혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

Biology

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Summary

exosomes에서 안정 마이크로 RNA (miRNA에)의 존재는 생체로 및 치료 개입에 대한 경로로 자신의 잠재력 유틸리티, 간 커뮤니케이션의 새로운 형태로 엄청난 관심을 생성했습니다. 여기에 우리가 전송되는 miRNA에를 식별하는 정량 PCR에 의해 다음 혈액과 문화 미디어에서 exosome 정화를 보여줍니다.

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McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294, doi:10.3791/50294 (2013).

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Abstract

안정되어있는 miRNA의 모든 체액에 존재하는 어떤 순환의 miRNAs는 exosomes라는 작은 소포에 격리에 의해 분해로부터 보호됩니다. Exosomes는 대상 세포에 RNA와 단백질의 이동의 결과 세포막과 융합 할 수 있습니다. 자신의 생물학적 기능은 면역 반응, 항원 프레 젠 테이션 및 세포 통신을 이용하실 수 있습니다. 혈액을 통해받는 사람 세포에서 유전자 발현을 조절할 수있는 miRNA의 배달 대상의 개입에 대한 새로운 길을 열었습니다. 약물이나 RNA 치료제의 전달을위한 전략을 제공 할뿐 아니라, exosomal 내용은 처리 옵션 및 예후를 결정하는 진단에 도움이 될 수 있습니다 생체 역할을 할 수 있습니다.

여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes는 EXOS을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다관심의 mRNA에 대한 OMAL 마커와 PCR. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다.

이러한 프로토콜은 약물 개입 전후 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생​​리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터는 V 표시miRNA에있는 ariations 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 제시한다.

여기에서 우리는 양적으로 혈액과 세포 배양 배지에서 분비 exosomes에서의 miRNAs 및 메신저 RNAs (mRNA의)를 분석하기위한 절차를 설명합니다. 정제 exosomes의 관심의 mRNA에 대한 exosomal 마커와 PCR을위한 서양 얼룩 분석을 사용하여 특성화 될 것입니다. 투과 전자 현미경 (TEM)과 immunogold 라벨은 exosomal 형태와 무결성을 검증하는 데 사용됩니다. 총 RNA는 우리가 동일한 샘플의 발현 및 miRNA의 모두 공부를 할 수 있도록 이러한 exosomes에서 정화 될 것입니다. Bioanalyzer에 의해 RNA 무결성을 검증 후에, 우리는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드와 그 성적에 대한 유전자 발현 연구를 사용하여 exosomal miRNA의를 식별하는 중간 처리 정량 실시간 PCR (qPCR에)을 수행합니다.

이러한 프로토콜은 exosomal의 miRNAs의 변화를 정량화하는 데 사용할 수있는 전약물 개입 전후 N 환자, 설치류 모델 및 세포 배양 매체. Exosomal 내용으로 인해 원래의 소스와 분비 exosomes 그 세포의 생리적 상태에 따라 다릅니다. 이러한 변화는 세포 시스템이 스트레스 생​​리 교란에 대처하는 방법에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 우리의 대표적인 데이터의 miRNAs의 변화 마우스 혈액, 인간의 혈액과 인간의 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 존재하는 표시

Introduction

짧은 비 암호화의 miRNAs는 대상의 mRNA에 결합하여 유전자 발현을 조절. ~ 7 기본 쌍의 씨앗 시퀀스 보완은 번역의 억제 또는 대상 단백질 1의 감소 표현 될 수 있습니다 둘 다의 mRNA의 안정성 감소의 결과로 대상의 mRNA에 결합하는 miRNA의 수 있습니다. 지난 10 년간 연구 명백하게 세포 기능을 중재에 miRNA에 대한 근본적인 역할을 입증했다. 또한 각종 질병에게 2,3 기본 miRNA의 매개 분자 변화를 해부쪽으로 이동 상당한 노력이 있었다. 또한, 체액 4-6에서 안정 miRNAs는 최근 식별 임상 진단 의무 새로운 바이오 마커 등의 사용에 대한 방법을 용이하게했다.

체액의 miRNA의 전송 모드 하나는 조직의 혈액 circulat를 통해받는 세포에 exosomes, mRNA를 운반 작은 소포, 단백질, 지질 매개체, 그리고 miRNA에 경유이온 7-14. 받는 사람 세포에서 유전자 발현의 변조,이 결과는 세포 통신의 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 예를 들어, 세포 성장 인자-β5 (TGFβ5)를 변환, 분비 및 / 또는 인터루킨-1β (IL1β), 종양 괴사 인자-α (TNFα)와 같은 염증과 관련된 생체 분자를 포함하는 흡수 exosomes가 면역 조절 과정을 조절하고 있습니다 이러한 유전자에게 13 조절하는 miRNA에. 탈선 miRNA의 발현은 인간의 질병의 다양한 일반적인 기능이기 때문에, 이러한 분자는 새로운 치료 표적 (2)의 발견과 검증을위한 새롭고 흥미로운 기회를 제공합니다.

순환의 miRNAs의 모든 체액에 존재하며 그것은 exosomes의 조성이 발매 된에서 원본 셀에 따라 다른 것으로 알려져있다. 따라서 그들은 세포의 생리적 상태를 연구하는 수단을 제공하는 방법과 세포도 신호 alter입니다질병 등 스트레스 님의 질문에 답변 TS. exosome 구성의 변화를 공부하는 것은 신호 전달에 대한 통찰력을 제공하고 생체 또는 치료 적 개입 경로로 자신의 잠재력 유틸리티를 조사 할 수 있습니다.

여기 게시 된 프로토콜에 따라 여러 소스에서 exosomes의 정화를 보여줍니다. 이러한 exosomes는 exosomes에 존재하는 miRNA에의 수준을 파악하고 측정하는 qPCR에 이어 RNA 분리에 사용됩니다.

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Protocol

인간과 설치류의 혈액 샘플을 사용하여 모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되었다. 사람을 대상으로이 약 기관 검토위원회의 드렉 셀 대학과 동물을 사용하여 수행 연구에 대한 모든 절차 드렉의 기관 동물 관리에 의해 승인 및위원회를 사용했다가 승인 한 동의서를 제공 한 후 등록되었습니다.

1. 혈액에서 Exosome 정화 (~ 5.5 시간)

  • 우리는 mirVana의 miRNA의 절연 키트에서 300 μL RNA 용해 버퍼의 혈액 튜브 1 (~ 10 ㎖ 인간의 혈액과 1 ~ 2 ML 마우스 혈액)에서 exosomes를 resuspend을.
  • 세포 배양 매체에서 exosomes을 정화, 미디어 세포를 제거하기 위해 10 분 500 XG에 스핀도 12,000 X g에서 원심 분리 한 후 필터 0.22 μm의를 통해 필터링됩니다. 세포 배양 매체에서 exosome 정화PBS, PBS 세척 또는 제 원심 단계에서 희석이 필요하지 않습니다.
  • 정제 exosomes는 원심 단계 이후 자당 기울기 원심 분리 단계를 추가, 프로테오믹스 연구에 사용되는 경우 단백질 집계 및 오염 물질 (15)의 양을 감소합니다.
  • exosomes의 관찰 형태는 소스와 TEM에 대한 처리 단계 모두에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 이전에 샘플 처리 9,15의 차이에 기인 한 exosomes의 컵 모양의 형태를 관찰하지 않았다. immunogold 라벨 등 우리의 TEM 이미지 exosomes 9,16,17 파생 된 담즙과 대뇌 피질의 문화 혈액 등 서로 다른 소스에서 이전의보고와 비슷합니다.
  1. 10-60 분 동안 실온에서 수직 배와 장소 혈액을 포함 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 코팅 튜브를 반전.
  2. 4 ℃에서 15 분 2,000 XG에 원심 분리기 15 ML 튜브에 꼭대기 층, 플라즈마를 수집하고 얼음에 보관하십시오.
  3. PBS의 동일한 볼륨 액을 희석. 4에서 2,000 XG에서 30 분 원심 분리기 ° C.
  4. 4 ° C.에서 튜브를 원심 분리기 24 ML의 총 볼륨 1X PBS를 추가하고, 12,000 XG에서 45 분 원심 분리로 전송
  5. 4 ° C.에 튜브를 원심 분리기와 110,000 XG에서 2 시간을 원심 분리로 전송
  6. 을 Resuspend PBS의 펠렛과 4 ℃에서 100,000 XG에서 1 시간 원심 분리
  7. 적절한 버퍼를 Resuspend 펠렛 (RNA 용해 버퍼).
  8. 전자 현미경과 서양 얼룩 분석 각각에 대한 PBS 또는 RIPA 버퍼에 resuspend을.

2. 수정 mirVana의 miRNA의 절연 키트 (~ 1 시간)를 사용하여 RNA 정화

  • 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하여 RNA를 분리 RNase의 기력과 표면과 피펫을 닦아, 그리고 살균 필터 팁과 튜브를 사용하기위한 영역을 준비합니다.
  • 에 열 DNase의 처리 단계를 추가하는 것은있을 수있는 DNA의 흔적을 제거합니다. exosomes의 소스에 따라 DNA는 마우스와 인간 비만 세포 라인 8 만 염색체 DNA 서열은 배양 심근 18 미디어에서 정제 exosomes에서 발견 된 등 일부 소스에서 정제 exosomes에없는 것으로보고되었다.
  • 공급 업체는 충분 하나의 700 μl를 추가하기 위해 솔루션 1을 씻으 제공하기 때문에 우리는 세척 용액 1-350 μL (아래 단계 2.4)의 양을 감소. 볼륨이 감소되지 않으면 전체 키트 내용물을 사용하기 위해 남겨 충분한 해결책은 없습니다. 나머지 단계는 제조업체의 권장 사항에 따라 수행 하였다.
  1. 1 / 10 VO 추가10 분 동안 얼음에 miRNA의 균질 첨가제 (30 μL)와 부화의 LUME.
  2. 산성 페놀의 볼륨 추출 초기 해물 양에 해당 클로로포름. 원심과 신선한 튜브 상단 위상을 복구 할 수 있습니다.
  3. 1.25 볼륨을 100 % 에탄올 (375 μL)를 추가합니다. 소용돌이. 카트리지를 필터링하고 10,000 X g에서 15 초 원심 분리에 적용됩니다.
  4. 권장 볼륨 miRNA의 세척 방법 1 (350 μL)의 절반을 추가하고 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기.
  5. 각 샘플에 대해 10 μL DNase의 1-70 μL 버퍼 RDD (Qiagen의)를 추가합니다. 열을 80 μl를 추가하고 실온에서 15 분 알을 품다.
  6. 해결 방법 1을 세척 (350 μL) 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기 추가합니다.
  7. 솔루션을 씻으 추가 2 / 3 (500 μL) 10,000 X g에서 15 초 원심 분리기. 반복합니다.
  8. 40 ㎕의 95 용출 ° C nuclease가없는 H 2 O
  9. RNA의 농도를 결정하고 100 NG / μL로 RNA를 희석.

3. Bloo에서 Exosomes의 miRNA의 프로파일D는 TAQMAN 저밀도 어레이 (TLDA) 카드 (~ 6.5 시간) 사용

  • , PPE를 착용하여 RNA를 분리 RNase의 기력과 표면과 피펫을 닦아, 그리고 살균 필터 팁과 튜브를 사용하기위한 영역을 준비합니다.
  • 프리 앰프 (프리 앰프) 단계는 1-350 NG RNA (350-1,000 NG 샘플의 cDNA 합성 후 프리 앰프 단계가 필요하지 않음)을 권장합니다. 그것은 당신이 동등한 조건 하에서 모든 샘플을 처리해야하기 때문에 프리 앰프는 샘플 필요 여부를 결정하는 것이 중요합니다. 프리 앰프 단계에서 비용을 추가하고의 CT 값은 낮은 허용 컷 오프 (32 대신 40)가있다.
  • 그것은 하루에 실행할 수있는 카드의 수에 따라 접시 대신 스트립 튜브의 cDNA 반응을 준비하는 데 유용합니다. 이 같은 날에 처리되지 않습니다 cDNA를 샘플의 동결 - 해동을 최소화 할 수 있습니다.
  • 서로 다른 소스에서 수집 Exosomes는 diffe가RNA의 양을 임대. 이 프로토콜은 cDNA를 합성 반응에 대한 3 μL RNA 템플릿의 최대 수 있습니다. 소스에 따라 분리 될 수 exosomal RNA의 양이 아마 제한됩니다. 일반적으로 조직의 cDNA은 3 μL 볼륨 100 겨 RNA, 인간의 혈액이나 인간의 세포 배양 매체에서 exosomes 만든 것이라고 충분히 RNA를 얻을 것이지만 종종 작은 RNA를 포함하고 cDNA를이 적은 원료로 만든되어야합니다. 마우스의 혈액 exosomes는 RNA의 높은 수준을 포함​​, 3 μL에서 적어도 100 NG를 얻을 수 있습니다.
  1. Megaplex 풀을 사용하여 RNA를 정제에서 cDNA를 준비하는 것은 효소의 프라이머 (풀과 풀 B 미세 카드에 miRNA에 대한 프라이머를 포함하는 배열 A와 B) 반대로 얼음에 반응 구성 요소를 녹여.
  2. 라벨 RT 풀 프라이머 또는 풀 B 프라이머와 반응 차트 순서로 구성 요소를 추가 두 RNase가없는 1.5 ML 튜브. 2 개 이상의 반응에 대한 구성 요소 중 하나 이상 추가 볼륨을 추가 또는 t가 추천하는 마스터 믹스를 만들그는 공급 업체.
RT 반응 구성 요소 성분 농도 1 샘플 볼륨 (총 V / 샘플 = 4.5 μL)
핵산이없는 물 0.20 μL
Megaplex RT 버퍼 (10X) 1X 0.80 μL
dNTPs (100 밀리미터) 4.4 mM의 0.20 μL
MgCl 2 (25 MM) 5 밀리미터 0.90 μL
RNA 분해 효소 억제제 (20U/μl) 2 U 0.10 μL
Megaplex RT 프라이머 또는 B (10X) 1X 0.80 μL
역전사 효소를 MultiScribe 75 U 1.50 μL
  1. 튜브 반전 6 배 센트간단히 rifuge. 그런 다음, 피펫 4.5 마이크로 암페어에 μL RT 반응 혼합 8 튜브 스트립 또는 96 - 웰 마이크로 암페어 광 반응 플레이트.
  2. RNA 100 NG를 추가하고 DEPC 처리 된 물 3 μL 볼륨을 조절하거나 3 μL 총 RNA를 추가, 피펫 팁 저어, 그리고 튜브 또는 플레이트를 밀봉하십시오. 간단히 스핀, 5 분 동안 얼음에 품어.
  3. PCR 기계에 반응을로드하고 (같은 적용되는 생물계 Megaplex 풀 프로토콜에 의해 권장) 다음과 같은 조건 하에서 실행
단계 온도 시간
사이클 (40X) 16 ° C 2 분
42 ° C 1 분
50 ° C 1 초
보유 85 ° C 5 분
보유 4 ° C
  1. -20 ° C (1 주일 이상 좋은)에서 cDNA를 저장하거나 일주일 동안 저장할 수있는 프리 앰프 단계를 계속합니다.
  2. 얼음에 풀 및 풀 B를위한 전치 증폭기 프라이머를 해동 및 혼합하는 반전. 소용돌이 TAQMAN 프리 앰프 마스터 믹스도 얼음에 보관하십시오.
  3. 2 개 이상의 반응에 대한 구성 요소 중 하나 이상 추가 볼륨을 추가 차트를 수행 또는 공급 업체가 추천하는 마스터 믹스를 확인하십시오.
프리 앰프 반응 구성 요소 1 샘플 볼륨
핵산이없는 물 7.5 μL
TAQMAN 전치 증폭기 마스터 믹스 (2X) 12.5 μL
Megaplex 전치 증폭기 프라이머 또는 B (10X) 2.5 μL
  1. 피펫 2.5 μL RT produ의CT 마이크로 암페어에 8 튜브 스트립 또는 96 - 웰 마이크로 암페어 광 반응 플레이트와 각 우물에 22.5 μL 전치 증폭기 반응 믹스를 분배.
  2. 얼음 5 분에 배양 플레이트를 밀봉 한 후 PCR 기계로 샘플을로드합니다. 다음과 같은 조건에서 실행됩니다.
단계 온도 시간
보유 95 ° C 10 분
보유 55 ° C 2 분
보유 72 ° C 2 분
사이클 (12 배) 95 ° C 15 초
60 ° C 4 분
보유 99.9 ° C 10 분
보유 4 ° C
  1. 프리 앰프 반응이 완료된 후, 간단히 튜브 또는 플레이트를 원심 분리 한 후 각각의 well 또는 튜브에 75 μL 0.1X TE 산도 8.0을 추가합니다.
  2. 밀봉 혼합하고 짧게 스핀. -20 ° C에서 일주일 동안 희석 된 제품을 저장하거나 접시를로드 할에 계속합니다.
  3. 얼음 RNase가없는 1.5 ML 튜브에 다음을 결합합니다.
구성 요소 1 카드의 볼륨
TAQMAN 범용 PCR 마스터 믹스, 아니 AmpErase UNG (2X) 450 μL
희석 프리 앰프 제품 9 μL
핵산이없는 물 441 μL
  1. 혼합하고 간단히 원심 분리 튜브를 반전. 의 TaqMan 마이크로 RNA 배열 카드의 각 포트에 100 ㎕의 PCR 반응 믹스를 분배.
  2. 1 분 카드 2 개 1,000 XG에 원심 분리기. 카드를 봉인하고 응용 Biosystems의 설명서와 384도 TAQMAN 저밀도 어레이 설정에서 프라이머와 함께 제공되는 템플릿을 사용하여 실행합니다. 우리는 적용되는 생물계 7900HT 빠른 실시간 PCR 시스템을 사용합니다.

4. TAQMAN (~ 1.5 시간)으로 분석 mRNA의

  1. qPCR의 반응을 준비하려면 차트의 순서로 반응 구성 요소를 섞는다. 모든 샘플은 노말 유전자와 같은 관심뿐만 아니라, 18S rRNA의의의 유전자에 대한 프라이머 프로브로 분석됩니다.
의 TaqMan 반응 구성 요소 1 샘플 볼륨
핵산이없는 물 7 μL (각 샘플에 따라 조정)
TAQMAN 빠른 마스터 믹스 (2X) 10 μL
의 TaqMan 프라이머 프로브 (20X) 1 μL
100 NG RNA로부터 cDNA를 2 & 무, L (개별 샘플에 따라 조정)
  1. 제조 (바이오 시스템 7900HT 빠른 실시간 PCR 시스템을 적용)에서 권장하는대로 빠른 96도 블록을 사용하여 96 웰 플레이트를 실행합니다.

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Representative Results

혈액이나 세포 배양 매체에서 exosomes를 분리 한 후, exosomes의 순도는 전자 현미경 (EM)와 서양 얼룩 (그림 1A와 1B)에서 테스트 할 수 있습니다. 우리는 EM 여러 항체를 사용하여 서양 얼룩으로 다양한 소스로부터 우리 exosome 준비를 확인했다. 그림 1A는 exosomes는 ~의 직경 30 ~ 100 m로 그대로이며, immunogold 라벨로 CD81를 포함하는 것을 확인 EM 이미지를 보여줍니다. 일반적으로 사용되는 exosomal 마커 Hsp70의 및 tetraspannin 가족 당 단백질 CD63, CD81과 CD9 14아르. 정제 exosomes의 무결성을 확인한 후, 우리는 그림 1B에있는 Hsp70의에 대한 서양 얼룩을 수행하고 미디어를 혼자 (대조군)하지 않지만 exosomes는 Hsp70의 포함 된 것으로 나타났다. Bioanalyzer 추적 RAW 세포 배양 매체에서 격리 exosomes는 RNA를 다양한 포함하는 표시되지만 전체에서 RNA의 전형적인 리보솜 RNA를 다량 포함되어 있지 않습니다세포 (그림 1C). 그림 1D 혈액에서 파생 된 전체 혈액과 exosomes에서의 mRNA의 qPCR 분석을 보여줍니다. 우리는 mirVana의 miRNA의 격리 키트를 사용하여 ~ 10 ㎖ 인간의 혈액에서 exosomal RNA 500 NG를 분리 할 수​​ 있습니다. qPCR의 결과는 TNFα와 혈관 내피 성장 인자 인코딩의 mRNA의 존재를 나타냅니다 (VEGFA)뿐만 아니라 전혈로 exosomes를 정화합니다.

유전자 발현 연구를위한 qPCR에뿐만 아니라, 총 RNA는 miRNA의 프로파일에 대해 사용되었다. miRNA의 TLDA 카드 버전 3.0은 내인성 조절 RNA U6 등 ~ 758 miRNA에 대한 프라이머 프로브를 포함하고 있습니다. 프리 앰프 단계의 추가와 함께, 공급 업체 TLDA 카드를 실행하는 30 NG RNA를 권장합니다. 이는 일반적으로 마우스 혈액에서 정제보다 낮은 수익률이 혈청 인간의 혈액에서 정제 exosomes에서 RNA를 분석하는 데 유용합니다. 그림 2의 miRNA 분석은 마우스 혈액에서 250 NG RNA로 수행되었다exosomes와 인간의 혈액이나 인간의 대동맥 내피 세포 (HAOEC) 15-30 NG exosomal RNA. 우리의 결과는 마우스 혈액, 인간의 혈액 exosomes에있는 209의 miRNAs, 그리고 인간의 세포 배양 배지에서 exosomes에있는 199의 miRNAs에서 수집 exosomes에있는 89의 miRNAs의 존재를 나타냅니다. 여섯 miRNA에 대한 대표적인 데이터는 델타의 CT 짐승의 피에 대한 내생 U6 RNA로 정규화 된 값 (그림 2A), 인간의 혈액 (그림 2B) 및 HAOEC 세포 배양 매체 (그림 2C)로 표시됩니다. 미르 - 126과 미르 - 200C는 각각 설치류 혈액이나 HAOEC 미디어에서 exosomes에없는 동안, 나머지 네의 miRNAs는 다양한 양의 세 가지 시료에 존재한다. 세포 배양 매체에서 정제 exosomes에 비해, 미르-223는 인간과 쥐의 혈액 샘플에서 exosomes의 상위 수준에 표시됩니다.

그림 1
그림 1. TRansmission 전자 현미경 (TEM), 다양한 소스로부터 정제 exosomes를 사용하여 mRNA를위한 서양 얼룩 분석 및 QRT-PCR. 마우스의 혈액) TEM 이미지는 EM을위한 10 nm의 금 토끼 안티 CD81 (오른쪽)으로 표시, 1 % 글루 타르 알데히드 (왼쪽) 또는 4 % 파라 포름 알데히드에 현탁 RAW 세포 파생 된 exosomes에 재현 탁하고 formvar 탄소 코팅 된 그리드에 발견 exosomes .. 마우스 혈액이나 exosome - 무료 미디어에서 정화 + / exosomes에서 HSP70의 분석 (스케일 바 = 100 nm의) B) 서부 분석 - 총 RNA의 RAW 264.7 생쥐 세포와 24 시간 배양과 RIPA 버퍼 C에서부유) Bioanalyzer 분석 대표적인 인간의 통제에서 얻은 전체 혈액과 exosomes에서 정제 된 총 RNA는 TNFα와 VEGFA의 발현 수준을 비교하는 데 사용 된 RAW 264.7 세포 배양 매체 D에서 파생 된 exosomes)에서 정제가. 여기를 클릭하세요더 큰 그림을 볼 수 있습니다.

그림 2
그림 2. exosomes에서 발견 된 miRNA의 분율 상대 식입니다. 임계주기 (CT 값) PCR 반응 및 낮은 CT 값의 개별 miRNA의 농도의 상대 측정하여 높은 발현을 나타냅니다. 여섯 감지 exosomal miRNA에 대한 qPCR의 값은 U6 RNA와 델타의 CT 값은 세 가지 소스로부터 exosomes에 대한 그래프 하였다 정상화되었다. 음수 값은이 그림에서 더 높은 발현을 나타냅니다. HAOEC 세포 배양 매체 (C)에서 exosomes 컨트롤보다 낮은 수준의 HSA - 미르-223를 표명하면서 짐승의 피 (A)과 인간의 혈액에서 Exosomes는 (B), 제어보다 높은 수준의 HSA - 미르-223을 표명했다. HSA - 미르-226은 쥐의 혈액 exosomes 결석 및 HSA - 미르-200C는 HAOEC exosomes 결석했다.

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Discussion

이 프로토콜에서는, 우리는 혈액과 문화 미디어 차등 원심 분리하여 정제 exosomes에서의 miRNAs과의 mRNA의 정량을 보여줍니다. Exosomes는 그들의 기원에 의존 다양한 구성 요소가 면역 반응, 항원 제시 세포 내 통신 및 RNA와 단백질 9,11,12,19,20의 전송을 포함한 생물학적 기능의 숫자에 참여하고 있습니다. 크기와 모양이 exosome 순도의 결정이지만, EM에게 exosomes의 데이터를 표시 논문의 숫자는이 소포는 그들이 고정을 위해 사용되는 방법뿐만 아니라 분비되는 소스 및 영상 9에 따라 크기와 형태에 이르기까지 다양 할 수 있음을 나타냅니다 15. 30-100 ㎚의 exosomes에 허용되는 크기는 소스 21,22, 여러 방법이 exosomal 순도의 유효성을 검사하는 데 사용되는 하나의 이유에 따라 큰 직경 exosomes의 작은 인구를 포함하는 평균 범위입니다. 분비의 miRNAs는 많은 필수 featur있다각종 질병 2,3,24에 대한 잠재적 인 치료 목표 인 이외에 23 좋은 생체 에스. 이 정화 방법은 qPCR에 의한 miRNA의 프로파일은 miRNA의 내용 2의 포괄적 인 개요를 제공하면서 체액의 다양한 exosomal 내용의 시간적 생물학적 변화를 특성화하는 비 침습적 인 방법을 제공합니다. 4,500 단백질, 1,639 mRNA를, 764의 miRNAs와 194 지질 exosomes 25 (와 연결하는 것으로 알려져있다 www.exocarta.org ) 어떤 경우에는, 이러한 생체 분자 수준의 변화가 이미 질병 상태에 연결되어 있습니다. 우리의 연구에서 인간의 혈액에서 정제 된 exosomes는 배양 된 세포주하지만, 마우스 혈액에서 발견 exosomal의 miRNAs에서 유의 한 차이에서 미디어 정제 exosomes와 공통점이 많은 miRNA에 있었다. 하나의 mRNA를 대상으로 miRNA에 대한 예제가 있지만, 대부분의 miRNAs는 부분적으로 multip의 수준을 줄이기 위해 기능르 강한 생리적 반응으로 이끌어 목표로하고있다. exosomes에 상주 발현 및 miRNA의 모두를 특성화 exosome - 중재 정보 전송 및 유전자 발현의 변화를 중재에 miRNAs는 순환의 역할에 고유 한 통찰력을 제공합니다. 다양한 소스에서 exosomes의 정제 및 특성이 분비 소포와 관련된 분자 서명을 식별에 도움이 될 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

이 연구는 리타 알렌 재단 보조금에서 Seena 아지트에 기금에 의해 지원되었다. 저자는 장비 사용, 과학 및 기술 지원을위한 사우스 캐롤라이나 전자 현미경 센터의 대학에서 에리카 Balogh 다음과 박사 Soumitra Ghoshroy을 인정하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) BD Diagnostics 366643 For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) BD Diagnostics 367841 For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube BD Diagnostics 762165 For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit Ambion AM1561
Acid-Phenol: CHCl3 Ambion 9721G
DNase 1 Qiagen 79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG Applied Biosystems 4326614 For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 Applied Biosystems 4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 Applied Biosystems 4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 Applied Biosystems 4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0 Applied Biosystems 4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0 Applied Biosystems 4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems 4444913
Taqman MicroRNA RT kit Applied Biosystems 4366596
Taqman fast universal PCR master mix Applied Biosystems 4366072 For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe) Applied Biosystems Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) Applied Biosystems Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR Thermo Scientific K1642 For mRNA
HSP70 antibody Abcam ab94368 For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold Sigma G7402 For electron microscopy
Rabbit-anti CD81 Sigma SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.

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References

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Comments

1 Comment

  1. You suggest that Pre-amplification (pre-amp) step is recommended for samples with 1-350 ng RNA, but what is the minimum amount of miRNA needed not to use pre-amp? (miRNA can be specifically isolated and quantified using small RNA chip from AGILENT).

    Reply
    Posted by: Tannia G.
    September 10, 2013 - 7:15 AM

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