טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הנוכחות של מיקרו RNA היציב (miRNAs) בexosomes יצרה עניין עצום כמו מצב רומן של תקשורת בין תאית, לשירות שלהם כסמנים ביולוגיים הפוטנציאלי וכנתיב להתערבות טיפולית. כאן אנו מדגימים טיהור exosome מתקשורת והתרבות בדם ואחרי PCR כמו לזהות miRNAs מועברת.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294, doi:10.3791/50294 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

miRNAs יציבה נמצאות בכל נוזלי הגוף וכמה miRNAs מחזור מוגנת מפני השפלה על ידי תפיסה בשלפוחית ​​קטנה בשם exosomes. Exosomes יכול להתמזג עם קרום הפלזמה וכתוצאה מכך ההעברה של רנ"א וחלבונים לתא המטרה. התפקודים הביולוגיים שלהם כוללים תגובה חיסונית, מצגת אנטיגן, ותקשורת תאית. מסירה של miRNAs שיכול לווסת את ביטוי הגנים בתאים המקבלים באמצעות דם פתחה אפיקים חדשים להתערבות היעד. בנוסף מציע אסטרטגיה למשלוח של תרופות או סוכנים טיפוליים RNA, תוכן exosomal יכול לשמש כסמנים ביולוגיים שיכול לסייע באבחון, קביעת אפשרויות טיפול וסיכויי החלמה.

כאן אנו מתארים את הליך ניתוח miRNAs כמותית וRNAs שליח (mRNA) מexosomes המופרש בדם ותרבות תקשורת סלולרי. exosomes המטוהר יהיה מאופיין באמצעות ניתוח כתם מערבי לexosסמני omal וPCR לmRNAs של עניין. מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) וסימון immunogold ישמש כדי לאמת את המורפולוגיה והיושרה exosomal. סך RNA יהיה מטוהר מexosomes אלה כדי להבטיח שאנחנו יכולים ללמוד גם ה-mRNA ומירנה מהמדגם הזהה. לאחר אימות תקינות הרנ"א על ​​ידי Bioanalyzer, נבצענו אמיתי תפוקת כמותית PCR בזמן בינוני (qPCR) כדי לזהות את מירנה exosomal באמצעות מערך TaqMan בצפיפות נמוך (TLDA) כרטיסים ומחקרי ביטוי גנים לתעתיקים של עניין.

פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לכמת את השינויים בmiRNAs exosomal בחולים, מודלים של מכרסמים ותרבות תקשורת סלולרי לפני ואחרי ההתערבות תרופתית. תוכן Exosomal להשתנות בהתאם למקור של המקור ואת התנאים הפיסיולוגיים של תאים המפרישים exosomes. וריאציות אלו יכולות לספק תובנות על אופן בו תאים ומערכות להתמודד עם מתח או הפרעות פיסיולוגיות. הנתונים שלנו מראים היציגים Variations בmiRNAs להציג בexosomes מטוהר מהדם עכבר, דם אדם ותקשורת בתרבות של תאי אדם.

כאן אנו מתארים את הליך ניתוח miRNAs כמותית וRNAs שליח (mRNA) מexosomes המופרש בדם ותרבות תקשורת סלולרי. exosomes המטוהר יהיה מאופיין באמצעות ניתוח כתם מערבי לסמני exosomal וPCR לmRNAs של עניין. מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) וסימון immunogold ישמש כדי לאמת את המורפולוגיה והיושרה exosomal. סך RNA יהיה מטוהר מexosomes אלה כדי להבטיח שאנחנו יכולים ללמוד גם ה-mRNA ומירנה מהמדגם הזהה. לאחר אימות תקינות הרנ"א על ​​ידי Bioanalyzer, נבצענו אמיתי תפוקת כמותית PCR בזמן בינוני (qPCR) כדי לזהות את מירנה exosomal באמצעות מערך TaqMan בצפיפות נמוך (TLDA) כרטיסים ומחקרי ביטוי גנים לתעתיקים של עניין.

פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי לכמת את השינויים בmiRNAs exosomaln חולים, מודלים של מכרסמים ותרבות תקשורת סלולרי לפני ואחרי ההתערבות תרופתית. תוכן Exosomal להשתנות בהתאם למקור של המקור ואת התנאים הפיסיולוגיים של תאים המפרישים exosomes. וריאציות אלו יכולות לספק תובנות על אופן בו תאים ומערכות להתמודד עם מתח או הפרעות פיסיולוגיות. נתונים המייצגים שלנו מראים שינויים בmiRNAs להציג בexosomes מטוהר מהדם עכבר, דם אדם ותקשורת בתרבות תאים האנושית

Introduction

miRNAs noncoding קצר לווסת ביטוי גנים באמצעות הקשירה mRNA היעד. השלמת רצף זרע ~ 7 זוגות בסיסים מאפשרת מירנה להיקשר לmRNA המטרה וכתוצאה מכך העיכוב של תרגום או בירידה ביציבות של ה-mRNA, אשר שניהם יכולים לגרום לירידה בביטוי של חלבון 1 היעד. מחקר בעשור האחרון הוכיח באופן חד משמעי לתפקיד בסיסי miRNAs בתיווך תפקודים תאיים. יש גם מאמץ ניכר מכוון לנתח שינויים מולקולריים העומדים בבסיס תיווך מירנה מחלות שונות 2,3. יתר על כן, זיהוי האחרון של miRNAs יציבה בנוזלי גוף 4-6 סלל את הדרך לשימוש בם כסמנים ביולוגיים חדשניים המתאימים לאבחנה קלינית.

מצב אחד של התחבורה מירנה בנוזלי גוף הוא באמצעות exosomes, שלפוחית ​​קטנה שנושאות mRNAs, חלבונים, שומנים בדם, ומתווכי miRNAs לתאים המקבלים באמצעות circulat דם המערכתייון 7-14. התוצאה הוא אפנון של ביטוי גנים בתאי נמען ומייצגת מנגנון חדשני של תקשורת סלולרית. לדוגמה, תאים יכולים לווסת את התהליכים חיסונית-רגולציה על ידי הפרשת ו / או exosomes קליטת המכיל מולקולות ביולוגיות מעורבות בדלקת כגון אינטרלויקין 1β (IL1β), נמק גידול גורם-α (TNFα) והפך את גורם גדילה-β5 (TGFβ5), ו את miRNAs המווסת את הגנים האלה 13. כביטוי חריג מירנה הוא תכונה נפוצה במגוון רחב של מחלות בבני אדם, מולקולות אלה מציעות הזדמנויות חדשות ומלהיבות עבור הגילוי והאימות של מטרות טיפוליות חדשניות 2.

miRNAs במחזור נמצא בכל נוזלי גוף וזה ידוע שרכב exosomes שונה המבוסס על תאי המקור שממנו הם שוחררו. לכן הם מציעים השדרה כדי ללמוד את המצב הפיזיולוגי של התאים וכיצד תאי אלתר איתות אפילוTS בתגובה ללחץ, כולל מחלות. לימוד שינויים בהרכב exosome יכול לספק תובנה הולכים אותות ולחקור את פוטנציאל השירות שלהם כסמנים ביולוגיים או מסלולי התערבות טיפוליות.

כאן אנו להדגים את טיהור exosomes ממקורות מרובים המבוססים על פרוטוקולים שפורסמו. exosomes אלה ישמש לבידוד RNA אחרי qPCR לזהות ולמדוד את רמות miRNAs בהווה בexosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בשימוש בדגימות דם של בני אדם ומכרסמים הוצאו להורג בעמידה בכל ההנחיות הרלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים. בני אדם נרשמו לאחר שנתן הסכמה מדעת, כפי שאושר על ידי מכללת אוניברסיטת דרקסל של דירקטוריון סקירה מוסדי רפואה ואת כל הנהלים למחקרים שבוצעו באמצעות בעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי של דרקסל ועדה השתמשו.

1. טיהור Exosome מדם (~ 5.5 שעות)

טיפים

  • אנו resuspend exosomes מצינור אחד של דם (~ 10 מיליליטר דם אדם ודם ~ 2 מיליליטר עכבר) ב300 מאגר תמוגה RNA μl מערכת בידוד מירנה mirVana.
  • כדי לטהר exosomes מתרבות תקשורת סלולרי, התקשורת הוא הסתובב במהירות XG 500 במשך 10 דקות כדי להסיר את התאים וגם מסונן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לאחר צנטריפוגה ב 12,000 x גרם. טיהור exosome מתרבות תקשורת סלולריאינו מחייב דילול PBS, לשטוף PBS או צעד ultracentrifugation השני.
  • אם exosomes המטוהר ישמש למחקרי proteomics, והוסיף צעד צנטריפוגה שיפוע סוכרוז אחרי צעד ultracentrifugation יהיה להקטין את כמות אגרגטים חלבון ומזהמים 15.
  • המורפולוגיה הנצפית של exosomes יכולה להשתנות בהתאם למקור והן בשלבי העיבוד עבור TEM. אנו לא צופים את המורפולוגיה בצורת הכוס לexosomes שיוחס בעבר להבדלים בעיבוד מדגם 9,15. תמונות TEM שלנו כוללים תיוג immunogold דומות לדיווחים קודמים ממקורות שונים, כולל דם, מרה ותרבות קליפת המוח נגזרת exosomes 9,16,17.
  1. הפוך צינור מצופה EDTA המכיל דם 5x ומקום זקוף בטמפרטורת חדר למשך 10-60 דקות.
  2. צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. p>
  3. לאסוף את השכבה העליונה, הפלזמה, בצינורות 15 מ"ל ולשמור על קרח.
  4. לדלל נוזל עם נפח שווה של PBS. צנטריפוגה 30 דקות XG ב 2000 ב 4 ° C.
  5. העברה לצנטריפוגה צינורות, להוסיף 1X PBS עבור נפח כולל של 24 מ"ל, וצנטריפוגות 45 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C.
  6. העברה לultracentrifuge צינורות וצנטריפוגות שעה 2 ב 110,000 XG ב 4 ° C.
  7. Resuspend גלולה בPBS ו צנטריפוגות השעה 1 ב100,000 XG ב 4 ° C.
  8. Resuspend גלולה במאגר המתאים (מאגר תמוגה RNA).
  9. Resuspend בPBS או Ripa חיץ למיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח כתם מערבי, בהתאמה.

2. RNA טיהור באמצעות ערכת בידוד מירנה mirVana השתנה (~ 1 שעות)

טיפים

  • הכן את השטח לבידוד RNA על ידי לבישת ציוד מגן אישי (PPE), מנגב את המשטחים וטפטפות עם RNase זאפ, ובאמצעות טיפים סינון סטרילי וצינורות.
  • class = "jove_content"> למרות שהפרוטוקול מהספק נותן את האפשרות של טיהור מירנה בלבד, אנחנו תמיד בודד RNA הכולל בין ה-mRNA ומירנה, כך שאנו יכולים ללמוד מאותו המדגם.
  • הוספת שלב טיפול DNase בטור מסירה עקבות של ה-DNA שעשויה להיות נוכחת. בהתאם למקור של exosomes, ה-DNA כבר דיווח להיעדר בexosomes המטוהר מכמה מקורות, כולל עכבר ושורות תאי פיטום בני 8 אבל רצפי DNA כרומוזומליות זוהו בexosomes מטוהר מתקשורת של cardiomyocytes התרבותי 18.
  • אנחנו הקטנו את היקף הפתרון לשטוף 1 ל -350 μl (שלב 2.4 להלן), כי הספק מספק מספיק רק לשטוף פתרון 1 לתוספת אחת 700 μl. אם הנפח לא מצטמצם אין פתרון מספק יצא לבאמצעות תוכן ערכה שלם. שלבים הנותרים בוצעו על פי המלצות היצרן.
  1. הוסף VO 1/10lume של תוסף מירנה homogenate (30 μl) ולדגור על קרח למשך 10 דקות.
  2. לחלץ עם נפח של חומצת פנול: כלורופורם שווה להיקף lysate הראשוני. צנטריפוגה ולשחזר את השלב העליון בצינור טרי.
  3. הוסף 1.25 כרכי אתנול 100% (375 μl). מערבולת. החל כדי לסנן מחסנית וצנטריפוגות 15 שניות ב10,000 x גרם.
  4. הוסף חצי ממומלץ פתרון לשטוף מירנה נפח 1 (350 μl) ו צנטריפוגות 15 שניות ב10,000 x גרם.
  5. הוסף 10 DNase 1-70 μl חיץ RDD μl (Qiagen) לכל דגימה. הוסף 80 μl לעמודה ודגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר.
  6. הוסף לשטוף פתרון 1 (350 μl) ו צנטריפוגות 15 שניות ב10,000 x גרם.
  7. הוסף לשטוף פתרון 2/3 (500 μl) ו צנטריפוגות 15 שניות ב10,000 x גרם. חזור.
  8. Elute עם 40 μl 95 מעלות צלזיוס nuclease ללא H 2 O.
  9. קבע את הריכוז של רנ"א ולדלל את הרנ"א ל100 ng / μl.

3. פרופיל של מירנה Exosomes מBlooד באמצעות TaqMan צפיפות מערך (TLDA) כרטיסים נמוכים (~ 6.5 שעות)

טיפים

  • הכן את השטח לבידוד RNA על ידי לובש PPE, מנגב את המשטחים וטפטפות עם RNase זאפ, ובאמצעות טיפים סינון סטרילי וצינורות.
  • טרום הגברה צעד (לפני המגבר) מומלץ ל1-350 ng-RNA (350-1,000 דגימות ng אינן דורשות צעד מראש מגבר לאחר סינתזת cDNA). זה חשוב כדי לקבוע אם מראש מגבר הוא הכרחי עבור המדגם שלך, כי אתה חייב לטפל בכל הדגימות בתנאים שווים. צעד מראש מגבר מוסיף עלות ויש להם את ערכי ה-CT מחתך מקובל נמוך יותר (32 במקום 40).
  • כדאי להכין את תגובת cDNA בצינורות רצועה במקום צלחת בהתאם למספר כרטיסים שניתן להפעיל ביום אחד. זה יהיה למזער הקפאת הפשרה של דגימות cDNA שלא יטופלו באותו היום.
  • Exosomes שנאסף ממקורות שונים יש diffeלשכור כמויות של רנ"א. פרוטוקול זה מאפשר למקסימום של 3 תבנית RNA μl לתגובת סינתזת cDNA. בהתאם למקור, כמות של RNA exosomal שניתן לבודד אולי מוגבלת. בעוד רקמות טיפוסי יניבו מספיק RNA שcDNA יהיה עשויים מ100 ng-RNA בנפח 3 μl, exosomes מדם אנושי, או תקשורת תרבות תאים האנושית בדרך כלל מכיל פחות רנ"א וcDNA חייב להיות עשוי מחומר פחות התחלה. exosomes דם העכבר מכיל רמות גבוהות יותר של RNA וניתן להשיג לפחות 100 ng ב3 μl.
  1. כדי להכין cDNA ממטוהרי RNA באמצעות הבריכות קומפלקס ענקיות להפוך פריימרים transcriptase (בריכת וברכה שמכיל פריימרים לmiRNAs על כרטיסי microfluidic מערך B ו-B), להפשיר את מרכיבי תגובה על קרח.
  2. תווית שני צינורות 1.5 מ"ל RNase ללא לתגובת RT עם בריכת פריימרים או primers B בריכת ולהוסיף רכיבים על מנת תרשים. להוסיף נפח נוסף לפחות אחד מהרכיבים עבור 2 או יותר ריאקציות או לעשות תערובת אמן כפי שהומלצה על ידי tהוא ספק.
רכיב תגובת RT ריכוז רכיב נפח למדגם 1 (4.5 = V / המדגם μl)
מים nuclease ללא 0.20 μl
קומפלקס ענקי RT חיץ (10X) 1X 0.80 μl
dNTPs (100 מ"מ) 4.4 מ"מ 0.20 μl
MgCl 2 (25 מ"מ) 5 מ"מ 0.90 μl
RNase מונעי (20U/μl) 2 U 0.10 μl
קומפלקס הענקי RT Primers A או B (10X) 1X 0.80 μl
MultiScribe רברס טרנסקריפטאז 75 U 1.50 μl
  1. להפוך צינורות 6 פעמים והסנאטrifuge לזמן קצר. ואז, פיפטה μl 4.5 תמהיל RT תגובה לMicroAmp רצועות 8-צינור או צלחת תגובה אופטית 96, גם MicroAmp.
  2. הוסף 100 ננוגרם של רנ"א ולהתאים את עוצמת קול עד 3 μl עם מים שטופלו DEPC או להוסיף 3 רנ"א הכל μl, מערבבים עם קצה פיפטה, ולאטום את הצינורות או צלחת. ספין בקצרה ולדגור על קרח למשך 5 דקות.
  3. טען את התגובה למכונה ה-PCR ולהפעיל אותו בתנאים הבאים (כפי שהומלץ על ידי פרוטוקול יישומי Biosystems מגפלקס הבריכות):
שלב טמפ זמן
מחזור (40x) 16 מעלות צלזיוס 2 דקות
42 מעלות צלזיוס 1 דקות
50 מעלות צלזיוס 1 שניות
להחזיק 85 מעלות צלזיוס 5 דקות
להחזיק 4 מעלות צלזיוס
  1. אחסן cDNA ב -20 ° C (טוב למשך שבוע אחד לפחות) או להמשיך לשלב טרום מגבר שיכול להיות מאוחסן במשך שבוע אחד.
  2. הפשירי פריימרים קדם מגבר לברכה וברכה ב 'על קרח ולהפוך לערבב. מערבולת TaqMan טרום Amp מיקס מאסטר ולשמור על קרח גם.
  3. עקוב תרשים הוספת נפח נוסף לפחות אחד מהרכיבים עבור 2 או יותר ריאקציות או לעשות תערובת אמן כפי שהומלצה על ידי הספק.
רכיב תגובה מראש Amp נפח למדגם 1
מים nuclease ללא 7.5 μl
מיקס מאסטר קדם מגבר TaqMan (2X) 12.5 μl
צבעי יסוד קדם מגבר A או B קומפלקס ענקי (10X) 2.5 μl
  1. פיפטה μl 2.5 RT produCT לMicroAmp רצועות 8-צינור או צלחת תגובה אופטית 96, גם MicroAmp ולוותר 22.5 תערובת תגובת קדם מגבר μl לכל אחד.
  2. חותם את הצלחת, דגירה על קרח דק 5 ולאחר מכן לטעון למכונה מדגם ה-PCR. הפעלה בתנאים הבאים.
שלב טמפ זמן
להחזיק 95 מעלות צלזיוס 10 דקות
להחזיק 55 מעלות צלזיוס 2 דקות
להחזיק 72 מעלות צלזיוס 2 דקות
מחזור (12x) 95 מעלות צלזיוס 15 שניות
60 מעלות צלזיוס 4 דקות
להחזיק 99.9 מעלות צלזיוס 10 דקות
להחזיק 4 מעלות צלזיוס
  1. לאחר תגובת קדם המגבר הוא סיים, צנטריפוגות בקצרה את הצינורות או צלחת ולאחר מכן להוסיף 75 0.1X pH TE 8.0 μl היטב כל אחד או צינור.
  2. לאטום ולערבב וספין בקצרה. אחסן את המוצר בדילול המלא בשבוע אחד ב -20 ° C או להמשיך לטעון את הצלחת.
  3. לשלב הבא בצינור RNase ללא 1.5 מ"ל על קרח.
רכיב נפח לכרטיס 1
TaqMan יוניברסל PCR מיקס מאסטר, לא AmpErase UNG (2X) 450 μl
מוצר קדם מגבר בדילול מלא 9 μl
מים nuclease ללא 441 μl
  1. להפוך את הצינור כדי לערבב וצנטריפוגות בקצרה. לוותר על 100 תערובת תגובת PCR μl לכל יציאה של כרטיס מערך MicroRNA TaqMan.
  2. צנטריפוגה XG כרטיס 1,000 x 2 דקות 1. חותם את הכרטיס ולהפעיל אותו באמצעות התבנית מסופקת עם פריימרים ביישומי Biosystems הידני ואת 384 הגדרות מערך צפיפות נמוכות TaqMan כן. אנו משתמשים במערכת יישומי Biosystems 7900HT מהירה בזמן אמת PCR.

4. mRNA ניתוח על ידי TaqMan (~ 1.5 שעות)

  1. כדי להכין תגובת qPCR, לערבב את מרכיבי התגובה בצו בתרשים. כל הדגימות תנותח עם בדיקות פריימר לגן של עניין, כמו גם rRNA 18S כגן מנרמל.
רכיב תגובת TaqMan נפח למדגם 1
מים nuclease ללא 7 μl (להתאים מבוסס על מדגם בודד)
TaqMan מהיר מיקס מאסטר (2X) 10 μl
בדיקות פריימר TaqMan (20x) μl 1
cDNA מ100 ng-RNA 2 & mu, L (להתאים מבוסס על מדגם בודד)
  1. הפעל את הצלחת גם 96 שימוש בבלוק 96 גם המהיר כפי שהומלץ על ידי היצרן (Applied מערכת Real-Time PCR מהיר 7900HT Biosystems).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר בידוד exosomes מתקשורת ותרבות דם או סלולרי, טוהר של exosomes יכול להיבדק על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) וכתם המערבי (האיורים 1A ו-1B). אנחנו אישר הכנות exosome ממקורות שונים עם EM וכתם מערבי באמצעות נוגדנים מרובים. איור 1 א מציג תמונות EM המאשר כי exosomes הם שלמים בקוטר של 30 ננומטר ~ -100 ומכיל CD81 על ידי תיוג immunogold. סמני exosomal נפוצים הם גליקופרוטאינים משפחת HSP70 וtetraspannin CD63, CD81 וCD9 14. לאחר אישור התקינות של exosomes המטוהר, ביצענו כתם מערבי לHsp70 באיור 1, והראיתי כי exosomes מכיל Hsp70 בעוד תקשורת בלבד (בקרה שלילית) לא עושה. Bioanalyzer העקבות מראה כי exosomes מבודד מתרבות תקשורת הסלולרי RAW מכיל מגוון של RNAs, אבל לא מכילות כמויות גדולות של RNAs ריבוזומלי אופייניים ב-RNA מכלתא (איור 1C). 1D איור מראה ניתוח qPCR של mRNA מכל הדם וexosomes נגזרים מהדם. אנחנו הצלחנו לבודד 500 ננוגרם של רנ"א exosomal מ ~ 10 מיליליטר דם אדם באמצעות ערכת בידוד מירנה mirVana. תוצאות qPCR להעיד על הנוכחות של mRNAs קידוד גורם גדילת אנדותל TNFα וכלי דם (VEGFA) במטוהר exosomes כמו גם בדם כולו.

בנוסף לqPCR למחקרי ביטוי גנים, רנ"א הכל היה בשימוש גם עבור פרופיל מירנה. מירנה TLDA כרטיס הגרסה 3.0 מכילים בדיקות פריימר ל~ 758 miRNAs כולל שליטת אנדוגני RNA U6. עם התוספת של השלב טרום ההגברה, הספק ממליץ 30 ng-RNA כדי להפעיל כרטיס TLDA. האפשרות זו שימושית לניתוח RNA מן exosomes מטוהר מהדם או סרום האנושי שיש בדרך כלל תשואות נמוכות יותר מאלה מטוהרים מהדם עכבר. ניתוח מירנה שמוצג באיור 2 בוצע עם 250 ng-RNA מהדם העכברexosomes ו15-30 RNA exosomal ng מדם אנושי או תאי אנדותל אבי העורקים אנושיים (HAOEC). התוצאות שלנו מעידות על הנוכחות של 89 miRNAs בexosomes דם שנאסף מהעכבר, 209 miRNAs בexosomes דם אדם, ו199 miRNAs בexosomes מהתקשורת והתרבות של תאי אדם. נציגי נתונים עבור שש miRNAs מוצגים כערך דלתא Ct מנורמל U6 RNA אנדוגני למכרסם דם (איור 2 א), דם אנושי (איור 2) וHAOEC תא תרבות תקשורת (איור 2 ג). בעוד miR-126 וmiR-200C נעדרו בexosomes מדם מכרסם או מדיה HAOEC בהתאמה, ארבע miRNAs הנותרות נמצאות בכל שלוש הדגימות בכמויות משתנות. יחסית לexosomes מטוהר מתרבות תקשורת סלולרי, miR-223 באו לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר בexosomes מדגימות דם אדם ומכרסם.

איור 1
איור 1. Trמיקרוסקופיה ansmission אלקטרונים (TEM), כתם מערבי ניתוח וqRT-PCR לmRNAs באמצעות exosomes מטוהר ממקורות שונים. תמונה) TEM של דם עכבר exosomes resuspended בglutaraldehyde 1% (משמאל) או exosomes נגזר סלולרי RAW resuspended paraformaldehyde 4%, שכותרתו עם זהב 10 ננומטר וארנב אנטי CD81 (מימין) והבחינה ברשתות פחם מצופים formvar עבור EM . ניתוח (סרגל קנה מידה = 100 ננומטר) ב ') ניתוח המערבי של HSP70 בexosomes מטוהר מעכבר או דם ללא מדיה exosome + / -. דגירה 24 שעות עם 264.7 תאים עכבריים RAW וresuspended במאגר Ripa C) ניתוח Bioanalyzer של רנ"א המוחלט מטוהר מexosomes נגזר מRAW 264.7 תא תרבות התקשורת D) סך RNA מטוהר מכל הדם וexosomes מתקבל משליטת נציג אנושית שימש להשוות את רמות הביטוי של TNFα וVEGFA. לחץ כאןלצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. ביטוי יחסי של כל חלק שנמצא במירנה exosomes. מחזור הסף (CT ערך) הוא מדד יחסי של הריכוז של מירנה פרט בתגובת PCR וערך נמוך יותר מציין CT ביטוי גבוה יותר. ערכי qPCR לשש miRNAs exosomal הגילוי היו מנורמל U6 RNA ואת ערכי ה-CT הדלתא על גרף, לexosomes משלושה מקורות. ערך שלילי מציין ביטוי גבוה בנתון זה. Exosomes מדם מכרסם () ודם אדם (ב ') הביע HSA-miR-223 ברמות גבוהות יותר משליטה, ואילו exosomes מHAOEC תא תרבות התקשורת (C) הביע HSA-miR-223 ברמות נמוכות יותר מאשר שליטה. HSA-miR-226 נעדרו מexosomes דם המכרסמים וHSA-miR-200C נעדר מexosomes HAOEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מראים כימות של miRNAs וmRNAs מexosomes מטוהרים על ידי צנטריפוגה ההפרש מאמצעי תקשורת והתרבות בדם. יש לי Exosomes מרכיבים שונים התלויים מוצאם והם מעורבים במספר תפקודים ביולוגיים, כולל תגובה חיסונית, מצגת אנטיגן, תקשורת תאית, והעברה של רנ"א וחלבונים 9,11,12,19,20. אמנם גודל וצורה הוא הקובע של טוהר exosome, מספר העיתונים המראים א"מ הנתונים מצביע על כך ששלפוחית ​​exosomes אלה יכולים לנוע בגודל ובמורפולוגיה מבוססת על המקור שממנו הם מופרשים כמו גם את השיטה המשמשת לקיבוע וההדמיה 9 , 15. הגודל המקובל לexosomes של 30-100 ננומטר הוא טווח ממוצע הכולל אוכלוסייה קטנה של exosomes עם קוטר גדול יותר בהתאם למקור 21,22, אחת סיבות לכך מספר שיטות המשמשות כדי לאמת את טוהר exosomal. יש לי miRNAs מופרש רבים featur הנדרשתES של סמנים ביולוגיים טובים 23 בנוסף להיותו מטרות טיפוליות פוטנציאליות למחלות שונות 2,3,24. שיטת טיהור זו מספקת דרך לא פולשנית לאפיון שינויים ביולוגיים זמניים בתוכן exosomal ממגוון רחב של נוזלי גוף ואילו אפיון מירנה ידי qPCR מספק סקירה מקיפה של מירנה תוכן 2. מעל 4,500 חלבונים, 1639 mRNAs, 764 miRNAs ו194 שומנים ידועים לקשר עם exosomes 25 (www.exocarta.org) ובמקרים מסוימים, שינויים ברמות של מולקולות ביולוגיות אלה כבר נקשרו למצבי מחלה. במחקרים שלנו, היה לי את exosomes המטוהר מהדם אנושי miRNAs רבות במשותף עם exosomes מטוהר מתקשורת משורות תאים אנושיות בתרבית, אך הבדלים משמעותיים מmiRNAs exosomal נמצאה בדם עכבר. אמנם יש דוגמאות של miRNAs כי היעד אחד בלבד-mRNA, miRNAs רבות לתפקד באופן חלקי כדי להפחית את רמות multipLe מטרות שמוביל לתגובה פיזיולוגית חזקה. אפיון הן mRNA ומירנה שמתגורר בexosomes מספק תובנה ייחודית העברת מידע exosome בתיווך והתפקיד של מחזורי miRNAs בתיווך שינויים בביטוי גנים. טיהור ואפיון של exosomes ממגוון רחב של מקורות יהיו מועילות בזיהוי חתימות מולקולריות הקשורים לשלפוחית ​​הפרשה אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש מחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי קרנות מריטה אלן מענק קרן לSeena אג'יט. המחברים מבקשים להודות אריקה Balogh וד"ר Soumitra Ghoshroy מאוניברסיטת דרום קרוליינה מרכז מיקרוסקופית אלקטרונים לשימוש מכשיר, סיוע מדעי וטכני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) BD Diagnostics 366643 For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) BD Diagnostics 367841 For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube BD Diagnostics 762165 For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit Ambion AM1561
Acid-Phenol: CHCl3 Ambion 9721G
DNase 1 Qiagen 79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG Applied Biosystems 4326614 For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 Applied Biosystems 4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 Applied Biosystems 4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 Applied Biosystems 4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0 Applied Biosystems 4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0 Applied Biosystems 4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems 4444913
Taqman MicroRNA RT kit Applied Biosystems 4366596
Taqman fast universal PCR master mix Applied Biosystems 4366072 For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe) Applied Biosystems Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) Applied Biosystems Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR Thermo Scientific K1642 For mRNA
HSP70 antibody Abcam ab94368 For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold Sigma G7402 For electron microscopy
Rabbit-anti CD81 Sigma SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  2. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  3. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
  4. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
  5. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
  6. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
  7. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
  8. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
  9. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  10. Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
  11. Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. (2011).
  12. Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
  13. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
  14. Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
  16. Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
  17. Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
  18. Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
  19. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
  20. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
  21. El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
  22. Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
  23. Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. (2011).
  24. Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
  25. Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).

Comments

1 Comment

  1. You suggest that Pre-amplification (pre-amp) step is recommended for samples with 1-350 ng RNA, but what is the minimum amount of miRNA needed not to use pre-amp? (miRNA can be specifically isolated and quantified using small RNA chip from AGILENT).

    Reply
    Posted by: Tannia G.
    September 10, 2013 - 7:15 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics