उच्च स्तर पर व्यक्त की है.

चित्रा 1
चित्रा 1. ट्रेडफिनansmission इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर), विभिन्न स्रोतों से शुद्ध exosomes का उपयोग कर mRNAs के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और QRT-पीसीआर. माउस रक्त की एक) मंदिर छवि ईएम के लिए 10 एनएम सोने और खरगोश विरोधी CD81 (दाएं) के साथ लेबल, 1% glutaraldehyde (बाएं) या 4% paraformaldehyde में resuspended रॉ सेल व्युत्पन्न exosomes में resuspended और formvar कार्बन लेपित ग्रिड पर देखा exosomes .. माउस रक्त या exosome मुक्त मीडिया से शुद्ध / + exosomes में HSP70 का विश्लेषण (पैमाने बार = 100 एनएम) बी) पश्चिमी विश्लेषण - कुल शाही सेना की रॉ 264.7 murine कोशिकाओं के साथ 24 घंटे ऊष्मायन और RIPA बफर सी में resuspended) Bioanalyzer विश्लेषण एक प्रतिनिधि मानव नियंत्रण से प्राप्त पूरे रक्त और exosomes से शुद्ध कुल शाही सेना TNFα और VEGFA की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था रॉ 264.7 सेल संस्कृति मीडिया डी से निकाली गई exosomes) से शुद्ध. यहां क्लिक करेंबड़ा आंकड़ा देखने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2. Exosomes में पाया miRNA के अंश के सापेक्ष अभिव्यक्ति. दहलीज चक्र (सीटी मूल्य) पीसीआर प्रतिक्रिया और कम सीटी मूल्य में एक व्यक्ति miRNA की एकाग्रता के एक रिश्तेदार को मापने उच्च अभिव्यक्ति इंगित करता है. छह से detectable exosomal miRNAs करने के लिए qPCR के मूल्यों U6 शाही सेना और डेल्टा सीटी मूल्यों तीन स्रोतों से exosomes के लिए रेखांकन किया गया के लिए सामान्यीकृत थे. एक नकारात्मक मूल्य इस आंकड़े में उच्च अभिव्यक्ति इंगित करता है. HAOEC सेल संस्कृति मीडिया (सी) से exosomes नियंत्रण की तुलना में निचले स्तर पर hsa मीर 223 व्यक्त करते हुए कृंतक रक्त (ए) और मानव रक्त से exosomes (बी), नियंत्रण की तुलना में उच्च स्तर पर hsa मीर 223 व्यक्त की. Hsa मीर 226 कृंतक रक्त exosomes से अनुपस्थित था और hsa मीर 200c HAOEC exosomes से अनुपस्थित था.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम रक्त और संस्कृति मीडिया से अंतर centrifugation द्वारा शुद्ध exosomes से miRNAs और mRNAs की मात्रा का ठहराव दिखा. Exosomes उनके मूल पर निर्भर विभिन्न घटकों है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, प्रतिजन प्रस्तुति, इंट्रासेल्युलर संचार, और आरएनए और प्रोटीन 9,11,12,19,20 के हस्तांतरण सहित जैविक कार्यों की एक संख्या में शामिल हैं. आकार और आकृति exosome पवित्रता का एक कारक है, ईएम exosomes की डेटा दिखाने के कागजात की एक संख्या इन vesicles वे निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया पद्धति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्रावित होते हैं जिसमें से स्रोत और इमेजिंग 9 के आधार पर आकार और आकृति विज्ञान में लेकर कर सकते हैं कि संकेत मिलता है , 15. 30-100 एनएम exosomes के लिए स्वीकार कर लिया आकार स्रोत 21,22, कई तरीकों exosomal पवित्रता को मान्य करने के लिए उपयोग किया जाता है कि एक कारण के आधार पर एक बड़ा व्यास के साथ exosomes की एक छोटी सी आबादी भी शामिल है कि एक औसत सीमा है. स्रावित miRNAs कई अपेक्षित featur हैविभिन्न रोगों 2,3,24 के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्य होने के अलावा 23 अच्छा बायोमार्कर की तों. यह शोधन विधि qPCR के द्वारा miRNA रूपरेखा miRNA सामग्री 2 के लिए एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करता है, जबकि शारीरिक तरल पदार्थ की एक किस्म से exosomal सामग्री में अस्थायी जैविक परिवर्तनों को चिह्नित करने के लिए एक noninvasive तरीका प्रदान करता है. 4,500 से अधिक प्रोटीन, 1639 mRNAs, 764 miRNAs और 194 लिपिड exosomes 25 (के साथ संबद्ध करने के लिए जाना जाता है www.exocarta.org ) और कुछ मामलों में, इन biomolecules के स्तर में परिवर्तन पहले से ही रोग राज्यों से जोड़ा गया है. हमारे अध्ययन में, मानव रक्त से शुद्ध exosomes सुसंस्कृत मानव कोशिका लाइनों लेकिन माउस रक्त में पाया exosomal miRNAs से काफी अंतर से मीडिया से शुद्ध exosomes के साथ आम में कई miRNAs था. केवल एक mRNA का लक्ष्य है कि miRNAs के उदाहरण हैं, वहीं कई miRNAs को आंशिक रूप से multip के स्तर को कम करने के लिए कार्यले एक मजबूत शारीरिक प्रतिक्रिया के लिए अग्रणी लक्ष्य. Exosomes में रहते हैं कि mRNA और miRNA दोनों निस्र्पक exosome की मध्यस्थता जानकारी हस्तांतरण और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन मध्यस्थता में miRNAs घूम की भूमिका में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. सूत्रों की एक किस्म से exosomes की शुद्धि और लक्षण वर्णन इन स्रावी vesicles के साथ जुड़े आणविक हस्ताक्षरों की पहचान करने में फायदेमंद होगा.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन रीटा एलन फाउंडेशन अनुदान से seena अजीत को धन के द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों साधन के प्रयोग, वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता के लिए दक्षिण कैरोलिना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेंटर के विश्वविद्यालय से एरिका बालोघ और डॉ. सौमित्र Ghoshroy स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) BD Diagnostics 366643 For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) BD Diagnostics 367841 For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube BD Diagnostics 762165 For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit Ambion AM1561
Acid-Phenol: CHCl3 Ambion 9721G
DNase 1 Qiagen 79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG Applied Biosystems 4326614 For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 Applied Biosystems 4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 Applied Biosystems 4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 Applied Biosystems 4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0 Applied Biosystems 4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0 Applied Biosystems 4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems 4444913
Taqman MicroRNA RT kit Applied Biosystems 4366596
Taqman fast universal PCR master mix Applied Biosystems 4366072 For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe) Applied Biosystems Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) Applied Biosystems Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR Thermo Scientific K1642 For mRNA
HSP70 antibody Abcam ab94368 For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold Sigma G7402 For electron microscopy
Rabbit-anti CD81 Sigma SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.

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References

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Comments

1 Comment

  1. You suggest that Pre-amplification (pre-amp) step is recommended for samples with 1-350 ng RNA, but what is the minimum amount of miRNA needed not to use pre-amp? (miRNA can be specifically isolated and quantified using small RNA chip from AGILENT).

    Reply
    Posted by: Tannia G.
    September 10, 2013 - 7:15 AM

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