Метаболический Маркировка лейцина Rich Повторите киназ 1 и 2 с радиоактивными фосфат

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные белки, которые кодируют как GTPase и киназные домены и которые фосфорилируется в клетках. Здесь мы приводим протокол маркировать LRRK1 и LRRK2 в клетках с 32 P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения их общий уровень сотовой phophorylation.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Taymans, J. M., Gao, F., Baekelandt, V. Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate. J. Vis. Exp. (79), e50523, doi:10.3791/50523 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются паралоги, которые разделяют подобную организацию домена, в том числе серин-треонин домена киназы, в Ras из комплексной области белков (РПЦ), С-терминала РПЦ домена (COR), и лейцин-богатый и анкириновых, как повторяется на N-конце. Точные сотовой роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации 1,2, в то время как LRRK2 вовлечен в патогенез болезни Паркинсона 3,4. В этом отчете мы приводим протокол маркировать белки LRRK1 и LRRK2 в клетках с 32 P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения общего уровня фосфорилирования этих 2 белков в клетках. Короче говоря, близость отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками после лишь немногиеч инкубации и все молекулы в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Через аффинной метки (3xflag) в LRRK белки изолированы от других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс. Протокол может быть легко адаптированы дл контрол фосфорилирование любой другой белок, который может быть выражено в клетках и изолированных с помощью иммунопреципитации.

Introduction

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные паралоги, которые разделяют подобную организацию домена. Оба белка кодирования последовательность GTPase сродни семьи Рас из GTPases (Ras сложных белков, или РПЦ), а также С-концу РПЦ домена (COR), эффективно классификации оба белка в семье 5,6 ROCO белка. N-терминал доменного тандеме РПЦ-COR, оба белка кодировать лейцин-богатый повтор домен, а также в анкириновых-подобный домен, в то время как только LRRK2 кодирует дополнительный броненосца Domein 6-8. С-конец РПЦ-COR, оба белка поделиться домен киназы серин-треонин в то время как только LRRK2 кодирует домен WD40 в С-концевой области 8. Точные сотовые роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации 1,2, в то время как генетическая данные указывают на роли LRRK2 в патогенезе болезни Паркинсона 3,4.

9-11. Хотя LRRK1 сотовой сайты фосфорилирования до сих пор не отображается, данные исследований с использованием фосфопротеин окрашивание блотов иммунопреципитации белка LRRK1 от COS7 клеток показывает, что LRRK1 белок фосфорилируется в клетках 12.

Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с 32 P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK PROTEмодули выражены в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками только после нескольких часов инкубации и всех молекул в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Аффинная метка (3xflag) используется для изоляции LRRK белки из других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Настоящий протокол использует радиоактивный 32 P-меченых ортофосфат следовать сотовой фосфорилирования LRRK2. Важно иметь в виду, что все операции с радиоактивными реагентами должны быть выполнены с использованием соответствующих защитных мер для минимизации воздействия радиоактивного излучения на оператора и окружающей среды. Соединения, содержащие изотопы, излучающие ионизирующее излучение может быть вредным для здоровья человека и строгой лицензирования и правил в институциональной и национального контроля над уровнем их использования. Эксперименты в этом протоколе были проведены после обучения в использовании с открытым исходным кодом излучения на Католического университета Левена (КУ Левен) и следуя хорошие руководящие принципы лабораторной практике, предоставляемые отделом здоровья, безопасности и окружающей среды в университете. Несколько шагов в нашем протоколе широко используются, например, клеточных культур, SDS-PAGE, вестерн-блоттинга и с учетом вот детали протокола как это применяется в нашей лаборатории. Он сhould отметить, что точные экспериментальные условия различаются в зависимости от лаборатории к лаборатории, поэтому конкретные меры по обеспечению надлежащего обращения радиоактивных материалов должны быть адаптированы к каждой новой лабораторных условиях.

Использование с открытым исходным кодом излучения подлежит предварительному утверждению регламента и регулирующий орган отвечает за открытым исходным кодом излучения в лабораторных исследованиях варьируется от страны к стране. Пользователи должны проконсультироваться со своим институциональной офицера радиационной безопасности для того, чтобы гарантировать, что процедура соответствовать местным правилам и положениям. Информация о регулирующих органов можно найти: в Бельгии, Федерального агентства по ядерному контролю ( http://www.fanc.fgov.be , сайт на французском или голландском), в Соединенном Королевстве, здравоохранения и безопасности ( HTTP: / / www.hse.gov.uk / излучение / ионизирующего / index.htm ), в Соединенных Штатах NucКомиссия Лир регулированию ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), в Канаде Канадская комиссия по ядерной безопасности ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), и в Германии Das Ведомства für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Меры предосторожности, относящиеся к этому протоколу были отмечены в тексте, выделены радиоактивных символ трилистника ( Рад Символ ).

1. Метаболический Маркировка клеток

  1. Подготовка клетки для маркировки.
    1. Линии Культура HEK293T клеток в соответствии со стандартными условиями культивирования (37 ° С, 5% СО 2) в DMEM с 8% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина.
    2. Развернуть клетки достаточно, чтобыполучения по меньшей мере 1 × 10 6 клеток на образец для тестирования.
    3. Trypsinize клетки и пластины из в 6-луночные планшеты (диаметр 35 мм) на 10 6 клеток / лунку.
    4. 24 часа в сутки после посева из клетки, выразить 3xflag-LRRK2 белок через трансфекции или лентивирусный вектора опосредованной трансдукции.
      1. Для трансфекции смешивать в образце 4 мкг ДНК (pCHMWS-3xflag-LRRK2 плазмида 13-15 или pCHMWS-3xflag-LRRK1 плазмида 15) и 8 мкл линейного полиэтиленимина (PEI линейный, 1 мг / мл) в 80 мкл DMEM (без добавок ). Позвольте комплекса в течение 15-30 мин, затем добавить комплекс в клетки путем смешивания хорошо в средней настоящее время.
      2. Для лентивирусным вектора опосредованной трансдукции, развести лентивирусов вектор, кодирующий 3xflag-LRRK1 или -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, как правило, преобразовывать в два раза больше единиц преобразующих, т.е. число функциональных векторных частиц, из lentivector как есть клетки) в культуральную среду. Описание продукта ион LV-3xflag-LRRK1 / 2, была описана ранее 15.
    5. Когда клетки 80-100% сливной (около 48 ч после трансфекции или трансдукции), промыть клетки с предварительно нагретого (37 ° C) DMEM без фосфатов.
  2. Этикетка клетки с 32 P-орто-фосфата.
    1. Имейте в виду общие принципы безопасности при работе с излучением.
      1. Рад Символ Все операции с 32 P в назначенный район излучения.
      2. Рад Символ Подходит индивидуальной защиты следует носить - под стандартной процедурой в нашей лаборатории они включают халат, двойные перчатки и защитные очки.
      3. г "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Вся работа с 32 Р должны быть защищены от пользователей на 6 экранах мм Perspex сведения к минимуму воздействия.
      4. Рад Символ Средства личной мониторинга должны всегда использоваться - в Куала Лумпур сертифицированы пользователь с открытым исходным кодом излучение носит фильм значок, прикрепленный к нагрудном кармане халата для контроля радиационного облучения в ходе экспериментов.
      5. Рад Символ Все экспериментальные поверхности должны быть осмотрены на предмет радиоактивности до и после использования с счетчиком Гейгера.
      6. Рад Символ Все потенциально зараженные расходные следует утилизировать в строгом соответствии с ведомственным руководящим принципам для РАdioactive утилизации отходов.
    2. Под ламинарного потока, подготовить трубки сокола с 2,1 мл DMEM без фосфатов (нагретого до 37 ° С) в 6-луночный планшет клеток к этикетке.
      1. Например, для обозначения клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, готовят 12,6 мл среды (= 6 х 2,1). Это необходимо для обеспечения 2 мл среды для использования в 6-луночный планшет скважины клеток с 5% избытком объема.
    3. Рад Символ Подготовьте скамейку, на которой будет выполняться эксперименты с ионизирующим излучением. Рабочее пространство покрыта разлива мата, на котором защитный вкладыш из впитывающего материала помещают. В случае, если вы используете лайнер с одним водонепроницаемой поверхности, поместите его с поглощающей стороной вверх.
    4. Рад Символ Также предусматриваетсябаночка плексигласа на рабочее место и место трубку фосфатного среде без в нем.
    5. Рад Символ Возьмите картонных контейнерах ведущую с флакона 32 P с надписью ортофосфатом из холодильника и довести его до радиоактивности скамейке. Монитор контейнер для внешнего радиоактивного загрязнения, используя счетчик Гейгера.
    6. Рад Символ Развести 32 P помечены ортофосфат в трубку DMEM без фосфатов в концентрации 24 мкКи / мл.
      1. Примечание: в 2 мл в 6-луночный планшет хорошо клеток, что соответствует 5 мкКи 32 P с надписью ортофосфатной / см 2 культивируемых клеток.
      2. Рад Символ Держатьтрубка в банке плексигласа.
    7. Рад Символ Закройте контейнер с оставшейся части 32 P помечены ортофосфатом и заменить в холодильнике.
    8. Рад Символ Удалить 6-луночных с клетками, которые будут помечены из инкубатора и место на радиоактивности скамейке.
    9. Рад Символ Удалить среднего супернатант и выбросьте. Добавить 2 мл фосфатного среде без содержащие 32 Р помечены ортофосфат / хорошо.
    10. Рад Символ Поместите культуру, живущую в коробку из плексигласа затем отслеживать контейнер FOг внешний радиоактивное загрязнение с помощью счетчика Гейгера.
    11. Рад Символ Перевести коробку Perspex с клетками в эукариотической инкубаторе клетки, посвященной изотопного обмена веществ маркировки.
    12. Рад Символ Инкубировать в течение 1-20 ч при 37 ° С в 5% CO 2.
      1. В общем, время включение 3 часов или более рекомендуется. Оптимальное время инкубации могут быть оценены через время курса экспериментов для каждого конкретного белка как хотелось бы.
    13. Рад Символ Дополнительно: лечить клетки с соединением.
      1. В экспериментах с обработки соединением (например, ингибитора киназы), шаг соединение лечение входит в систему послеitial время инкубации без соединения, чтобы позволить для маркировки. По истечении заданного времени инкубации, коробка Perspex содержащий культуральные планшеты удаляются из инкубатора и доведены до радиоактивности скамье.
      2. Рад Символ Маркировка среду удаляют и заменяют нагретого фосфатов среды в котором соединение разбавляют в нужной концентрации. Откажитесь среду в 50 мл трубки для сбора отходов, которая помещается в банку плексигласа.
      3. Рад Символ Клетки заменен в поле Perspex и помещают в клетки инкубаторе в течение требуемого времени контакта.
  3. Рад Символ Сбор лизаты Лабыво главе клетки.
    1. Рад Символ Удалите среду от клеток и выбросить в сбора отходов трубку, которая помещается в банку плексигласа.
    2. Рад Символ Промыть клетки 2x ледяной TBS (трис 50 мМ, NaCl 150 мМ, рН 7,4, 2 мл / полоскания), отбрасывая промывочный раствор в сбора отходов трубки, помещенной в банке Perspex.
    3. Рад Символ Добавить 0,5 мл охлажденного льдом иммунопреципитации (IP) лизирующего буфера в каждую лунку и собирать лизата с помощью пипетки лизата вверх и вниз для того, чтобы ослабить все лизированных клеток.
      1. Подготовьте необходимый объем IP буфера для лизиса (0,5 мл / образца плюс 5% избыток) загодя, добавив коктейль ингибиторов протеаз и фосфатазыингибитор коктейль свежей непосредственно перед использованием.
      2. Состав буфера для лизиса является 20 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон, глицерин 10%, коктейль ингибиторов протеаз и ингибиторы фосфатазы коктейль.
    4. Рад Символ Передача лизата в микроцентрифужных трубки и инкубировать на льду в течение по крайней мере 10 мин.
    5. Рад Символ Центрифуга лизатов в микроцентрифуге при> 5000 мкг в течение 10 мин.
    6. Рад Символ Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов.

2. Анализ маркировки интерес белков

  1. Рад Символ Изолировать интерес белок по иммуноочистки (IP).
    1. Рад Символ Передача микроцентрифужных пробирок с центрифугированных лизатов обратно в лед и супернатант пипеткой в ​​микроцентрифужных трубки, содержащей 10 мкл объем слоя равновесного флаг-M2 агарозных гранулах.
      1. Подготовьте трубы с уравновешенной флаг-М2 агарозы загодя.
      2. Для этого, пипетки объем флаг-M2 агарозном суспензии, соответствующей 10 мкл объем слоя в образце плюс 5% избытком.
        1. Как правило, объем слоя 10 мкл из бисера соответствует 20 мкл суспензии. Обратитесь к спецификации продукта для более подробной информации.
      3. Равновесие бусинки промывкой 3 раза в 10 томах (по отношению к объему слоя) от IP буфере для лизиса.
      4. Распределить уравновешенные бусы равномерно в 10 мкл объем слоя / трубки на столько труб, есть образцы. Пометьте пробирки с идентификатором для каждого образца.
    2. Рад Символ Перенесите микроцентрифужных пробирок 50 мл пробирки (около 6 микроцентрифуги tubes/50 мл трубки), меченных радиоактивным символом трилистника и держать на льду.
    3. Рад Символ Образцы Переезд в поворотным устройством за щитом Perspex в назначенный район холодном помещении для конца над конце смешивания при температуре 4 ° С в течение 1-20 часов.
    4. Рад Символ Перенесите образцы по указанному рабочего пространства на льду.
    5. 50523rad1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Спин вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в сбора отходов трубки.
    6. Рад Символ Вымойте белок связан флаг-M2 агарозном бисером ресуспендированием в 1 мл IP промывочного буфера.
      1. Состав IP промывочного буфера: Трис 25 мМ, рН 7,5, NaCl 400 мМ, Тритон 1%. Рекомендуется также включают протеазы и ингибиторы фосфатазы в буфере для стирки белков, чувствительных к деградации путем совместного очистки протеазы или дефосфорилирования путем совместной очистки фосфатаз.
      2. Рад Символ Спином вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в коллективных отходовТион трубки.
      3. Рад Символ Повторите мыть шаг 3 раза.
    7. Рад Символ После промывок, ресуспендируют бисером в 1 мл IP полоскания буфера (Трис 25 мМ рН 7,5, MgCl 2 10 мм, дитиотреитол (DTT) 2 мм, Тритон 0,02%, бета-глицерофосфат 5 мМ, Na 3 VO 4 0,1 мм).
    8. Рад Символ Спином вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в сбора отходов трубки. Удалите все излишки буфера.
    9. Рад Символ Ресуспендируют бусины в 40 и ми; л IP образец SDS загрузочного буфера (Трис-HCl 160 мМ рН 6,8, 2% SDS, 0,2 М DTT, 40% глицерин, бромфеноловый синий 2 мг / мл).
      1. Образцы могут быть проанализированы немедленно или хранить в -20 ° C морозильнике в течение скрытых анализа.
        1. Рад Символ Для хранения образцов при -20 образцов ° С, место в держателей труб или коробки в коробке Perspex в радиоактивных символ трилистника с надписью морозильник, выделенной для хранения радиоактивных образцов.
    10. Рад Символ Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов.
  2. Рад Символ Решить образцы IP через SDS-PAGE и Блот до PVDF мембраны.
    1. Рад Символ Образцы тепла в загрузочном буфере до 95 ° С в течение 2 мин и центрифуги в течение 1 мин при> 1000 мкг для осаждения бусы.
    2. Рад Символ Подготовьте гель модуль электрофореза белка на радиоактивности скамейке позади экрана плексигласа.
    3. Рад Символ Образцы загружают на 3-8% Трис-ацетат гели через SDS-PAGE.
      1. Этот тип гель подходит для решения высокой молекулярной массой (ВММ) белков. Другие типы гель может быть также подходит, например, 4-20% Bis-трицин гель или трис-глицина 4-20% гели.
      2. Включить маркер молекулярной массы, который пригоден различить размеры HMW протеинов.
    4. <литий> Рад Символ Выполнение электрофореза при 150 V в течение 1 часа.
    5. Рад Символ После электрофореза удалить гель из пластиковый корпус и передать гель в контейнер с Западной блоттинга буфера передачи.
      1. Состав вестерн-блоттинга буфера передачи: Трис 50 ммоль, Глицин 40 мм, SDS 0,04%, метанол 20%.
      2. Рад Символ Отрезанные части геля, которые торчат такие как сепараторов скважины и нижней части геля, который торчит.
    6. Подготовка один из поливинилиденфторида (ПВДФ) мембрана в гель путем погружения в метаноле в течение 1 мин, а затем поместить в буфере для переноса.
      1. Мембраны сократить к с Ame размера, что и геля плюс маржа в 3 мм.
    7. Наведите полусухого модуль блоттинга на радиоактивности скамейке и снимите крышку и верхнюю электродную пластину.
    8. Рад Символ Подготовьте промокательной бутерброд на поверхности полусухого блоттинга модуля.
      1. Влажный дополнительный толстый (2,5 мм толщиной, 7,5 х 10 см большой) блоттинга фильтр в буфере передачи и место на нижней пластине модуля блоттинга.
      2. Рад Символ Поместите предварительно мокрой PVDF мембрану на блоттинга фильтра.
      3. Рад Символ Осторожно поместите гель на PVDF мембрану и удалить пузырьки воздуха.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Завершить бутерброд блот путем смачивания дополнительный толстый блоттинга фильтр в буфере для переноса и место на нижней пластине промокательной модуля. Удалить весь воздух пузырьки в конечном итоге, присутствующие в промокательной бутерброд.
        Пожалуйста, обратите внимание, что описание дано здесь совместим с транс-блот системы SD BioRad где электроды таким образом, что белки мигрировать вниз на мембрану. Другие промокательной системы также совместимы с этих шагов с незначительными изменениями, такими как те, в конце концов нужно учитывать еще один промокательной направление или, в случае бака блоттинга, дополнительной жидких отходов, которые будут утилизировать таким же образом, как буфер для электрофореза выше.
    9. Рад Символ Удалите все излишки буфера с фильтровальной бумагой, и поместить верхнюю пластину и крышку полу-д ры промокательной модуль.
    10. Рад Символ Трансфер белки при 15 V в течение 1-2 часов.
    11. Рад Символ В течение этого времени очистки модуль электрофореза.
      1. Рад Символ Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов.
      2. Рад Символ Промойте модуль электрофореза с дистиллированной водой (AD) и меняйте воду для промывания в радиоактивной жидкости контейнер для отходов.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> После передачи, снимите PVDF мембрану с BLOTTED белков из модуля блоттинга.
    13. Рад Символ Дополнительно: выполнить Ponceau S окрашивание BLOTTED белков для визуализации белков.
      1. Рад Символ Перенести кляксу на мелкой блот инкубации сосуд, содержащий решение Ponceau S и выдержать в течение 5 мин.
      2. Рад Символ Промойте 2 раза быстрее в нашей эры.
    14. Рад Символ Сушат мембрану.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Выполнить авторадиографии.
    1. Рад Символ Expose мембрану к фосфоресценции пластины в течение 1-5 дней.
    2. Рад Символ Читайте Р32 прочь открытой фосфоресценции пластины с помощью Шторм 840 фосфоресценции сканер или эквивалент и сохранить изображение в качестве высокого разрешения TIFF.
  4. Рад Символ Обнаружение уровни белка с помощью иммунологического.
    1. Рад Символ Увлажняет мембран, опуская их кратко в метанол, а затем перенести в неглубокой блот инкубационного судна с PBS. Рад Символ Блок мембран в PBS-T (PBS с 0,1% Triton), содержащего 5% молока.
    2. Рад Символ Инкубируйте пятна с анти-LRRK2 антител 13,16 или анти флаг антитела и процесс дальнейшего с соответствующими промывания и инкубации вторичного антитела.
    3. Рад Символ Выполните обнаружения хемилюминесценции для подтверждения относительные уровни белка из LRRK2.
  5. Количественная включение 32 P в LRRK2.
    1. Выполните денситометрическую анализ по полосам на клякс авторадиограмм и иммунореактивности с использованием соответствующего программного обеспечения, таких как программное обеспечение ImageJ, бесплатная программа, доступной на Национальной InstitУтес из веб-сайта здравоохранения ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Рассчитать уровни фосфата включения как отношение авторадиографического сигнала над уровнем иммунореактивности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того чтобы сравнить общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клетках, 3xflag отмеченных LRRK1 и LRRK2 были выражены в HEK293T клеток 15. Клетки культивировали в 6-луночные планшеты и метили 32 Р и анализировали, как описано выше в тексте протокола. Рисунок 1 показывает репрезентативные результаты для метаболического маркировки LRRK1 и LRRK2 в HEK293T клеток. Радиоактивный фосфат включение наблюдается для обоих LRRK1 и LRRK2. После количественной оценки уровней 32Р нормализованных до уровней белка, измеренную денситометрическим анализом иммунологического с анти-антителом флага, было обнаружено, что LRRK1 имели средний уровень фосфорилирования, которая ниже, чем LRRK2 в условиях испытанных, хотя статистическая значимость не достиг (р> 0,05).

1.jpg "/>
Рисунок 1. Метаболический маркировка LRRK1 и LRRK2. А. LRRK1 и LRRK2 выражены в HEK293T клетки метаболически метили 32 Р, как описано в протоколе и приводит секции. Изображенные здесь являются представительными авторадиограммы (верхняя панель) из 32 P включения, а также представительства Вестернблоты (нижняя панель) из LRRK1 и обнаружения LRRK2 через их тегов 3xflag. B. Количественное определение сравнительного метаболического маркировки LRRK1 и LRRK2 (N = 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с 32 P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками только после нескольких часов инкубации и всех молекул в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Аффинная метка (3xflag) используется для изоляции LRRK белки из других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и Западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс. Этот протокол следует отличать от протокола для измерения LRRK2 а.е.tophosphorylation 17 в этой маркировки LRRK1 или LRRK2 выполняется в клеточной культуре, а не в реакции фосфорилирования в пробирке с очищенными белками.

Следует отметить, что подробное протокол, представленные здесь можно регулировать, чтобы приспособить для нескольких вариантах в зависимости от экспериментальных потребностей. Например, как маркировка является эффективным в большинстве общих линий лабораторных клеток, этот протокол не ограничивается использованием HEK293T клеточной линии. Кроме того, другие метки сродства могут быть использованы в качестве альтернативы 3xflag, например, HA, Myc, V5, GFP или другие метки 18, как множественные метки могут использоваться эффективно Иммунопреципитат LRRK1 или LRRK2. В случае, если антитела белок конкретных доступен для белка, который подходит для иммунопреципитации, как это имеет место для LRRK2 11, это может быть осуществлено также. С протеин-специфические антитела иммунопреципитация класса, это также возможно выполнить метаболизма маркировки LRRKбелки эндогенно экспрессированного в клеточных линиях. В случае LRRK2, несколько моноклональные антитела были описаны которые могут иммунопреципитации эндогенного LRRK2 19. Наконец, метаболический протокол маркировки, описанные здесь LRRK1 и LRRK2 также могут быть адаптированы к любой другой белок, который может быть иммунопреципитации из клеточных линий с использованием общей стратегии, описанной выше.

Ключевым фактором перед выполнением обмена веществ маркировки белков в культуре клеток, как этот метод можно сравнить с другими доступными методами для определения клеточного фосфорилирования белка. Например, фосфорилирование в определенных местах можно контролировать с помощью иммуноблоттинга с использованием фосфо-специфических антител. Этот метод следует аналогичные шаги тем, что описаны здесь, за исключением изотопных шагов маркировки, и по этой причине, этот метод часто отдается предпочтение по сравнению метаболического маркировки с 32 P-ортофосфатом когда она будет доступна. Метаболический маркировки с 32 Р-ортофосфат обеспечивает сигнал, который является представителем общего состояния фосфорилирования белка, поэтому он не может предоставить информацию о фосфорилирования специфических сайтах. Для белков с нескольких сайтов фосфорилирования, как это имеет место для LRRK2 10,11, метаболический метод маркировки обеспечивает оценку одностадийный общего уровня фосфорилирования, который может констатировали с фосфо-специфических антител только в ожидании несколько этапов иммунологического. Например, LRRK2 сильно фосфорилируется в АНК-LRR междоменного области, т.е. S910/S935/S955/S973 11,20 сайтов, а также в других регионах 10 в том числе недавно отличающийся сайт S1292 21. Для того, чтобы рассекать из роли отдельных phosphosites, рекомендуется отдавать предпочтение эксперименты с phosphosite специфических антител. Например phosphosite специфические антитела позволили различить, что phosphosites S910/S935/S955/S973 являются дефосфорилироватьд в нескольких патогенных мутантов, таких как R1441C / G, Y1699C, I2020T, но не в G2019S 11,22, в то время как болезнь LRRK2 мутантные формы в целом показывают более высокие уровни фосфо-S1292 21. Тем не менее, метаболический маркировка полезны для ряда других исследований клеточного фосфорилирования. Метаболический маркировка всегда применимо техника, например, в случаях неизвестных сайтов фосфорилирования, или когда фосфо-антитела не доступны или низкой чувствительности. Наконец, метаболический маркировка позволяет сравнивать общий уровень фосфорилирования различных белков (как показано здесь сравнения клеточном уровнях фосфорилирования LRRK1 и LRRK2, рисунке 1), сравнение, которое сложно сделать с помощью phosphosite-специфических антител, приведенных различия в чувствительности от одного антитела к другому .

В заключение, настоящее протокол позволяет эффективно оценку общего уровня фосфорилирования LRRK белков в клетках. Протокол может быть легко адаптированы дл контролфосфорилирование любой другой белок, который может быть выражено в клетках и изолированных с помощью иммунопреципитации. Использование этого протокола рекомендуется при phosphosite-специфические антитела не доступны для белка в исследовании или в качестве шага на пути их проверки. Этот протокол особенно полезно, когда экспериментальный цель состоит в том, чтобы сравнивать общую фосфорилирование 2 или более различных белков в качестве таких сравнений метаболического через маркировки не смещены различиями в чувствительности обнаружения фосфорилирования белка от одного к другому. Специально для LRRK1 и LRRK2, этот метод может быть использован для сравнительно контролировать деятельность зависимые изменения в фосфорилирования LRRK1 и LRRK2, учитывая, что такие изменения которые начали быть описано для LRRK2 11,13,23, в то время как регулирование фосфорилирования LRRK1 еще плохо изучены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы также благодарны Майкл Дж. Фокс Фонд в поддержку этого исследования. Мы благодарим исследовательский фонд - Фландрия FWO (проект FWO G.0666.09, старший научный сотрудник общение на JMT), проект Нейро-TARGET ВВТ SBO/80020, Ку-Левен (OT/08/052A и IOF-KP/07 / 001) за их поддержку. Это исследование было также частично поддержана Фондом Druwé-Eerdekens управляемых Фонд короля Бодуэна в JMT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water Perkin Elmer NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11971-025 This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel Sigma A2220 For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter Bio-Rad 1703965
Ponceau S solution Sigma P7170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158 (2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472 (2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153 (2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430, (910), 405-413 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics