Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294, doi:10.3791/50294 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stabile miRNAs sind in allen Körperflüssigkeiten und einige zirkulierenden miRNAs sind vor dem Abbau durch Sequestrierung in kleine Bläschen genannt exosomes geschützt. Exosomen mit der Plasmamembran, die zur Übertragung von RNA und Proteine ​​an die Zielzelle fusionieren. Ihre biologische Funktionen umfassen Immunantwort Antigenpräsentation und intrazelluläre Kommunikation. Versand von miRNAs die Genexpression in den Empfänger-Zellen über das Blut regulieren kann hat neuartige Wege für die Ziel-Intervention eröffnet. Neben dem Angebot einer Strategie für die Verabreichung von Medikamenten oder RNA Therapeutika können exosomalen Inhalt als Biomarker, die bei der Diagnose helfen, Bestimmung Behandlungsmöglichkeiten und Prognose dienen können.

Hier werden wir das Verfahren für die quantitative Analyse von miRNAs und Boten-RNAs (mRNA) von Exosomen in Blut und Zellkulturmedien abgesondert beschreiben. Gereinigt wird exosomes gekennzeichnet mit Western-Blot-Analyse für exos werdenomal Marker und PCR für mRNAs von Interesse. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunogoldmarkierung wird verwendet, um exosomalen Morphologie und Integrität zu überprüfen. Gesamt-RNA aus diesen Exosomen gereinigt werden, um sicherzustellen, dass wir sowohl mRNA und miRNA aus derselben Probe studieren. Nach der Validierung durch RNA Integrität Bioanalyzer, führen wir einen mittleren Durchsatz quantitative real time PCR (qPCR), um die exosomalen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten und Genexpressionsstudien für Transkripte von Interesse zu identifizieren.

Diese Protokolle können verwendet werden, um Änderungen in exosomalen miRNAs in Patienten, Nagermodellen und Zellkulturmedien vor und nach pharmakologische Intervention zu quantifizieren. Exosomalen Inhalte variieren aufgrund der Quelle des Ursprungs und den physiologischen Bedingungen der Zellen, die Sekretion von Exosomen. Diese Variationen können Einblick darüber, wie Zellen und Systeme mit Stress oder physiologische Störungen bewältigen zu stellen. Unsere repräsentative Daten zeigen variations in miRNAs präsentieren in Exosomen aus Maus-Blut, menschlichem Blut und Zellkulturmedien gereinigt.

Hier werden wir das Verfahren für die quantitative Analyse von miRNAs und Boten-RNAs (mRNA) von Exosomen in Blut und Zellkulturmedien abgesondert beschreiben. Gereinigt wird exosomes gekennzeichnet mit Western-Blot-Analyse für exosomalen Marker und PCR für mRNAs von Interesse sein. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunogoldmarkierung wird verwendet, um exosomalen Morphologie und Integrität zu überprüfen. Gesamt-RNA aus diesen Exosomen gereinigt werden, um sicherzustellen, dass wir sowohl mRNA und miRNA aus derselben Probe studieren. Nach der Validierung durch RNA Integrität Bioanalyzer, führen wir einen mittleren Durchsatz quantitative real time PCR (qPCR), um die exosomalen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten und Genexpressionsstudien für Transkripte von Interesse zu identifizieren.

Diese Protokolle können verwendet werden, um Änderungen in exosomalen miRNAs quantifizieren in Patienten Nagermodellen und Zellkulturmedien vor und nach pharmakologische Intervention. Exosomalen Inhalte variieren aufgrund der Quelle des Ursprungs und den physiologischen Bedingungen der Zellen, die Sekretion von Exosomen. Diese Variationen können Einblick darüber, wie Zellen und Systeme mit Stress oder physiologische Störungen bewältigen zu stellen. Unsere repräsentative Daten zeigen Variationen in miRNAs präsentieren in Exosomen aus Maus-Blut, menschlichem Blut und Zellkulturmedien gereinigt

Introduction

Kurze kodierenden miRNAs die Genexpression durch Bindung an die Ziel-mRNA. Seed Sequenzkomplementarität von ~ 7 Basenpaaren ermöglicht miRNA in die Ziel-mRNA, was zur Inhibierung der Translation oder Verringerung der Stabilität der mRNA, die beide in einer verminderten Expression des Zielproteins 1 Ergebnis binden können. Forschung in den letzten zehn Jahren hat eindeutig eine fundamentale Rolle für miRNAs bei der Vermittlung zellulärer Funktionen bewährt. Es hat auch erhebliche Anstrengungen zur Sezieren miRNA vermittelten molekularen Veränderungen zugrunde liegen verschiedene Krankheiten 2,3 gerichtet. Außerdem ebnete kürzliche Identifizierung von stabilen miRNAs in Körperflüssigkeiten 4-6 den Weg für ihre Verwendung als neue Biomarker zugänglich klinische Diagnose.

Ein Modus von miRNA Transport in Körperflüssigkeiten ist via Exosomen, kleine Bläschen, die mRNAs tragen, Proteine, Lipidmediatoren und miRNAs an Empfänger Zellen über systemische Blut zirkulierendenion 7-14. Dies führt in der Modulation der Genexpression in Zellen des Empfängers und stellt einen neuen Mechanismus der zellulären Kommunikation. Zum Beispiel können Zellen modulieren immun-regulatorischen Prozesse durch Sekretion und / oder absorbierenden exosomes Biomoleküle enthaltenden in Entzündungen wie Interleukin-1β (IL1 &bgr;), Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) beteiligt, transformierender Wachstumsfaktor-β5 (TGFβ5) und die miRNAs, dass diese Gene regulieren 13. Wie aberrante miRNA Expression ist ein gemeinsames Merkmal in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, bieten diese Moleküle spannende neue Möglichkeiten für die Entdeckung und Validierung neuer therapeutischer Targets 2.

Zirkulierende miRNAs sind in allen Körperflüssigkeiten und es ist bekannt, dass die Zusammensetzung der verschiedenen exosomes ist, basierend auf den Source-Zellen, von denen sie gelöst. So bieten sie einen Weg, um den physiologischen Zustand der Zellen zu untersuchen und wie die Zellen zu verändern, auch Signalisierungts in Reaktion auf Stress einschließlich Krankheiten. Studieren Änderungen in exosome Zusammensetzung kann Einblick in die Signaltransduktion stellen und untersuchen ihr Potential als Biomarker Dienstprogramm oder therapeutische Intervention Routen.

Hier zeigen wir Ihnen die Reinigung von Exosomen aus mehreren Quellen auf veröffentlichten Protokollen. Diese exosomes wird für RNA-Isolierung durch qPCR gefolgt zu identifizieren und zu messen, die von miRNAs in den Exosomen verwendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Experimente mit Blutproben von Menschen und Nagetiere wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt. Menschliche Probanden wurden nach der Einwilligung durch den Drexel University College of Medicine Institutional Review Board und allen Verfahren durchgeführten Studien an Tieren wurden von Institutional Animal Care Drexel und benutzen gebilligten eingeschrieben.

1. Exosome Reinigung von Blut (~ 5,5 h)

TIPPS

  • Wir suspendieren exosomes von einem Röhrchen Blut (~ 10 ml menschlichem Blut und ~ 2 ml Blut der Maus) in 300 ul RNA Lysepuffer vom mirVana miRNA Isolation Kit.
  • Um exosomes von Zellkulturmedien zu reinigen, wird das Medium bei 500 × g für 10 min zentrifugiert, um Zellen zu entfernen, und durch einen 0,22 um Filter nach Zentrifugation mit 12.000 x g filtriert. Die exosome Reinigung aus Zellkulturmedienerfordert keine Verdünnung in PBS, das PBS waschen oder die zweite Ultrazentrifugation.
  • Wenn die gereinigten exosomes für Proteomstudien verwendet wird, das Hinzufügen eines Saccharosegradientenzentrifugation Schritt nach der Ultrazentrifugation wird der Anteil der Proteinaggregate und Verunreinigungen 15.
  • Die beobachtete Morphologie exosomes kann sich je nach der Quelle und der Verarbeitungsschritte für TEM. Konnten wir nicht beobachten die schalenförmigen Morphologie für Exosomen, die zuvor auf Unterschiede in Probenaufbereitung 9,15 zugeschrieben. Unsere TEM-Bilder einschließlich der Immunogoldmarkierung sind ähnlich zu früheren Berichten aus verschiedenen Quellen, einschließlich Blut, Galle und kortikalen Kultur abgeleitet exosomes 9,16,17.
  1. Umkehren EDTA beschichtete Röhrchen mit dem Blut und 5x Platz stehend bei Raumtemperatur für 10-60 min.
  2. Zentrifuge bei 2.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Sammeln Sie die obere Schicht, das Plasma, in 15 ml-Röhrchen und halten auf dem Eis.
  3. Verdünnte Flüssigkeit mit einem gleichen Volumen von PBS. Zentrifuge 30 min bei 2.000 xg bei 4 ° C.
  4. Übertragen in Zentrifugenröhrchen, fügen 1X PBS für ein Gesamtvolumen von 24 ml und zentrifugiert 45 min bei 12.000 xg bei 4 ° C.
  5. Transfer zum Röhren Ultrazentrifuge zentrifugiert 2 h bei 110.000 xg bei 4 ° C.
  6. Pellet in PBS und zentrifugieren 1 Stunde bei 100.000 xg bei 4 ° C.
  7. Pellet in geeigneten Puffer (RNA Lysepuffer).
  8. Resuspendieren in PBS oder RIPA Puffer für Elektronenmikroskopie und Western-Blot-Analyse sind.

2. RNA Aufreinigung mithilfe eines modifizierten mirVana miRNA Isolation Kit (~ 1 Stunde)

TIPPS

  • Bereiten Sie den Bereich für die Isolierung von RNA durch das Tragen der persönlichen Schutzausrüstung (PSA), Wischflächen und Pipetten mit RNase Zap und mit sterilen Spitzen mit Filter und Rohre.
  • Hinzufügen eines On-Column-DNase Behandlungsschritt entfernt Spuren von DNA, die vorliegen können. Je nach Quelle der exosomes hat DNA wurde berichtet, dass in exosomes von einigen Quellen einschließlich Maus und Mensch Mastzelllinien 8 aber chromosomale DNA-Sequenzen in exosomes von Medien von kultivierten Kardiomyozyten 18 gereinigt erkannt gereinigt fehlen.
  • Wir reduziert das Volumen der Waschlösung 1 bis 350 ul (Schritt 2.4 unten), weil der Verkäufer liefert nur genug Waschlösung 1 für eine 700 ul hinaus. Wenn das Volumen nicht reduziert wird, gibt es nicht genügend Lösung für die Verwendung der gesamten Inhalte der links. Verbleibenden Schritte wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
  1. In 1/10 volumen von miRNA Homogenat Additive (30 ul) und Inkubation auf Eis für 10 min.
  2. Auszug mit einem Volumen von Säure-Phenol: Chloroform gleich dem anfänglichen Lysat Volumen. Zentrifuge und wieder das obere Phase in ein frisches Röhrchen.
  3. In 1,25 Vol. 100% Ethanol (375 ul). Vortex. Übernehmen, um Patrone filtern und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g.
  4. Fügen Sie die Hälfte der empfohlenen Menge miRNA Waschlösung 1 (350 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g.
  5. In 10 ul DNase 1 bis 70 ul Puffer RDD (Qiagen) für jede Probe. In 80 ul bis Spalte und Inkubation 15 min bei Raumtemperatur.
  6. In Wash Solution 1 (350 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g.
  7. In Wash Solution 2/3 (500 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. Zu wiederholen.
  8. Eluieren mit 40 ul 95 ° C Nuklease-freiem H 2 O.
  9. Bestimmen Sie die Konzentration der RNA und RNA verdünnen bis 100 ng / ul.

3. miRNA Profiling von Exosomen von Blood TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten (~ 6,5 h)

TIPPS

  • Bereiten Sie den Bereich für die Isolierung von RNA durch das Tragen von PSA, Wischflächen und Pipetten mit RNase Zap und mit sterilen Spitzen mit Filter und Rohre.
  • Vorverstärkung (Pre-Amp) Schritt für 1-350 ng RNA (350-1,000 ng Proben erfordern keine Pre-Amp Schritt nach cDNA-Synthese) empfohlen. Es ist wichtig, um festzustellen, ob Pre-Amp, die für Ihre Probe ist, weil man alle Proben unter gleichen Bedingungen behandeln müssen. Pre-Amp-Schritt erhöht die Kosten und die Ct-Werte haben eine geringere akzeptabel abgeschnitten (32 statt 40).
  • Es ist zweckmäßig, die Reaktion in cDNA Streifen Rohre anstelle Vorbereitung einer Platte abhängig von der Anzahl der Karten, die in einem einzigen Tag ausgeführt werden kann. Dies minimiert Gefrier-Tau von cDNA-Proben, die nicht am selben Tag verarbeitet wird.
  • Exosomen aus verschiedenen Quellen gesammelt haben unterschiedmieten RNA-Mengen. Dieses Protokoll ermöglicht ein Maximum von 3 ul RNA-Matrize für die cDNA-Synthese-Reaktion. Je nach Quelle, die Höhe der exosomalen RNA, isoliert werden können vielleicht beschränkt. Während eine typische Gewebe genug wäre, dass RNA-Ausbeute von 100 ng cDNA RNA in 3 ul Volumen Exosomen aus menschlichem Blut oder Zellkulturmedien gemacht werden würde enthalten oft weniger RNA und cDNA müssen aus weniger Ausgangsmaterial hergestellt werden. Maus Blut exosomes einen höheren Gehalt an RNA und mindestens 100 ng in 3 ul erhalten werden kann.
  1. Zur Herstellung von cDNA aus RNA gereinigt mit Megaplex Pools Reverse-Transkriptase-Primer (Pool A und Pool B enthalten Primer für die miRNAs auf mikrofluidischen Karten Array A und B), tauen die Reaktionskomponenten auf Eis.
  2. Label zwei RNase-freies 1,5 ml Röhrchen für RT-Reaktion mit Pool A Primer oder Pool B Primer und Komponenten hinzufügen, um in der Tabelle. Fügen Sie mindestens ein zusätzliches Volumen von Komponenten für 2 oder mehr Reaktionen oder machen einen Master-Mix durch t empfohlener Anbieter.
RT-Reaktion Bauteile Komponente Konzentration Volume 1 Probe (insgesamt V / Probe = 4,5 ul)
Nuklease-freies Wasser 0.20 ul
Megaplex RT-Puffer (10X) 1X 0,80 ul
dNTPs (100 mM) 4.4 mM 0.20 ul
MgCl 2 (25 mM) 5 mM 0,90 ul
RNase Inhibitor (20U/μl) 2 U 0,10 ul
Megaplex RT Primer A oder B (10X) 1X 0,80 ul
MultiScribe Reverse Transkriptase 75 U 1.50 ul
  1. Umkehren Rohre 6 mal und Centrifuge kurz. Dann Pipette 4,5 ul RT-Reaktion Mischung in MicroAmp 8er Strips oder eine 96-Well-Platte MicroAmp optische Reaktion.
  2. In 100 ng RNA und die Lautstärke zu 3 ul mit DEPC behandeltem Wasser oder fügen Sie 3 ul Gesamt-RNA, rühren mit der Pipettenspitze und dichten die Gefäße oder Teller. Spin kurz und Inkubation auf Eis für 5 min.
  3. Legen Sie die Reaktion in der PCR-Maschine und führen Sie es unter den folgenden Bedingungen (wie von der Applied Biosystems Megaplex Pools Protokoll empfohlen):
Bühne Temp Zeit
Zyklus (40x) 16 ° C 2 min
42 ° C 1 min
50 ° C 1 Sek.
Halten 85 ° C 5 min
Halten 4 ° C
  1. Bewahren cDNA bei -20 ° C (gut für mindestens eine Woche) oder weiterhin pre-Amp Schritt, der für eine Woche gespeichert werden können.
  2. Auftauen PreAmp Primer für Pool A und Pool B auf Eis und invertieren zu mischen. Swirl Taqman Pre-Amp Master mischen und halten auf dem Eis auch.
  3. Folgen Sie dem Chart Zugabe von mindestens einem zusätzlichen Volumen von Komponenten für 2 oder mehr Reaktionen oder machen einen Master-Mix als vom Hersteller empfohlen.
Pre-Amp Reaction Bauteile Volume 1 Probe
Nuklease-freies Wasser 7,5 ul
Taqman PreAmp Master Mix (2X) 12,5 ul
Megaplex PreAmp Primer A oder B (10X) 2,5 ul
  1. Pipette 2,5 ul RT product in MicroAmp 8er Strips oder eine 96-Well-Platte MicroAmp optische Reaktion und verzichtet 22,5 ul PreAmp Reaktionsmix in jede Vertiefung.
  2. Verschließen Sie die Platte, auf Eis 5 min inkubieren und laden Sie dann die Probe in der PCR-Maschine. Führen Sie unter den folgenden Bedingungen.
Bühne Temp Zeit
Halten 95 ° C 10 min
Halten 55 ° C 2 min
Halten 72 ° C 2 min
Zyklus (12x) 95 ° C 15 sec
60 ° C 4 min
Halten 99,9 ° C 10 min
Halten 4 ° C
  1. Nachdem die Reaktion beendet Preamp, kurz zentrifugieren oder Platte und fügen Sie dann 75 ul 0,1 X TE pH 8,0 in jede Vertiefung oder Rohr.
  2. Seal und mischen und kurz drehen. Bewahren Sie das verdünnte Produkt für eine Woche bei -20 ° C oder weiter auf die Platte laden.
  3. Kombinieren Sie die folgenden in einem RNase-freies 1,5 ml Röhrchen auf Eis.
Bauteile Volume 1 Karte
Taqman Universal-PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) 450 ul
Das verwässerte Preamp Produkt 9 ul
Nuklease-freies Wasser 441 ul
  1. Kehren Sie die Röhre zu mischen und kurz zentrifugieren. Je 100 ul PCR-Reaktionsmischung in jedem Hafen der TaqMan MicroRNA Array Karte.
  2. Zentrifuge die Karte 2 x 1.000 g für 1 min. Verschließen Sie die Karte und führen Sie es mit der Vorlage mit den Primer in der Applied Biosystems Handbuches und der 384er Taqman Low Density Array-Einstellungen werden zur Verfügung gestellt. Wir verwenden Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time-PCR-System.

4. mRNA-Analyse von TaqMan (~ 1,5 h)

  1. Um qPCR Reaktion vorzubereiten, mischen Sie die Reaktions-Komponenten in der Reihenfolge in der Tabelle. Alle Proben werden mit Primer-Sonden für das Gen von Interesse sowie 18S rRNA-Gen als normalizer analysiert werden.
Taqman Reaction Bauteile Volume 1 Probe
Nuklease-freies Wasser 7 ul (Anpassung auf der Grundlage individueller Probe)
Taqman Schnelle Master Mix (2X) 10 ul
Taqman Primer-Sonden (20x) 1 ul
cDNA von 100 ng RNA 2 & mu; L (Anpassung auf der Grundlage individueller Probe)
  1. Führen Sie die 96-Well-Platte mit der Fast-96-Well-Block, wie vom Hersteller (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System) empfohlen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nach der Trennung von Exosomen aus Blut oder Zellkulturmedien, kann die Reinheit der Exosomen durch Elektronenmikroskopie (EM) und Western-Blot (1A und 1B) getestet werden. Wir bestätigten unsere exosome Präparate aus verschiedenen Quellen mit EM und Western-Blot unter Verwendung mehrerer Antikörper. 1A zeigt EM-Aufnahmen bestätigen, dass exosomes intakt mit einem Durchmesser von ~ 30 -100 nm und enthalten von CD81 Immungoldmarkierung. Häufig verwendete exosomalen Marker sind Hsp70 und tetraspannin Familie Glykoproteine ​​CD63, CD81 und CD9 14. Nach Bestätigung der Integrität der gereinigten exosomes führten wir Western-Blot für Hsp70 in 1B und zeigte, dass exosomes Hsp70 enthalten, während Medium allein (negative Kontrolle) nicht. Die Bioanalyzer Spur zeigt, dass Exosomen von RAW Zellkulturmedien isoliert eine Vielzahl von RNAs enthalten, aber nicht enthalten große Mengen der ribosomalen RNAs, die typisch in RNA aus ganzen sindZelle (Abbildung 1C). 1D zeigt qPCR Analyse der mRNA aus Vollblut und Exosomen aus Blut. Wir sind in der Lage, 500 ng RNA exosomalen von ~ 10 ml menschlichem Blut mit mirVana miRNA Isolation Kit isolieren. Die qPCR Ergebnisse zeigen die Anwesenheit von mRNAs TNFa und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGFA) in gereinigtem exosomes sowie im Vollblut.

Neben qPCR für Genexpressionsstudien wurde Gesamt-RNA auch miRNA verwendet. Die miRNA TLDA card Version 3.0 enthält Primersonden für ~ 758 miRNAs einschließlich der endogenen Kontrolle RNA U6. Mit der Zugabe der Vorverstärkung Schritt empfiehlt der Verkäufer 30 ng RNA, eine TLDA Karte laufen. Dies ist nützlich für die Analyse von RNA aus Exosomen aus Serum oder menschlichem Blut, die haben in der Regel geringere Renditen als die gereinigt von Maus Blut gereinigt. Die miRNA-Analyse in Abbildung 2 gezeigt wurde mit 250 ng RNA aus Maus-Blut durchgeführtExosomen und 15-30 ng exosomalen RNA aus menschlichem Blut oder Endothelzellen (HAOEC). Unsere Ergebnisse weisen auf das Vorhandensein von 89 miRNAs in Exosomen aus Mäuseblut, 209 miRNAs im menschlichen Blut exosomes und 199 miRNAs in Exosomen aus humanen Zellkultur Medien gesammelt. Repräsentative Daten für sechs miRNAs als delta Ct-Wert normalisiert, um die endogene U6 RNA für Nager Blut (2A), menschlichem Blut (2B) und HAOEC Zellkulturmedien (Abbildung 2C) gezeigt. Während miR-126 und miR-200c fehlten in Exosomen von Nagetier Blut oder HAOEC Medien bzw. sind die restlichen vier miRNAs in allen drei Proben in unterschiedlichen Mengen. Relativ exosomes von Zellkulturmedien gereinigt wird miR-223 auf höheren Ebenen in Exosomen aus menschlichen und Nagetier Blutproben ausgedrückt.

Abbildung 1
Abbildung 1. Transmission Elektronenmikroskopie (TEM), Western-Blot-Analyse und qRT-PCR für mRNAs mit Exosomen aus verschiedenen Quellen gereinigt. A) TEM-Bild von Mäuseblut Exosomen in 1% Glutaraldehyd (links) oder RAW Zelle abgeleitet exosomes in 4% Paraformaldehyd resuspendiert resuspendiert, beschriftet mit 10 nm Gold-und Kaninchen-anti CD81 (rechts) und entdeckte auf Formvar Kohlenstoff-Roste für EM . Analyse (Maßstab = 100 nm) B) Western-Analyse von HSP70 in Exosomen aus Maus-Blut oder exosome-freien Medien gereinigt + / -. 24 Stunden Inkubation mit RAW 264.7 murine Zellen gewaschen und in RIPA Puffer C) Bioanalyzer Analyse von Gesamt-RNA gereinigt aus exosomes von RAW 264.7 Zellkulturmedien D abgeleitet) Gesamt-RNA aus Vollblut und Exosomen aus einer repräsentativen menschlichen Kontrolle erhalten gereinigt wurde verwendet, um die Expression von TNF und VEGFA vergleichen. Klicken Sie hierfür eine größere Abbildung zu sehen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Relative Expression von miRNA-Fraktion in Exosomen gefunden. Threshold Cycle (CT-Wert) ist ein relatives Maß für die Konzentration eines einzelnen miRNA in der PCR-Reaktion und unteren CT Wert zeigt eine höhere Expression. qPCR Werte für sechs nachweisbar exosomalen miRNAs wurden U6 RNA und die Delta-Ct-Werte wurden für Exosomen aus drei Quellen grafisch normalisiert. Ein negativer Wert zeigt eine höhere Expression in dieser Figur. Exosomen aus Nagetier Blut (A) und menschlichem Blut (B) ausgedrückt HSA-miR-223 auf höheren Ebenen als Kontrolle, während exosomes von HAOEC Zellkulturmedien (C) ausgedrückt HSA-miR-223 auf einem niedrigeren Niveau als die Kontrolle. Hsa-miR-226 fehlte Nagetier Blut exosomes und HSA-miR-200c fehlte HAOEC exosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In diesem Protokoll, zeigen wir die Quantifizierung von miRNAs und mRNAs von Exosomen durch differentielle Zentrifugation von Blut-und Kulturmedien gereinigt. Exosomen haben diverse Komponenten abhängig von ihren Ursprungs sind und in einer Reihe von biologischen Funktionen, wie Immunreaktion, Antigenpräsentation, intrazelluläre Kommunikation und die Übertragung von RNA und Proteinen 9,11,12,19,20 beteiligt. Während Größe und Form ist eine Determinante der exosome Reinheit, zeigen eine Reihe von Papieren, welche Daten der EM exosomes dass diese Vesikel können in der Größe und Morphologie auf der Grundlage der, aus welcher Quelle sie werden, sowie das Verfahren zur Fixierung verwendet abgesondert und Imaging-Bereich 9 , 15. Die akzeptierte Größe für exosomes von 30-100 nm ist eine mittlere Reichweite, die eine kleine Population von Exosomen mit einem größeren Durchmesser je nach Quelle 21,22, ein Grund, dass mehrere Methoden verwendet werden, um exosomalen Reinheit validieren enthält. Sekretierte miRNAs haben viele erforderliche features von guter Biomarker 23 abgesehen davon, dass potentielle therapeutische Targets für verschiedene Krankheiten 2,3,24. Dieses Reinigungsverfahren bietet eine nicht-invasive Möglichkeit, zeitliche Veränderungen in biologischen exosomalen Inhalte aus einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten charakterisieren während miRNA Profiling durch qPCR bietet einen umfassenden Überblick über miRNA Inhalt 2. Über 4.500 Proteine, 1.639 mRNAs, 764 und 194 miRNAs Lipide sind dafür bekannt, mit Exosomen 25 (assoziieren www.exocarta.org ) und in einigen Fällen, Veränderungen in den Konzentrationen dieser Biomoleküle hat bereits zu Krankheitszuständen in Verbindung gebracht worden. In unseren Studien hatten die Exosomen aus menschlichem Blut gereinigt viele miRNAs gemeinsam mit Exosomen von Medien aus kultivierten humanen Zelllinien, aber signifikante Unterschiede exosomalen miRNAs in Mäuseblut gefunden gereinigt. Zwar gibt es Beispiele von miRNAs, die nur ein Ziel mRNA sind, funktionieren viele miRNAs teilweise zu mindern die Höhe der multiple Ziele führt zu einer starken physiologischen Reaktion. Charakterisierung sowohl mRNA und miRNA, die in exosomes aufzuhalten bietet einen einzigartigen Einblick in exosome-vermittelte Informationen zu übertragen und die Rolle der zirkulierenden miRNAs bei der Vermittlung Veränderungen in der Genexpression. Reinigung und Charakterisierung exosomes von einer Vielzahl von Quellen von Vorteil sein bei der Identifizierung molekularer Signaturen mit diesen sekretorischen Vesikeln assoziiert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Studie wurde durch Mittel aus Rita Allen Foundation Zuschuss für Seena Ajit unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Erika Balogh und Dr. Soumitra Ghoshroy von der University of South Carolina Electron Microscopy Center for Instrument Gebrauch, wissenschaftliche und technische Unterstützung zu bestätigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) BD Diagnostics 366643 For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) BD Diagnostics 367841 For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube BD Diagnostics 762165 For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit Ambion AM1561
Acid-Phenol: CHCl3 Ambion 9721G
DNase 1 Qiagen 79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG Applied Biosystems 4326614 For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 Applied Biosystems 4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 Applied Biosystems 4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 Applied Biosystems 4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0 Applied Biosystems 4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0 Applied Biosystems 4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems 4444913
Taqman MicroRNA RT kit Applied Biosystems 4366596
Taqman fast universal PCR master mix Applied Biosystems 4366072 For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe) Applied Biosystems Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) Applied Biosystems Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR Thermo Scientific K1642 For mRNA
HSP70 antibody Abcam ab94368 For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold Sigma G7402 For electron microscopy
Rabbit-anti CD81 Sigma SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  2. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  3. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
  4. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
  5. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
  6. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
  7. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
  8. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
  9. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  10. Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
  11. Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. (2011).
  12. Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
  13. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
  14. Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
  16. Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
  17. Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
  18. Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
  19. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
  20. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
  21. El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
  22. Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
  23. Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. (2011).
  24. Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
  25. Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).

Comments

1 Comment

  1. You suggest that Pre-amplification (pre-amp) step is recommended for samples with 1-350 ng RNA, but what is the minimum amount of miRNA needed not to use pre-amp? (miRNA can be specifically isolated and quantified using small RNA chip from AGILENT).

    Reply
    Posted by: Tannia G.
    September 10, 2013 - 7:15 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics