ميكروفلويديك على رقاقة رد الفعل التقاط-إضافة حلقية لشل حركة عكسية جزيئات صغيرة أو هياكل متعدد المكون للتطبيقات الاستشعار البيولوجي

Published 9/23/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

ونحن نقدم وسيلة لالسريع، الشلل عكسها من جزيئات صغيرة والجمعيات جسيمات متناهية الصغر بين functionalized لسطح مأكل مثل الطحين الرنين (SPR) دراسات، وذلك باستخدام متسلسلة على رقاقة bioorthogonal الكيمياء إضافة حلقية والضد مستضد الالتقاط.

Cite this Article

Copy Citation

Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

طرق للتجميد السريع سطح الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا مع التحكم في التوجيه والكثافة الشلل ومرغوب فيه للغاية لجهاز الاستشعار البيولوجي وميكروأري التطبيقات. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم التساهمية bioorthogonal كفاءة عالية [4 +2] إضافة حلقية التفاعل بين العابرة للcyclooctene (TCO) و1،2،4،5-tetrazine (TZ) لتمكين الشلل ميكروفلويديك من الجزيئات TCO / TZ-derivatized . نحن نراقب هذه العملية في الوقت الحقيقي في ظل ظروف التدفق المستمر باستخدام سطح مأكل صدى (SPR). لتمكين الشلل عكسها وتوسيع نطاق التجريبية من سطح استشعار، ونحن الجمع بين القبض على عنصر مستضد الضد غير التساهمية مع رد فعل إضافة حلقية. من خلال تقديم بالتناوب TCO أو TZ الأنصاف إلى السطح الاستشعار، ومتعددة العمليات التقاط-إضافة حلقية هي الآن ممكنة على سطح استشعار واحد لتجميع والتفاعل على رقاقة دراسات من مجموعة متنوعة من هياكل متعددة المكونات. نحن طllustrate هذه الطريقة مع اثنين من تجارب مختلفة الشلل على شريحة وجهاز الاستشعار البيولوجي؛ جزيء صغير، AP1497 التي تربط ملزم FK506 بروتين 12 (FKBP12)، ونفس جزيء صغير كجزء من جسيمات متناهية الصغر بين functionalized الموضع يجمد و.

Introduction

ردود الفعل اقتران الكفاءة هي أدوات قيمة لربط الجزيئات النشطة بيولوجيا على الأسطح لمجموعة متنوعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. في الآونة الأخيرة، تم استخدام bioorthogonal سريع جدا [4 +2] إضافة حلقية التفاعل بين العابرة للcyclooctene (TCO) و1،2،4،5-tetrazine (TZ) لتسمية سطوح الخلايا والهياكل التحت خلوية، والأجسام المضادة والجسيمات النانوية 1 - 7 هنا، ونحن نستخدم [4 +2] إضافة حلقية رد فعل في تركيبة مع التقاط المستضد / الأجسام المضادة (GST / مكافحة GST) لعكسها توليف على رقاقة هياكل متعددة المكونات لسطح مأكل مثل الطحين الرنين (SPR) تحليل التفاعل ورصد العملية في الوقت الحقيقي (الشكل 1). 8،9 تجدر الإشارة إلى أن استراتيجية التقاط-إضافة حلقية يمكن تجديد السطح باستخدام بروتوكول المعمول بها. 8 ونتيجة لذلك، والتجمع من السطوح استشعار مستقر مع السيطرة على التوجه يجند والكثافة لمجموعة متنوعة من مقايسة جديدة تنسيقات من الممكن الآن. باستخدامهذه الاستراتيجية ونحن لشرح تجميد الجزيئات الصغيرة TCO / TZ derivatized وتميز معدلات إضافة حلقية في مجموعة متنوعة من الظروف العازلة. اخترنا التفاعل معروفة بين FKBP12 وAP1497 جزيء التي تربط FKBP12 10-12 كمثال للتحقق من أن استراتيجية التقاط-إضافة حلقية يحافظ على قدرة جزيء صغير للتفاعل مع هدفه عندما تعلق إما مباشرة لمستضدات GST ثبتوا أو يجمد النانوية (NPS).

هذا الأسلوب يوفر العديد من الفوائد. أولا، تجميد عكسها من جزيئات صغيرة على رقائق استشعار هو ممكن الآن. الثانية، TCO / TZ تجميد جزيئات صغيرة يمكن أيضا دراسات التفاعل خالية من التسمية التي عكس اتجاه الدراسات SPR الكنسي، ويمكن تقديم وجهة نظر مكملة للتفاعل ملزمة. الثالثة، وهذه الطريقة تمكن من تخليق ميكروفلويديك النانوية المستهدفة، والتقييم الفوري للالمربوطة بهاز خصائص. هذه وعود لتحسين كفاءة تقييم أو فحص الجسيمات النانوية المستهدفة، وكذلك تقليل كميات من الجسيمات النانوية المطلوبة. 13-15 رابعا، يمكن هذا النهج قياس حركية التفاعل للتفاعلات إضافة حلقية bioorthogonal في الوقت الحقيقي تحت التدفق المستمر. أخيرا، والشلل الكيمياء TCO / TZ قوية في وجود المصل. أخذت معا، ونحن نتوقع أن هذا النهج تنوعا سيسهل على نطاق واسع بناء السطوح استشعار مستقرة لمجموعة واسعة من الدراسات ميكروفلويديك مع ذات الصلة في التجارب المختبرية والتطبيقات الخلوية الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد GST وجسيمات متناهية الصغر (NP) يصرف

  1. إعداد GST-TCO:
    1. إضافة 8 ميكرولتر من الحل TCO-NHS (50 ملم في DMSO) إلى 100 ميكرولتر من ضريبة السلع والخدمات (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) ويهز الخليط في RT لمدة 1 ساعة.
    2. إزالة كاشف الزائد باستخدام عمود الدوران زيبا تحلية. يتم تخزين الترشيح تعافى تحتوي على المكورات GST-TCO في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
  2. إعداد GST-TZ:
    1. إضافة 6 ميكرولتر من الحل TZ-NHS (25 ملي في DMF) إلى 75 ميكرولتر من ضريبة السلع والخدمات (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) ويهز الخليط في RT لمدة 1 ساعة.
    2. يخفف من خليط التفاعل مع 25 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتنقية باستخدام عمود الدوران تحلية. يتم تخزين الترشيح التي تحتوي على المكورات GST-TZ في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
    ملاحظة: أظهرت التحليلات قداس (MALDI-TOF) أنه في المتوسط ​​~ تم مترافق 10 TZ أو TCO الجزيئات لضريبة المبيعات.
  3. إعداد NP-TCO:
    1. إضافة 100 ميكرولتر من الحل TCO-NHS (50 ملم في DMSO) ل150 ميكرولتر من جسيمات متناهية الصغر aminated (NP-NH 8.7 ملغ حديد / مل في برنامج تلفزيوني، 3 نانومتر الحديد الأساسية ~ 8،000 الحديد / NP) ويهز الخليط في RT لمدة 1 ساعة.
    2. إزالة كاشف الزائد عن طريق الترشيح باستخدام هلام عمود NAP-10 مزال مع العازلة PBS. جمع الفرقة الملونة التي تحتوي على المنتج NP-TCO.
    3. تركيز الراشح إلى الحجم النهائي من 150 ميكرولتر ~ باستخدام جهاز الطرد المركزي فلتر (100 ك MWCO).
    4. إضافة 50 ميكرولتر من أنهيدريد السكسينيك، (0.1 M في DMSO) في حل NP-TCO ويهز في RT لمدة 1 ساعة (أنهيدريد يتفاعل مع أي الأمينات المتبقية لتشكيل الأحماض الكربوكسيلية المحطة. هذا يمنع التفاعلات غير محددة مع سطح ديكستران).
    5. تنقية المنتج NP-TCO باستخدام عمود NAP-10 يبلغ حجمه مع برنامج تلفزيوني. تخزين حل NP-TCO في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.

2. تحضير السطح

يتم تنفيذ كافة فحوصات الرنين مأكل السطح على صك Biacore T100 (GE للرعاية الصحية) فيباستخدام رقاقة الاستشعار CM5 وPBS-P باعتبارها منطقة عازلة تشغيل ما لم يذكر خلاف ذلك 25 ° C. يعملون تحكم Biacore وبرامج التقييم المرفقة مع أداة لإعداد التجارب وتحليل البيانات. وسوف تستخدم وضعين للتشغيل، والمعالجات تطبيق وتشغيل اليدوي لإعداد السطح والرصد على رقاقة التقاط-إضافة حلقية. سيتم استخدام وضع طريقة البناء لإقامة التجارب ملزمة التوجه العكسي ولقياس معدلات التفاعل إضافة حلقية. البيانات هي إشارة مزدوجة تطرح ويتم تنفيذ التحليلات الحركية باستخدام نموذج انجميور ملزمة 1:1.

  1. استخدام قالب معالج أمين الشلل والشلل حدد على الخلايا التدفق 1 (المرجع) و 2 (الكشف). تعديل أسلوب أمين لتنشيط المجموعات الكربوكسيلية السطح عن طريق الحقن من حل 1:01 من 0.4 M EDC: 0.1 M NHS ل480 ثانية بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة. تعيين حقنة من إيثانولامين لإرواء المتبقية استرات المنشط إلى 420 ثانية في وقت الاتصالمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة.
  2. اسم الدخل يجند، ومكافحة VAT (18 ميكروغرام / مل في المخزن خلات، ودرجة الحموضة 5.0) وتعيين لحقن لفترة الاتصال من 420 ثانية بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة.
  3. وضع قارورة الحل المطلوب في رف كاشف 2 مع التأكد من تطابق المواقف مع قائمة المحتويات. حفظ وبدء الشلل.
    ملاحظة: تشغيل المعالج الشلل في هذه النتائج بطريقة في مستويات تجميد المضادة للضريبة السلع والخدمات في حدود 14،000 إلى 17،000 ~ RU.
  4. تحرير المعالج تجميد لحقن فقط GST يجند (20 ميكروغرام / مل) حل ل420 ثانية في 5 ميكرولتر / دقيقة أكثر من خلية تدفق إشارة 1.

3. الرصد على رقاقة التقاط-إضافة حلقية من بين functionalized الجزيئات

  1. مراقبة على رقاقة التقاط-إضافة حلقية في الوقت الحقيقي (الشكل 2).
    1. وضع GST-TCO (20 ميكروغرام / مل)، TZ-BnNH 2 (10 ميكرومتر) والتجديد (10 ملي الجلايسين، ودرجة الحموضة = 2.0) قارورة الحل في رف كاشف 2. حدد الرجلالسياقية طريقة المدى، تعيين معدل التدفق إلى 5 ميكرولتر / دقيقة وتدفق مسار تدفق الخلية 2.
    2. حقن محلول GST-TCO عن 420 ثانية.
    3. حقن محلول TZ-BnNH 2 ل 600 ثانية.
    4. تجديد السطح مع حقنتين 30 ثانية من حل التجدد.
  2. مراقبة على رقاقة تجميع هياكل متعددة المكونات في الوقت الحقيقي (الشكل 3):
    1. وضع GST-TZ (20 ميكروغرام / مل)، NP-TCO (100 ميكروغرام الحديد / مل)، TZ-BnNH 2 (10 ميكرومتر) والتجديد (10 ملي الجلايسين، ودرجة الحموضة = 2.0) قارورة الحل في رف كاشف 2. حدد أداة دليل الأسلوب المدى، تعيين معدل التدفق إلى 5 ميكرولتر / دقيقة ومسار تدفق لتدفق الخلية 2.
    2. حقن محلول GST-TZ لمدة 60 ثانية.
    3. حقن محلول NP-TCO لمدة 60 ثانية.
    4. حقن محلول TZ-BnNH 2 لمدة 60 ثانية.
    5. تجديد السطح مع حقنتين 30 ثانية من حل التجدد.

4. Monitoring الكثافة تجميد وتحديد الأسعار إضافة حلقية

  1. توصيف معدلات التفاعل جزيء إضافة حلقية صغيرة (الشكل 4).
    1. تحديد أسلوب الإدخال والمعلمات العام الجديد. في لوحة الخطوات مقايسة إنشاء خطوة والاسم الجديد هو عينة. تعيين الغرض وربط إعدادات قاعدة لعينة.
    2. في لوحة أنواع دورة إنشاء خطوة دورة جديدة وادخال الأوامر التالية، التقاط، عينة، التجديد والتجدد 1 2.
    3. حدد الأمر التقاط؛ اسم الدخل يجند (GST-TCO، 20 ميكروغرام / مل)، وقت الاتصال 120 ثانية في 5 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق إلى: الثانية. حدد الأمر عينة؛ إدخال 180 مرة ثانية الاتصال، 60 ثانية الوقت التفكك، 30 ميكرولتر / دقيقة معدل تدفق وتعيين مسار تدفق إلى: كلاهما. حدد الأمر التجدد 1؛ مدخلات تجديد اسم حل (10 ملي جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 2.0)، وقت الاتصال من 30 ثانية في 30 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق إلى: الثانية. تكرار نفس التجديد ل2 الأوامر. </ لى>
    4. حدد تشغيل إعداد وتعيين مسار تدفق ل: 2-1. حدد المقبل وملء قائمة عينة مع حل الحليلة (TZ-BnNH 2) وسلسلة تركيز (0،3 حتي 10 ميكرومتر، 01:02 تمييع). حدد بجانب رف لوحة الموقف. قارورة مكان الحل في رف كاشف 2 وسلسلة التخفيف في لوحة 96 جيدا مع التأكد من تطابق المواقف مع قائمة المحتويات. حفظ القالب طريقة وبدء الفحص ملزمة. وترد ربط البيانات وتحليل الحركية في الشكل 4.
  2. توصيف NP معدلات التفاعل إضافة حلقية (الشكل 4).
    1. فتح القالب طريقة حفظ من فوق وتغيير المعلمات التالية. حدد لوحة لقطة، وتغيير اسم ليجند GST-TZ، 20 ميكروغرام / مل. حدد لوحة عينة، وتغيير وقت الاتصال إلى 120 ثانية وقت الاتصال ووقت التفكك إلى 120 ثانية.
    2. حدد قائمة عينة؛ تغيير تحليلها لNP-TCO وسلسلة تركيز (7-224 نانومتر، 01:02 تمييع). قارورة مكان الحل في رف كاشف2 وسلسلة التخفيف في لوحة 96 جيدا مع التأكد من تطابق المواقف مع قائمة المحتويات. حفظ القالب طريقة وبدء الفحص ملزمة. وترد ربط البيانات وتحليل الحركية في الشكل 4.

5. قياس ملزم من FKBP12 لAP1497 مشلول

دراسات ملزمة عكس التوجه نحو توظيف FKBP12 كما الحليلة ومجمع AP1497 كما يجند يجمد (الشكل 5). تم تعيين طريقة عامة لهذا الاختبار على النحو التالي باستخدام أداة أسلوب البناء:

  1. تحديد أسلوب الإدخال والمعلمات العام الجديد. في لوحة الخطوات مقايسة إنشاء واسم لقطة، ونماذج من التجديد والخطوات. حدد المقابلة الغرض وربط إعدادات قاعدة.
  2. حدد لوحة أنواع دورة وخلق 3 خطوات دورة: لقطة، عينة والتجديد.
  3. إدراج الأمر ضمن الخطوة مرتين التقاط لقطة دورة. حدد التقاط 1 لوحة وحدد الحل التقاط كما المتغيرات المستقلةه، تعيين وقت الاتصال إلى 300 ثانية بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق إلى: الثانية. حدد لوحة القبض على 2 وحدد الحل التقاط كمتغير، تعيين وقت الاتصال إلى 250 ثانية بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق إلى: الثانية.
  4. إدراج الأمر عينة تحت الخطوة دورة عينة. حدد لوحة عينة؛ الوقت المحدد اتصال إلى 60 ثانية، والوقت التفكك إلى 200 ثانية بمعدل تدفق 30 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق إلى: كلاهما.
  5. إدراج الأمر تجديد مرتين تحت الخطوة دورة التجديد. حدد لوحة التجدد 1؛ مدخلات تجديد اسم حل (10 ملي جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 2.0)، وقت الاتصال من 30 ثانية في 30 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق إلى: الثانية. تكرار نفس لوحة التجديد 2.
  6. حدد تشغيل إعداد وتعيين مسار تدفق ل: 2-1. تحديد أسماء القبض على الحل التالي والمدخلات (GST-TCO وAP1497-TZ)، اسم العينة (FKBP12)، سلسلة تركيز (،020-5 ميكروغرام / مل، 01:02 تمييع) وMW (13،000). قارورة مكان الحل في صeagent رف 2 وسلسلة التخفيف في لوحة 96 جيدا مع التأكد من تطابق المواقف مع قائمة المحتويات. حفظ القالب طريقة وبدء الفحص ملزمة. وتظهر بيانات تحليل الحركية في الشكل 5.

6. قياس ملزم من FKBP12 لAP1497 المرفقة ليجمد مصادر القدرة النووية

الأسلوب العام لتجميد جسيمات متناهية الصغر والصغيرة واشتقاق جزيء FKBP12 مقايسة ملزمة يتم انشاء النحو التالي باستخدام أداة أسلوب البناء:

  1. فتح القالب طريقة حفظ من فوق وتعديله. إدراج أمر القبض إضافية في إطار خطوة لقطة دورة. حدد التقاط 1 لوحة؛ إلغاء القبض على الحل كما متغير واسم القبض على الحل 1 (GST-TZ). مجموعة وقت الاتصال إلى 60 ثانية بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق إلى الثانية. حدد التقاط 2 لوحة؛ إلغاء القبض على الحل كما متغير واسم القبض على حل 2 (NP-TCO). الوقت المحدد للاتصال إلى 90 ثانية بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق الى المركز الثاني. حدد التقاط لوحة 3؛ إلغاء القبض على الحل كما متغير واسم القبض على الحل 3 (AP1497-TZ). الوقت المحدد الاتصال إلى 180 ثانية بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة وتعيين مسار تدفق إلى الثانية.
  2. حدد تشغيل إعداد وتعيين مسار تدفق ل: 2-1. حدد المقبل مرتين. قارورة مكان الحل في رف كاشف 2 وسلسلة التخفيف في لوحة 96 جيدا مع التأكد من تطابق المواقف مع قائمة المحتويات. حفظ القالب طريقة وبدء الفحص ملزمة. وتظهر بيانات تحليل الحركية في الشكل 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم تكييف البيانات والأرقام من المرجع 8.

تجميد عكسها كفاءة من الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا مع التحكم في التوجيه والكثافة يلعب دورا رئيسيا في تطوير تطبيقات الاستشعار البيولوجي جديدة. باستخدام تفاعل سريع بين bioorthogonal TCO وTZ، ونحن تصف طريقة لتجميع تدريجي وتجديد الأسطح يجند مع الإبقاء على النشاط البيولوجي. الشكل 2 يبين رصد في الوقت الحقيقي من TZ-BnNH 2 الشلل. يتم حقن محلول من GST-TCO على سطح المضادة للGST ثبتوا قبل مما أدى إلى ارتفاع 400 ~ RU ردا على ذلك. A الحقنة الثانية مع TZ-2 BnNH يظهر بسرعة ~ 15 ارتفاع RU ردا على ذلك. ويلاحظ أي تفكك مستضد derivatized بعد التحول إلى تشغيل عازلة تقديم أدلة للاستقرار الهيكل. يتم إعادة السطح في الخطوة الأخيرة من دورة لتمكين متعددة دورات القبض-إضافة حلقية. لناجي هذا الإجراء واستبدال TZ-BnNH 2 شاردة مع جزيء AP1497-TZ يولد سطح النشطة بيولوجيا تستخدم للدراسات التفاعل مع FKBP12 هدفه (الشكل 5). اضطراب التفاعل الضد / المستضد (كما هو موضح في الشكل 2) تجدد سطح المضادة للضريبة السلع والخدمات، والسماح لتجميع الجزيئية الجديدة التي سيتم بناؤها. في هذه الحالة، يتبع حقن GST-TZ (القبض على 800 ~ RU) مع حقنة من NP-TCO (إضافة حلقية ~ 600 RU)، شل حركة جسيمات متناهية الصغر على نحو فعال إلى السطح الاستشعار (الشكل 3). تتوفر لإضافة حلقية مع حقن TZ-BnNH 2 (22 ~ RU) مجموعات غير المتفاعل TCO على NP. بدلا من ذلك، يتم استخدام AP1497-TZ لرصد التفاعلات بين functionalized جسيمات متناهية الصغر FKBP12 (الشكل 5). لا تفارق من هياكل متعددة المكونات (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) لوحظ تقديم أدلة للاستقرار هيكل والنشاط الحيوي (AP1497-Tz/FKBP12 بinding).

مع قدرات في الوقت الحقيقي للتجميد (إضافة حلقية) رصد رد الفعل وتجديد السطح، وتوصيف واضحة من معدل تكوين الجمعيات ك يتم إنجاز (معدل إضافة حلقية) كما هو مبين في الشكل 4. معرفة حركية التفاعل يقدم مبادئ توجيهية للسيطرة على الكثافة الشلل (وقت الاتصال والتركيز)، معلمة هامة لفحوصات جهاز الاستشعار البيولوجي. حقن زيادة تركيزات TZ-BnNH 2 أو NP-TCO في مكررة أكثر من GST-TCO أو GST-TZ الأسطح، على التوالي، يولد ربط البيانات (الخطوط الحمراء). البيانات ملزمة لعينتين الحليلة متتابعة من نفس تركيز على نفس السطح والتي تعكس ما يقرب من superimposable فقدان الحد الادنى من الأجسام المضادة القدرة ملزم نظرا لدورات متعددة من القبض-إضافة حلقية والتجدد. يوفر البرنامج التقييم التحليلات الحركية الأكثر تناسبا (خطوط سوداء ) لجمعدلات التفاعل ycloaddition ك لهو مبين في الشكل (4).

الشكل 1
الشكل 1. استراتيجية اقتران Bioorthogonal لتجميد عكسها جزيئات derivatized. A. [4 +2] إضافة حلقية التفاعل بين العابرة للcyclooctene (TCO) و1،2،4،5-tetrazine (TZ) الأنصاف لإعطاء معقد إضافي 1،4-dihydropyridazine . الموسومة ب مخطط التجريبية لتجميد عكسها من TZ / TCO الجزيئات. C. مخطط التجريبية لعكسها الشلل جسيمات متناهية الصغر وfunctionalization. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

سرك ملغ = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2.jpg" بديل = "الشكل 2" FO: محتوى العرض = "4.5in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2highres.jpg" />
الشكل 2. . رصد في الوقت الحقيقي من الشلل الصغيرة جزيء 1) الأساس:. يجمد قبل مكافحة GST 2) القبض على حقن GST-TCO بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة GST (ر = 0-420 ثانية)، تليها حقن تشغيل المخزن المؤقت (ر . = 420-540 ثانية) تظهر استمرار التفاعل 3) إضافة حلقية بين القبض GST-TCO وtetrazine (TZ-BnNH ~ 15 ارتفاع RU في الاستجابة؛ ر = 540-1،140 ثانية). لا يحدث تسوس إشارة رغم التحول الطور المتحرك لتشغيل العازلة (ر = 1،140-1،820 ثانية). 4) التجديد من سطح المضادة للضريبة السلع والخدمات مع 2 حقن قصيرة من 10 ملي الجلايسين، ودرجة الحموضة 2.1 (ر = 1،820-2،000 ثانية).

"FO: SRC =" / files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg "/>
الرقم 3. رصد في الوقت الحقيقي من الشلل جسيمات متناهية الصغر وfunctionalization. 1) الأساس. 2) لقطة من حقن GST-TZ (ر = 0-60 ثانية) 3) إضافة حلقية بين القبض GST-TZ وحقن NP-TCO (ر = 135-195 ثانية)، تليها حقن تشغيل العازلة مع عدم وجود تسوس في إشارة (ر = 195-300 ثانية). 4) إضافة حلقية بين يجمد NP-TCO وحقن TZ-BnNH 2 (22 ~ ارتفاع RU ردا على ذلك، ر = 300-360 ثانية). ليس هناك إشارة على الرغم من تسوس تبديل الطور المتحرك لتشغيل العازلة (ر = 360-480 ثانية) تقديم أدلة لتحقيق الاستقرار المتعددة العناصر.

الرقم 4
الشكل 4. sensorgrams ممثل تظهر بinding البيانات (الخطوط الحمراء) والتحليلات الحركية (الخطوط السوداء) للتفاعل إضافة حلقية بين TZ وTCO الموسومة الجزيئات في وجود أو غياب 100٪ FBS. ويلخص الجدول الثوابت الجمعيات (إضافة حلقية) المعدل، ك أ.

الرقم 5
الرقم 5. دراسات SPR من التفاعلات جزيء صغير / البروتين في تكوينات مختلفة (أعلى) المشتقات الاصطناعية من FK506: AP1497 وAP1497-TZ. ويبين الجدول الحركية والثوابت معدل التوازن المستمدة من البيانات ملزمة. يتم تضمين البيانات من التجارب ملزمة حيث يجمد البروتين (أي تجارب SPR التقليدية) للمقارنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طريقة التقاط-إضافة حلقية وصفها هنا تمكن السريع، والشلل عكسها النانوية المعدلة والجزيئات الصغيرة للتفاعل القائم على رقاقة خالية من التسمية والدراسات الحركية. بروتوكول الشلل لا يمكن أن يؤديها في دقيقة تتطلب <10 ميكرومتر تركيزات بروابط جزيء صغير. عن طريق تحوير تركيز وكثافة يجند الشلل وقت الاتصال يمكن السيطرة عليها عن كثب. تظهر البيانات المتوفرة لدينا أن التفاعلات bioorthogonal على رقاقة الحفاظ على قدرة في الموقع النانوية بين functionalized أو جزيئات صغيرة يجمد على التفاعل مع أهدافها. لقد تميزت أيضا معدلات إضافة حلقية ثنائي الجزيء بين اثنين من الجزيئات الصغيرة، (TCO وTZ) مع الأوزان الجزيئية المنخفضة. ونحن نتصور أن فحوصات مماثلة لا يمكن أن يؤديها لقياس ومقارنة معدلات التفاعلات bioorthogonal سريعة أخرى.

عكسها، وتدفق مستمر على رقاقة جسيمات متناهية الصغر والشلل في الموقع functionalization العلاقات العامةovides الوصول السريع إلى مجموعة متنوعة من الجسيمات النانوية المعدلة للفحص وتحليل التفاعل في نفس التجربة. 13-15 بالمقارنة مع التوليف جسيمات متناهية الصغر التقليدية، الأمر الذي يتطلب خطوات مختلفة لتنقية، الشلل والفرز، وأسلوبنا يقلل بدرجة كبيرة كميات المدخلات من المواد الحيوية، والمذيبات والكواشف، بينما تتناقص في وقت واحد الشواغل البيئية التعامل مع استخدام جسيمات متناهية الصغر والتخلص منها. 16 الأهم من ذلك، ردود الفعل جسيمات متناهية الصغر functionalization هي قوية إلى وجود تركيزات مصل تستخدم عادة لتجارب زراعة الخلايا، وحتى لتركيزات مصل عالية للغاية. هذه الميزة يمكن أن تسهل العلاقات بين الهيكل والنشاط لتصميم جسيمات متناهية الصغر في وجود المصل (والتي يمكن أن تؤثر على البروتين والاكليل سطح خصائص جسيمات متناهية الصغر). 17،18

في معظم المقايسات SPR، حيث يتم دراسة جزيء صغير من البروتين التفاعلات، والبروتين (يجند) هويجمد من خلال علامة تقارب (GST، البيوتين، الخ) أو من خلال الروابط التساهمية أميد. ثم يتم تمرير الحليلة على يجند حيث النتائج ملزمة في الاختلافات الشامل السطح، والتي تم الكشف عن التغييرات معامل الانكسار. عكس التوجه SPR الكنسي وشل حركة جزيء صغير بطريقة مريحة وقابلة للانتكاس توفر الوصول السهل لدراسة الربط المباشر أهداف الجزيئات القابلة للذوبان ويوضح مراحل محددة (يجمد مقابل القابلة للذوبان) التحف. 19،20 صيغ الفحص من هذا النوع خاصة قيمة لتثبيط المنافسة والدراسات. يمكن أيضا أن تكون 21 عكس التوجه المفيد تحت ظروف متعددة، أي أ) مع التحاليل من الوزن الجزيئي المنخفض، معتبرا أن إشارة ملزمة يتناسب مع السطح كتلة التغيير ب) تجميع وغير النوعية من التحاليل مسعور 22 يتم التخلص مما يجعل تحليل البيانات واضحة ج) توصيف المجلدات تقارب عالية يمكنأن يكون تحديا بسبب الإقامة الطويلة مرات (يبطئ من معدلات، خاصة عند التعامل مع مثبطات التساهمية) 23 والحاجة إلى شروط تجديد سطح استعدادا للدورة القادمة تحليل د) قد يكون وكلاء تجديد الآثار المهينة على هيكل أو وظيفة البروتين يجمد.

من خلال دمج bioorthogonal طريقة التقاط-إضافة حلقية كجزء من استراتيجية الشلل لدينا، ونحن تحايل بعض الصعوبات المرتبطة تقنيات صغيرة الشلل جزيء التقليدية. تتطلب هذه تركيزات أعلى من ذلك بكثير منذ يجند الجذب الكهربائي مما يؤدي إلى السطح قبل تركيزات نموذجية لبروتوكولات البروتين الشلل غير فعالة مع جزيئات صغيرة. وفقا لذلك، زيادة تركيزات بروابط يؤدي إلى زيادة نسب العضوية المشارك المذيبات ليجند حل. كلا من هذه الشروط غير متوافقة مع أنظمة تدفق الدقيقة فلويديك ونتيجة لذلك، ط التقليديةيجب إجراء mmobilizations خارج الصك حيث رصد في الوقت الحقيقي غير ممكن. 24 وأخيرا، في حالة وجود الشلل التقليدية الناجحة، وتعديل سطح التساهمية يمنع التجديد السطحية ويحد من نطاق تجريبي من جهاز الاستشعار البيولوجي الأسطح مما أدى إلى زيادة الاستثمارات في الوقت والجهد والتكاليف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

نحن نعترف التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NHLBI العقد رقم HHSN268201000044C لRW، SH وSYS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. Edition AB, (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats