Микрофлюидных На чипе Захват-циклоприсоединения Реакция на Обратимо Остановите малых молекул или многокомпонентные структуры для биосенсора приложений

Published 9/23/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Мы представляем метод для быстрого, обратимые иммобилизации малых молекул и функционализованных ансамблей наночастиц для поверхностного плазмонного резонанса (SPR) исследований, с помощью последовательного на-чипе bioorthogonal химия циклоприсоединение и антитело-антиген захвата.

Cite this Article

Copy Citation

Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Методы быстрого поверхности иммобилизации биологически активных малых молекул с контролем над ориентации и плотности иммобилизации весьма желательны для биосенсора и микрочипов приложений. В этом исследовании, мы используем высокоэффективную ковалентную bioorthogonal [4 +2] циклоприсоединения реакции между транс-циклооктена (TCO) и 1,2,4,5-тетразин (TZ) для того, чтобы микрофлюидных иммобилизации TCO / Tz-производные молекул . Мы контролировать процесс в режиме реального времени в условиях непрерывного потока с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Чтобы включить обратимой иммобилизации и продлить экспериментальный спектр поверхности датчика, совместить нековалентная антиген-антитело компонент захвата с реакцией циклоприсоединения. По поочередно представляя TCO или TZ фрагменты на поверхность датчика, несколько процессов захвата-циклоприсоединения в настоящее время возможно только на одной поверхности датчика для на чипе сборки и взаимодействия исследований различных многокомпонентных конструкций. Мы яllustrate этот метод с двух различных экспериментах иммобилизации на чипе биосенсора; небольшой молекулы, AP1497, который связывается FK506-связывающий белок (12 FKBP12) и той же небольшой молекулы, как часть иммобилизованным на месте и функциональными наночастицы.

Introduction

Эффективные реакции сопряжения являются ценными инструментами для крепления биоактивные молекулы на поверхности для различных биотехнологических приложений. В последнее время очень быстро bioorthogonal [4 +2] циклоприсоединения между транс-циклооктена (TCO) и 1,2,4,5-тетразин (Tz) был использован для обозначения поверхности клеток, субклеточных структур, антитела и наночастиц 1. - 7 Здесь мы используем реакцию [4 +2] циклоприсоединения в сочетании с захватом антигена / антитела (GST / анти-GST) для обратимого на-чипе синтеза многокомпонентных структур для поверхностного плазмонного резонанса (SPR) анализа взаимодействия и мониторинга Процесс в режиме реального времени (рис. 1). 8,9 Примечательно, что стратегия захвата-циклоприсоединения позволяет регенерацию поверхности с помощью установленным протоколом. 8 Как следствие, собраний стабильных поверхностей датчиков с контроля над лиганда ориентации и плотности для различных нового анализа Форматы теперь это возможно. Использованиеэта стратегия мы демонстрируем иммобилизации TCO / Tz-производные малых молекул и характеризуют темпы циклоприсоединения в различных условиях буфера. Мы выбрали известную взаимодействие между FKBP12 и AP1497 молекулы, который связывает FKBP12 10-12 в качестве примера для проверки того, что стратегия захвата-циклоприсоединения сохраняет способность малых молекул взаимодействовать с своей цели, когда либо непосредственно связанными с иммобилизованными GST антигенов или иммобилизованных наночастиц (NPS).

Этот метод имеет несколько преимуществ. Во-первых, обратимы иммобилизация малых молекул на сенсорных чипов теперь это возможно. Во-вторых, TCO / Tz иммобилизация малых молекул также позволяет этикеток без исследования взаимодействия, призванным устранить ориентацию канонических SPR исследований, и может обеспечить дополнительную вид обязательного взаимодействия. В-третьих, этот метод позволяет микрофлюидных синтез целевых наночастиц и немедленной оценки их bindinг свойствами. Это обещает повысить эффективность оценки или скрининга целевых наночастиц, а также уменьшить количество необходимых наночастиц. 13-15 В-четвертых, этот подход может измерять кинетики реакции из bioorthogonal реакций циклоприсоединения в реальном времени при непрерывном потоке. Наконец, иммобилизация химии TCO / Tz является надежной в присутствии сыворотки. Взятые вместе, мы ожидаем, что этот универсальный подход широко облегчить строительство стабильных поверхностей датчиков для широкого спектра микрофлюидных исследований, имеющих отношение к в пробирке и в естественных клеточных приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка GST и наночастиц (NP) конъюгатов

  1. Подготовка GST-ТШО:
    1. Добавить 8 мкл раствора NHS-TCO (50 мМ в ДМСО) к 100 мкл GST (1 мг / мл в PBS) и встряхивают смесь при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. Удалить избыток реагента с использованием колонки спин обессоливания Zeba. Извлеченный фильтрат, содержащий конъюгат GST-TCO хранится при 4 ° С до использования.
  2. Подготовка GST-Tz:
    1. Добавить 6 мкл раствора NHS-Tz (25 мм) в ДМФА в 75 мкл GST (1 мг / мл в PBS) и встряхивают смесь при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. Разбавл ют реакционную смесь 25 мкл PBS и очищают с использованием колонки спин обессоливания. Фильтрат, содержащий конъюгат GST-Tz хранится при 4 ° С до использования.
    Примечание: Массовые анализы (MALDI-TOF) показали, что в среднем ~ 10 Tz или TCO молекулы конъюгировали с GST.
  3. Подготовка NP-ТШО:
    1. Добавить 100 мкл раствора NHS-TCO (50 мМ в ДМСО) к150 мкл аминированной наночастицы (NP-NH 2, 8,7 мг Fe / мл в PBS, 3 нм железный сердечник ~ 8000 Fe / NP) и встряхивать смесь при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. Удаление избытка реагента путем гель-фильтрации с использованием колонки NAP-10, элюировали PBS буфера. Сбор цветной полосу, содержащую продукт NP-TCO.
    3. Фильтрат концентрируют до конечного объема ~ 150 мкл с использованием центробежного устройства фильтра (100 K MWCO).
    4. Добавить 50 мкл ангидрида янтарной кислоты, (0,1 М в ДМСО) к решению NP-TCO и встряхните при комнатной температуре в течение 1 часа (ангидрид реагирует с оставшихся аминов с образованием терминальных карбоновых кислот. Это предотвращает неспецифических взаимодействий с декстран поверхности).
    5. Очищают продукт NP-TCO использованием колонки NAP-10 с элюцией смесью PBS. Хранить раствор NP-TCO при 4 ° С до использования.

2. Подготовка поверхности

Все поверхностного плазмонного резонанса анализы выполняются на Biacore T100 инструмента (GE Healthcare) в25 ° C с использованием сенсорного чипа CM5 и PBS-P как работает буфер, если не указано иное. Контроль Biacore и пробном поставляется вместе с прибором используются для постановки экспериментов и анализа данных. Два режима работы, мастера приложений и эксплуатации пробег будет использоваться для подготовки и мониторинга поверхности на-чипе захвата-циклоприсоединения. Режим метод строитель будет использоваться для создания обратной ориентации обязательные эксперименты и для измерения скорости реакции циклоприсоединения. Данные с двойным ссылка вычитается и кинетические анализы выполняются с помощью 1:1 Ленгмюра модели связывания.

  1. Используйте шаблон мастера амин иммобилизации и выберите иммобилизации на клетки потока 1 (опорный) и 2 (обнаружение). Изменить амина способ для активации поверхности карбоксильные группы путем инъекции 1:1 растворе 0,4 М EDC: 0,1 М NHS для 480 сек при скорости потока 10 мкл / мин. Установите инъекцию этаноламином чтобы утолить оставшиеся активированные сложные эфиры на 420 сек времени контакта вскорость потока 10 мкл / мин.
  2. Входное имя лиганд, анти-GST (18 мкг / мл в ацетатном буфере, рН 5,0) и установить для введения в течение времени контакта 420 сек при скорости потока 10 мкл / мин.
  3. Поместите необходимые флаконов растворов в реагента стойке 2 убедившись, чтобы соответствовать позиции с списке содержимого. Сохранить и начать иммобилизации.
    Примечание: Запуск мастера иммобилизации таким образом приводит к иммобилизации уровней анти-GST в диапазоне от ~ 14000 до 17000 RU.
  4. Редактирование мастер иммобилизации только вводить GST лиганд (20 мкг / мл) в течение 420 сек при 5 мкл / мин в течение ссылки потока ячейки 1.

3. Мониторинг на кристалле Захват-циклоприсоединения функционализованных молекул

  1. Мониторинг на-чипе захвата-циклоприсоединения в режиме реального времени (рис. 2).
    1. Поместите GST-TCO (20 мкг / мл), TZ-BnNH 2 (10 мкм) и регенерации (10 мМ глицина, рН = 2,0) раствор реагента флаконов в стойке 2. Выберите человекаМетод выполнения UAL, регулировка подачи до 5 мкл / мин и путь поступать в Проточная ячейка 2.
    2. Введите решение GST-TCO для 420 сек.
    3. Введите решение TZ-BnNH 2 за 600 сек.
    4. Восстановить поверхность с двумя 30 сек инъекций раствора регенерации.
  2. Мониторинг на-чипе сборку многокомпонентных структур в режиме реального времени (рис. 3):
    1. Поместите GST-TZ (20 мкг / мл), NP-TCO (100 мкг Fe / мл), TZ-BnNH 2 (10 мкм) и регенерации (10 мМ глицина, рН = 2,0) раствор реагента флаконов в стойке 2. Выберите инструмент ручной метод запуска, регулировка подачи до 5 мкл / мин и пути потока в Проточная ячейка 2.
    2. Введите раствора GST-Tz в течение 60 сек.
    3. Введите раствор NP-TCO для 60 сек.
    4. Введите раствор TZ-BnNH 2 в течение 60 сек.
    5. Восстановить поверхность с двумя 30 сек инъекций раствора регенерации.

4. Ммониторинг функционирования иммобилизации Плотность и определение Циклоприсоединение курс

  1. Характеристика низкомолекулярных скорости реакции циклоприсоединения (рис. 4).
    1. Выберите новый метод и входные общие параметры. На панели шагов анализов создать новый шаг и назовите его образец. Установите Цель и подключение базовых настроек к образцу.
    2. В панели Типы цикла Создайте новый шаг цикла и вставьте следующие команды; Захват, образец, Регенерация 1 и регенерация 2.
    3. Выберите команду Capture; имя входного лиганд (GST-ТШО, 20 мкг / мл), время контакта 120 сек при 5 мкл / мин и установить пути потока к: Второй. Выберите команду примера; вход 180 раз сек контакт, 60 сек время диссоциации, расход 30 мкл / мин и установить путь потока для: Оба. Выберите команду Регенерация 1; имя решения регенерации вход (10 мМ глицин-HCl рН 2,0), время контакта 30 сек при 30 мкл / мин и установить пути потока к: Второй. Повторите то же самое для регенерации 2 команды. </ Li>
    4. Выберите Запустите программу установки и установить путь потока для: 2-1. Выберите следующий и заполнить список образцов с анализируемого раствора (Tz-BnNH 2) и серии концентраций (0,3-10 мкМ, 1:2 разбавления). Выбор следующего ломать положение панели. Место решение флаконов в реагента стойке 2 и серии разведений в 96-луночный планшет убедившись, чтобы соответствовать позиции с списке содержимого. Сохранить шаблон метод и начать связывания анализа. Связывание данных и кинетический анализ показаны на рисунке 4.
  2. Характеристика НП скорости реакции циклоприсоединения (рис. 4).
    1. Откройте сохраненный шаблон метод сверху и изменить следующие параметры. Выберите Capture панель; переименование лиганда GST-TZ, 20 мкг / мл. Выберите примера панель; изменение времени контакта до 120 сек времени контакта и времени диссоциации 120 с.
    2. Выберите список образцов; изменить анализируемого НП-ТШО и серии концентраций (от 7 до 224 нМ, 1:2 разбавление). Место решение флаконов в реагента стойку2 и серийные разведения в 96-луночный планшет убедившись, чтобы соответствовать позиции с списке содержимого. Сохранить шаблон метод и начать связывания анализа. Связывание данных и кинетический анализ показаны на рисунке 4.

5. Измерение Связывание FKBP12 с иммобилизованным AP1497

Обратный-ориентации привязки исследования используют FKBP12 как анализируемым веществом и соединения AP1497 как иммобилизованного лиганда (рис. 5). Общий метод для этого анализа устанавливается следующим помощи функции метод строитель:

  1. Выберите новый метод и входные общие параметры. На панели шагов анализов создавать и название Capture, Примеры и регенерации шаги. Выберите соответствующий Цель и подключение базовых настроек.
  2. Выберите панель типы цикла и создать 3 шага цикла: Захват, образцов и регенерации.
  3. Вставьте команду Capture дважды в шаге Захват цикла. Выберите Capture 1 панели и выберите решение регистрации в качестве variablе, установить время контакта до 300 с при скорости потока 5 мкл / мин и заданной траектории потока до секунда. Выберите панель Захват 2 и выбрать решение регистрации в качестве переменной, установленный времени контакта до 250 с при скорости потока 5 мкл / мин и заданной траектории потока до секунда.
  4. Вставьте команду примера под шагом Sample цикла. Выберите примера панель; набор время контакта 60 с, время диссоциации до 200 сек при скорости потока 30 мкл / мин и установить пути потока к: Оба.
  5. Вставьте команду регенерации дважды в стадии регенерации цикла. Выберите панель Регенерация 1; имя решения регенерации вход (10 мМ глицин-HCl рН 2,0), время контакта 30 сек при 30 мкл / мин и установить пути потока к: Второй. Повторите то же самое для Регенерация 2 панели.
  6. Выберите Запустите программу установки и установить путь потока для: 2-1. Выберите следующие и входные имена решение регистрации (GST-TCO и AP1497-TZ), имя образца (FKBP12), концентрация серии (0,020 до 5 мкг / мл, 1:2 разведение) и MW (13000). Место решение флаконов в гeagent стойки 2 и серийные разведения в 96-луночный планшет убедившись, чтобы соответствовать позиции с списке содержимого. Сохранить шаблон метод и начать связывания анализа. Данные Кинетическая анализа представлены на рисунке 5.

6. Измерение Связывание FKBP12 чтобы AP1497 Прикрепленный с иммобилизованным НП

Общий метод для наночастиц иммобилизации, производных малой молекулы и FKBP12 анализа связывания устанавливается вверх следующим помощи функции метод строитель:

  1. Откройте сохраненный шаблон метод сверху и изменять. Вставьте дополнительную команду Capture в рамках этапа Захват цикла. Выберите Capture 1 панель; отменить решение регистрации в качестве переменной и имя решения захвата 1 (GST-TZ). Набор времени контакта 60 с при скорости потока 5 мкл / мин и заданной траектории потока ко второму. Выберите Capture 2 панели; отменить решение регистрации в качестве переменной и имя решения захвата 2 (NP-TCO). Набор времени контакта до 90 секунд при скорости потока 5 мкл / мин иустановить путь потока в секунду. Выберите Capture 3 панели; отменить решение регистрации в качестве переменной и имя решения захвата 3 (AP1497-TZ). Набор время контакта до 180 сек при скорости потока 5 мкл / мин и установить пути потока ко второму.
  2. Выберите Запустите программу установки и установить путь потока для: 2-1. Выбор следующего раза. Место решение флаконов в реагента стойке 2 и серии разведений в 96-луночный планшет убедившись, чтобы соответствовать позиции с списке содержимого. Сохранить шаблон метод и начать связывания анализа. Данные Кинетическая анализа представлены на рисунке 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Данные и цифры были адаптированы из работы 8.

Эффективное обратимым иммобилизация биологически активных малых молекул с контролем над ориентации и плотности играет ключевую роль в разработке новых приложений биосенсора. Используя быстрый bioorthogonal реакции между ТШО и Tz, мы опишем метод для поэтапного монтажа и регенерации лигандов поверхностей с сохранением биологической активности. Рисунок 2 показывает в режиме реального времени мониторинг Tz-BnNH 2 иммобилизации. Раствор GST-TCO впрыскивается в течение предварительно иммобилизованным поверхности анти-GST в результате ~ 400 RU расти в ответ. Вторую инъекцию с TZ-BnNH 2 показывает быстрый ~ 15 RU рост ответ. Нет диссоциация дериватизированного антигена не наблюдается после переключения на рабочем буфере обеспечения доказательств для устойчивости структуры. Поверхность регенерируют на последней стадии цикла, с тем чтобы несколько циклов захват-циклоприсоединения. НамING эту процедуру и замена Tz-BnNH 2 фрагмент с молекулой AP1497-TZ генерирует биологически активный поверхность, используемый для исследований взаимодействия с целевой FKBP12 (рис. 5). Нарушение взаимодействия антитело / антиген (как показано на фиг.2) регенерирует поверхность анти-GST, позволяя новый молекулярный сборка должны быть построены. В этом случае впрыск GST-Tz (захват ~ 800 RU) следует с инъекцией NP-TCO (циклоприсоединения ~ 600 RU), эффективно иммобилизации наночастиц к поверхности датчика (рис. 3). Непрореагировавший TCO группы на НП доступны для циклоприсоединения с введенного Tz-BnNH 2 (~ 22 RU). Кроме того, AP1497-TZ используется для мониторинга функциональными наночастиц FKBP12 взаимодействия (рис. 5). Нет диссоциация многокомпонентных структур (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) наблюдаются обеспечения доказательств для устойчивости структуры и биологической активности (AP1497-Tz/FKBP12 бinding).

С возможностями для реального времени иммобилизации (циклоприсоединение) мониторинга реакции и регенерации поверхности, просто характеристика скорости ассоциации K (скорость циклоприсоединение) осуществляется, как показано на рисунке 4. Знание кинетики реакции содержит рекомендации по регулирования плотности иммобилизации (контакт времени и концентрации), важный параметр для биосенсоров анализов. Потребители инъекционных возрастающих концентраций TZ-BnNH 2 или NP-ТШО в двух экземплярах по НДС-ТШО или GST-TZ поверхностей, соответственно, порождает привязки данных (красные линии). Данные по связыванию для двух последовательных образцов анализируемого вещества той же концентрации по сравнению с аналогичным поверхности почти наложимо отражает минимальную потерю антитела связывающей способности из-за многочисленных циклов захвата-циклоприсоединения и регенерации. Пробном обеспечивает наиболее подходящую кинетические анализы (черные линии ) для Cскорости реакции ycloaddition К показано на рисунке 4.

Рисунок 1
Рисунок 1. Bioorthogonal стратегия сопряжения для обратимого иммобилизации дериватизированных молекул. А. [4 +2] циклоприсоединения между транс-циклооктена (TCO) и 1,2,4,5-тетразина (TZ) фрагменты, чтобы дать 1,4-дигидропиридазин аддукта . Б. Экспериментальная схема для обратимого иммобилизации Tz / TCO помечены молекулы. С. Экспериментальная схема для обратимого наночастиц иммобилизации и функциональных групп. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

мг Первоначально "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2.jpg" альт = "Рисунок 2" FO: содержание-шир = "4.5in" FO: Пребывание "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2highres.jpg" />
Рисунок 2. . Мониторинг в реальном времени иммобилизации малой молекулы 1) Исходные данные:. Предварительно иммобилизованные анти-GST 2) Захват введенного GST-TCO анти-GST антителом (Т = 0-420 сек), с последующей инъекцией рабочем буфере (т . = 420-540 сек) проявляя настойчивость взаимодействия 3) Циклоприсоединение между захваченного GST-ТШО и тетразин (Tz-BnNH 2; ~ 15 RU нарастания в ответ, Т = 540-1,140 сек). Нет спад сигнала не происходит, несмотря коммутации подвижной фазы в рабочем буфере (Т = 1,140-1,820 сек). 4) Регенерацию поверхности анти-GST с 2 короткими инъекций 10 мМ глицина, рН 2,1 (Т = 1,820-2,000 сек).

"FO: SRC =" / files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3. Мониторинг в реальном времени из наночастиц иммобилизации и функциональных групп. 1) Базовый. 2) Захват введенного GST-Tz (Т = 0-60 сек). 3) Циклоприсоединение между захваченного GST-TZ и вводили NP-TCO (т = 135-195 сек), с последующей инъекцией проточном буфере, не распада в сигнала (Т = 195-300 сек). 4) циклоприсоединения между иммобилизованным NP-TCO и вводили TZ-BnNH 2 (~ 22 RU восход в ответ, T = 300-360 с). Там нет спад сигнала, несмотря на переключение подвижной фазы в рабочем буфере (Т = 360-480 сек) предоставление доказательств стабильности многокомпонентной.

Рисунок 4
Рисунок 4. Представительства сенсограмм показывающие бinding данных (красные линии) и кинетические анализы (черные линии) для реакции циклоприсоединения между Tz и ТШО помечены молекулы в присутствии или в отсутствие 100% FBS. Таблица суммирует константы ассоциации (циклоприсоединение) скорости, к.

Рисунок 5
Рисунок 5. SPR исследования малых молекул / белковых взаимодействий в различных конфигурациях (TOP) синтетических производных FK 506. AP1497 и AP1497-TZ. Из таблицы видно, кинетическая и константы равновесия курса, полученные из обязательных данных. Данные из экспериментов по связыванию, где белок иммобилизованных (т.е. традиционные SPR эксперимента) включены для сравнения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод захвата-циклоприсоединения описано здесь позволяет быстро, обратимые иммобилизации модифицированных наночастиц и малых молекул для чипа на основе взаимодействия без наклеек и кинетических исследований. Протокол иммобилизации может быть выполнена в течение нескольких минут, требующих <10 мкМ концентрации низкомолекулярных лигандов. Модулируя концентрации лиганда и плотности иммобилизации время контакта может быть тщательно контролируется. Наши данные показывают, что на кристалле bioorthogonal реакции сохранить способность в точке, функционализованных наночастиц или иммобилизованных малых молекул взаимодействовать со своими целями. Мы также характеризуется бимолекулярные цены циклоприсоединения между двумя малыми молекулами, (ТШО и TZ) с низким молекулярным весом. Мы предполагаем, что подобные тесты могут быть выполнены, чтобы измерить и сравнить цены на других быстрых bioorthogonal реакций.

Реверсивный, непрерывный поток на-чипе иммобилизации наночастиц и на месте функционализацию пр.ovides быстрый доступ к различным модифицированных наночастиц для скрининга и анализа взаимодействия всех в том же эксперименте. 13-15 по сравнению с обычными синтеза наночастиц, которая требует различных шагов для очистки, иммобилизации и скрининга, наш метод значительно снижает входные количество биоматериалов, растворители и реагенты, одновременно уменьшая экологические проблемы, касающиеся использования наночастиц и утилизации. 16 Важно отметить, что наночастицы реакции функционализации являются устойчивыми в присутствии концентраций в сыворотке крови, обычно используемых для культивирования клеток экспериментов, и даже очень высокие концентрации в сыворотке. Эта особенность может облегчить отношения структура-активность на проектирование наночастиц в присутствии сыворотки (который может влиять на белок короны и поверхностные свойства наночастицы). 17,18

В большинстве SPR анализов, где белок небольшие молекулы взаимодействия изучаются, белок (лиганд) являетсяиммобилизованы посредством аффинной метки (GST, биотин и т.д.) или посредством ковалентных амидных связей. Аналит затем перешел лиганда, где связывание приводит отклонения в ходе массового поверхности, которые обнаруживаются как изменения показателя преломления. Реверсивный каноническую ориентацию SPR и иммобилизации малую молекулу в удобном и обратимым образом обеспечивает поспешное доступ для изучения прямого связывания растворимых высокомолекулярных целей, а также уточняет поэтапного специфического (иммобилизованного против растворимых) артефактов. 19,20 Аналитические форматы этого типа особенно ценны для ингибирования и конкуренции исследований. 21 Восстановление ориентации также может быть выгодным по нескольким обстоятельствам, то есть) с аналитов с низкой молекулярной массой, учитывая, что связывание сигнал пропорционален поверхности изменение массы б) агрегации и неспецифичности гидрофобных аналитов 22 устраняется делает анализ данных проста в) характеристика высоких связующих сродства можетбыть сложным из-за длительных сроках пребывания (замедлить отходящих цены, особенно при работе с ингибиторами ковалентных) 23, а также необходимость для поверхностных условиях регенерации в рамках подготовки к следующему циклу анализ г) регенерации агенты должны оказывать отрицательного воздействия на структуру или функцию иммобилизованных белков.

Включив bioorthogonal метод захвата-циклоприсоединения как часть нашей стратегии иммобилизации, мы обходим некоторые из трудностей, связанных с традиционными методами иммобилизации маленькая молекула. Они требуют более высокие концентрации лиганда с электростатические достопримечательностей, ведущие к поверхность, предварительно концентрации, характерные для протоколов иммобилизации белков являются неэффективными с малых молекул. Соответственно, возрастающих концентраций лигандов приводит к увеличению соотношения органического сорастворителя для лиганда растворения. Оба эти условия не совместимы с микро-жидкостных систем потока и, как следствие, обычные яmmobilizations должны выполняться вне векселя, где мониторинг в реальном времени не представляется возможным. 24 Наконец, в случае успешного обычной иммобилизации, ковалентная модификация поверхность препятствует регенерации поверхности и ограничивает экспериментальную диапазон биосенсора поверхностей приводит к увеличению инвестиций в времени, усилий и расходы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgements

Мы признаем, финансирование из NIH (NHLBI Договор № HHSN268201000044C чтобы RW, SH и SYS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. Edition AB, (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats