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Rapides à haut débit amylose Détermination dans lyophilisé échantillons de pommes de terre de tubercules

Chemistry

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Summary

Ce protocole décrit un procédé colorimétrique haut à travers mettre qui repose sur la formation d'un complexe entre l'iode et les chaînes de molécules de glucose de l'amidon. Iode forme des complexes avec les deux amylose et l'amylopectine dans de longues chaînes. Après l'addition d'iode à un échantillon d'amidon, l'absorption maximale de l'amylose et de l'amylopectine se produit à 620 et 550 nm, respectivement. Le ratio amylose / amylopectine peut être estimé à partir du rapport des valeurs d'absorbance 620 nm et 550 et en les comparant à une courbe standard dans laquelle les concentrations connues spécifiques sont tracées en fonction des valeurs d'absorption. Ce débit élevé, méthode peu coûteuse est fiable et reproductible, permettant l'évaluation des grandes populations de clones de pommes de terre.

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Fajardo, D., Jayanty, S. S., Jansky, S. H. Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples. J. Vis. Exp. (80), e50407, doi:10.3791/50407 (2013).

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Abstract

Ce protocole décrit un procédé colorimétrique haut à travers mettre qui repose sur la formation d'un complexe entre l'iode et les chaînes de molécules de glucose de l'amidon. Iode forme des complexes avec les deux amylose et l'amylopectine dans de longues chaînes. Après l'addition d'iode à un échantillon d'amidon, l'absorption maximale de l'amylose et de l'amylopectine se produit à 620 et 550 nm, respectivement. Le ratio amylose / amylopectine peut être estimé à partir du rapport des valeurs d'absorbance 620 nm et 550 et en les comparant à une courbe standard dans laquelle les concentrations connues spécifiques sont tracées en fonction des valeurs d'absorption. Ce débit élevé, méthode peu coûteuse est fiable et reproductible, permettant l'évaluation des grandes populations de clones de pommes de terre.

Introduction

Environ 80% du poids frais d'un tubercule de pomme de terre est de l'eau; la quasi-totalité de la matière sèche restante est l'amidon 1. La plupart de l'amidon (70%) est composé d'amylopectine, tandis que le reste est de l'amylose. Le rapport entre l'amylose et l'amylopectine est la propriété la plus importante influence sur les propriétés physiques de l'amidon. L'amylose est un alpha 1-4 chaîne linéaire de glucose, tandis que l'amylopectine est un linéaire alpha 1-4 chaîne alpha 1-6 branches 2. Des méthodes telles que la liaison de l'iode, calorimétrie différentielle à balayage (DSC), la Chromatographie d'exclusion stérique haute performance (HPSEC) et les interactions de la concanavaline A a été développée pour la détermination de l'amidon de différentes espèces de plantes cultivées 3,4. Chaque protocole exige des compétences et des équipements spéciaux, ce qui rend difficile à l'échelle à quantifier de nombreux échantillons à la fois. La méthode que nous présentons ici est un protocole modifié à partir de Hovenkamp-Hermelink et al. 5, qui est une longueur d'onde double liaison de l'iodeméthode basée sur les granules d'amidon colorés. Les avantages de ce procédé par rapport à d'autres comprennent la détermination de la teneur en amylose de l'amidon brut sans le purifier et l'utilisation du système à double longueur d'onde pour augmenter la précision de la méthode 4,6.

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Protocol

Une. Détermination de la pomme de terre amylose Tuber amidon

  1. Peler et couper les tubercules frais en petits cubes.
  2. Placez les cubes de pommes de terre dans de petits sacs bruns et stocker pendant une nuit à -80 ° C.
  3. Transfert cubes de pommes de terre dans des sacs de nylon et de lyophilisation.
  4. Après lyophilisé, broyer l'échantillon de pommes de terre en poudre en utilisant un mortier et un pilon ou un broyeur Wiley.
  5. Dans un tube de 50 ml, ajouter 20 à 30 mg de l'échantillon de sol tubercule lyophilisée.
  6. Préparer une solution de 45% (p / v) d'acide perchlorique (mélange 24,4 ml d'acide perchlorique à 60% et 25,6 ml d'eau ultra-pure.
  7. Ajouter 500 ul de 45% (p / v) d'acide perchlorique et secouer ou agiter pour disperser les granules d'amidon.
  8. Après une période d'incubation de quatre minutes à la température ambiante, ajouter 16 ml d'eau ultra-pure à la solution et mélanger au vortex.
  9. Après matériau non soluble a déposé au fond du tube (7-10 min plus tard), transférer 40 pi de la solution sur une plaque de microtitration (éviter le pipetage de toutes les particules).
  10. Ajouter 50 ul de solution d'iode (KI à 2 g + 1 g d'I2 dans 900 ml d'eau ultra-pure) et mélanger l'échantillon par pipettage.
  11. Lire l'absorbance à 550 nm et 620 nm immédiatement.
  12. Déterminer le pourcentage d'amylose après comparaison du rapport amylose / amylopectine de chaque échantillon (620 nm/550 nm l'absorbance) avec une courbe standard générée à partir de solutions d'amylose et d'amylopectine dans une gamme de concentrations. Cette procédure sera maintenant décrit. Lire l'ébauche (solution d'iode et de l'acide perchlorique) en même temps que les échantillons d'essai. Utilisation blanchi données pour les analyses.

2. Amylose / amylopectine Curve

  1. Dans des tubes séparés pèsent 12,5 mg de l'amylose et de l'amylopectine 12,5 mg.
  2. Ajouter à chaque tube 5 ml de 45% (p / v) d'acide perchlorique et se dissoudre complètement.
  3. Pour chacune des solutions (amylose et amylopectine), amener à un volume final de 50 ml avec de l'eau ultra-pure.
  4. Mélanger 6,25ml de stock amylose de l'étape précédente avec 18,75 ml d'eau ultra-pure. Cela fera une solution d'amylose 6,25 mg / ml.
  5. Répétez la procédure pour la solution de l'amylopectine.
  6. Utilisation de l'amylose et des solutions standard de l'amylopectine à partir des étapes 2,4 et 2,5, préparer des normes de teneur en amylose de 0 à 100 pour cent qui sont des% d'amylose (100-0% d'amylopectine) à un volume final de 5 ml pour créer la courbe d'étalonnage à des intervalles de 10%.
    Par exemple, pour préparer:
    L'amylose / 100% d'amylopectine-type de 0%, une pipette 5 ml de solution d'amylopectine.
    L'amylose / 90% d'amylopectine norme de 10%, mélanger 0,5 ml 4,5 ml d'amylose et d'amylopectine solutions.
    L'amylose / 80% d'amylopectine norme de 20%, mélanger 1,0 ml 4,0 ml d'amylose et d'amylopectine solutions.
    L'amylose / 70% de la norme de 30% d'amylopectine, de l'amylose combiner 1,5 ml et 3,5 ml des solutions d'amylopectine.
    L'amylose / 60% de la norme de 40% d'amylopectine, de l'amylose combiner 2,0 ml et 2,0 ml des solutions d'amylopectine.
    Le 50% d'amylose/ 50% d'amylopectine norme, mélanger 2,5 ml 2,5 ml d'amylose et d'amylopectine solutions.
    L'amylose / 40% de la norme de 60% d'amylopectine, de l'amylose combiner 3,0 ml et 2,0 ml d'amylopectine, et ainsi de suite).
  7. Transférer 40 pl de chaque mélange standard à une plaque de microtitration. Inclure un puits avec 40 ul de 45% (p / v) d'acide perchlorique le vide.
  8. Ajouter 50 ul de solution d'iode (KI à 2 g + 1 g d'I2 dans 900 ml d'eau ultra-pure) et mélanger chacun des échantillons (y compris le blanc) par pipetage.
  9. Lire les absorbances à 550 nm et 620 nm immédiatement et calculer le rapport amylose / amylopectine pour chaque concentration.

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Representative Results

La courbe d'étalonnage construite à partir des données masquées de différentes solutions de concentration amylose / amylopectine montre ratios d'absorbance approximatif allant de 0,7 à 1,6 (Tableau 1). Une ligne de tendance de régression linéaire à partir de ces données sont ensuite utilisées pour déduire la teneur en amylose dans lyophilisés échantillons de pommes de terre (figure 1).

L'environnement de production de l'usine a un certain effet sur ​​la teneur en amylose dans le tubercule de pomme de terre 7. Répliquées détermination de la teneur en amylose dans deux emplacements distincts sur le terrain ont montré une faible variation entre les tubercules de pomme de terre (tableau 2). Pigments dans les pommes de terre à chair de couleur ne semble pas affecter l'essai de détermination de la teneur en amylose.

% Solution amylose 1 550 nm l'absorbance 620 nm l'absorbance Ratio 2 620 nm nm/550
0 0,223 0,156 0.700
10 0,225 0,181 0.804
20 0,221 0,203 0,919
30 0.220 0,219 0,995
40 0,223 0,246 1.103
60 0,216 0.280 1.296
70 0,231 0,319 1.381
90 0,225 0.347 1.542
100 0,219 0,357 1.630

Tableau 1. Relation entre la concentration en amylose et le rapport de l'absorbance (620 nm/550 nm). Pourcentage de densité optique pour cent par rapport à l'amylose est tracée sur la figure 1 </ Strong> pour amylose détermination 1. solution d'amylose en pourcentage a été faite à partir de l'amylose et de solutions d'amylopectine à différentes concentrations 2. Ratio calculé à partir des données masquées absorbances à 620 nm et 550 nm.

Cultivar Loc 550 nm 620 nm Rapport Amylose%
Adirondack Blue 1 1,86 1,78 0,955 25,5
2 2.28 2.15 0,946 24,4
Early Rose 1 2.17 2.12 0,977 27,8
2 2.22 2.14 0,967 26,7
FreEdom Russet 1 1.99 1,92 0,965 26,5
2 1,98 1,93 0,973 27,4
Inca Gold 1 1.95 2.00 1.021 32,6
2 2.27 2.28 1.004 30,7
Ranger Russet 1 1,88 1,84 0,975 27,6
2 2.15 2.08 0,967 26,7
Russet Norkotah 1 1,84 1,79 0.972 27,3
2 1.90 1,86 0,975 27,6
Snowden 1 2.23 2.13 0,956 25,5
2 1,64 1,61 0,979 28,0
Pearl White 1 2.32 2.28 0,986 28,7
2 2.22 2.18 0.983 28,5

Tableau 2. Évaluation répliqué de la teneur en amylose dans les cultivars de pommes de terre provenant de deux sites de production de champ différentes (Loc).

Figure 1
Figure 1. Courbe étalon de la concentration d'amylose utilisée pour déduire la teneur en amylose pour cent dans les tubercules de pomme de terre.

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Discussion

La teneur en amylose dans les tubercules de pomme de terre est généralement comprise entre 20-35% 7,8. Si la plupart des valeurs sont en dehors de cette gamme, tenir compte de ces erreurs possibles: 1) les données brutes ont été utilisés à la place des données masquées pour la construction de la courbe standard amylose / amylopectine; 2) les données brutes ont été utilisés à la place des données masquées pour la détermination de la teneur en amylose ratios / amylopectine à partir des échantillons de pommes de terre, ou 3) l'eau utilisée pour l'analyse n'était pas suffisamment pur. Nous avons remarqué que, en utilisant de l'eau distillée et de l'eau ultra-pure pas dans l'analyse, les valeurs obtenues sont pas reproductibles. Un moyen facile de vérifier que la solution d'iode est préparée correctement ou s'il est encore trop vieux pour être utilisée consiste à vérifier si la valeur d'absorbance brute de l'échantillon à blanc à 550 nm est d'environ 0,1.

La précision dans la préparation de l'iode et les solutions d'amylopectine / amylose est essentiel pour obtenir des déterminations de teneur en amylose fiables. Puisque nous cherchons à déterminer la proportion de amyperdre le contenu plutôt que la quantité exacte d'amylose dans l'amidon de pomme de terre, il n'y a aucune étape de purification pour l'isolement de l'amidon pur à partir de la poudre de pomme de terre, tel que présenté par d'autres méthodes de détermination.

Pour la détermination de la teneur en amylose dans les cultivars de pommes de terre, deux tubercules indépendants lyophilisées de chaque cultivar ont été traitées à chaque localité. Nous avons constaté que la variation de la teneur en amylose entre les tubercules de pommes de terre était petite (moins de un point de pourcentage) et non significative.

Il n'y avait pas de différence dans la détermination de la teneur en amylose en raison de la quantité initiale de pomme de terre, entre 20-30 mg. En dehors de cette plage, les résultats sont devenus peu fiables ou indétectable par notre lecteur de plaque. Même si Hovenkamp-Hermelink et al. 5 suggèrent l'ajout d'un volume d'eau si l'échantillon est trop concentré, nous recommandons une nouvelle pesée de l'échantillon et de répéter la procédure.

Cette prese d'étudedonnées nts basés sur les pommes de terre à chair blanche. En outre, nous avons évalué cette méthode avec des pommes de terre à chair de couleur (jaune, rouge et violet). Aucune interférence avec le complexe iode / amylose a été détectée. Cependant, comme avec n'importe quel essai de liaison de l'iode, la proportion d'amylose est susceptible d'être légèrement surestimé en raison de la fixation de l'iode à chaînes droites dans les molécules d'amylopectine. Ce test a pour but de criblage de grands nombres d'échantillons. Une fois les personnes riches en amylose sont identifiés, nous vous recommandons de refaire le test avec un test spécifique de l'amylose, comme la concanavaline A 9,10. Ce dosage est plus coûteux et de main-d'oeuvre que l'essai de liaison de l'iode, mais il détermine plus précisément les niveaux d'amylose.

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Disclosures

Nous n'avons rien à communiquer.

Acknowledgements

Le financement de cette recherche a été assuré en partie par le Comité des cultures de matériel génétique USDA programme et associé de recherche de l'USDA-ARS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Amylose Sigma 859656
Amylopectin Sigma A8515
Perchloric Acid 60% Sigma 311413 Very hazardous to skin and eyes
Iodine Sigma 23214TD
Potassium iodide Sigma 08625JE
Equipment
Plate Reader Bio Tek ELx800

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References

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