Mikroflödes On-chip Capture-cykloadditionsreaktion att reversibelt Immobilisera små molekyler eller flerkomponent Strukturer för Biosensor Applications

Published 9/23/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi presenterar en metod för snabb, reversibel immobilisering av små molekyler och funktionnanopartiklar församlingar för ytplasmonresonans (SPR) studier, med hjälp av sekventiell on-chip bioorthogonal cykloadditionen kemi och antikropp-antigen-capture.

Cite this Article

Copy Citation

Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Metoder för snabb yta immobilisering av bioaktiva små molekyler med kontroll över riktning och immobilisering densitet är mycket önskvärt för biosensor och microarray applikationer. I denna studie använder vi en mycket effektiv kovalent bioorthogonal [4 +2] cykloadditionsreaktion mellan trans cyklookten (TCO) och 1,2,4,5-tetrazin (Tz) för att göra det möjligt för mikroflödes immobilisering av TCO / Tz-deriverade molekyler . Vi övervakar processen i realtid under kontinuerliga flödesförhållanden med hjälp av ytplasmonresonans (SPR). För att möjliggöra reversibel immobilisering och utvidga den experimentella intervallet sensorytan kombinerar vi en icke-kovalent antigen-antikroppsinfångningskomponenten med cykloadditionsreaktionen. Genom att växelvis presentera TCO eller Tz delarna till sensorytan, flera capture-cykloadditionsreaktioner processer är nu möjligt på en sensoryta för on-chip montering och interaktionsstudier av olika strukturer flera komponenter. Vi illustrate denna metod med två olika immobilisering experiment på ett biosensorchip, en liten molekyl, AP1497 som binder FK506-bindande protein 12 (FKBP12), och samma liten molekyl som en del av en immobiliserad och in situ-funktionaliserade nanopartiklar.

Introduction

Effektiva konjugeringsreaktioner är värdefulla verktyg för att fästa bioaktiva molekyler till ytor för olika biotekniska tillämpningar. Nyligen har det mycket snabbt bioorthogonal [4 +2] cykloadditionsreaktion mellan trans cyklookten (TCO) och 1,2,4,5-tetrazin (Tz) använts för att märka cellytor, subcellulära strukturer, antikroppar och nanopartiklar 1. - 7 Här använder vi [4 +2] cykloadditionsreaktion i kombination med antigen / antikropps capture (GST / anti-GST) för reversibel on-chip syntes av strukturer flerkomponents för ytplasmonresonans (SPR) interaktionsanalys och övervaka processen i realtid (figur 1). 8,9 Särskilt möjliggör avskiljning-cykloadditionen strategi yta regeneration med hjälp av ett etablerat protokoll. 8 Som en följd, montering av stabila sensorytor med kontroll över ligand orientering och densitet för olika nya analysen format är nu möjligt. Användadenna strategi vi visar immobilisering av TCO / Tz-derivatiserade små molekyler och karakterisera cykloadditionsreaktioner satser i en mängd olika buffertbetingelser. Vi valde den välkända växelverkan mellan FKBP12 och en molekyl AP1497 som binder FKBP12 10-12 som ett exempel för att kontrollera att den fångst-cykloadditionen strategi bevarar möjligheten för den lilla molekylen att interagera med sitt mål när antingen direkt ansluten till immobiliserade GST antigener eller till immobiliserade nanopartiklar (NPS).

Denna metod har flera fördelar. För det första är det nu möjligt att reversibel immobilisering av små molekyler på sensorchips. För det andra, TCO / Tz immobilisering av små molekyler kan också märkningsfria interaktionsstudier som omvänd orientering kanoniska SPR studier, och kan ge en kompletterande bild av en bindande interaktion. För det tredje tillåter denna metod mikroflödes syntes av riktade nanopartiklar, och omedelbar utvärdering av deras binding egenskaper. Detta lovar att effektivisera utvärdering eller screening riktade nanopartiklar, och även minska mängden av nanopartiklar som krävs. 13-15 fjärde kan detta tillvägagångssätt mäta reaktions kinetik bioorthogonal cykloadditionsreaktioner i realtid under kontinuerligt flöde. Slutligen är TCO / Tz immobilisering kemi robust i närvaro av serum. Sammantaget räknar vi med att denna mångsidiga tillvägagångssätt i stort sett kommer att underlätta byggandet av stabila sensorytor för en mängd olika mikroflödes studier med relevans för in vitro och in vivo cellulära applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av GST och nanopartiklar (NP) konjugat

  1. GST-TCO preparatet:
    1. Lägg 8 pl av TCO-NHS-lösning (50 mM i DMSO) till 100 | il av GST (1 mg / ml i PBS) och skaka blandningen vid RT under 1 timme.
    2. Avlägsna överskottsreagens med hjälp av en Zebran spin avsaltningskolonn. Det utvunna filtratet innehållande GST-TCO Konjugatet lagrades vid 4 ° C före användning.
  2. GST-Tz preparatet:
    1. Lägg 6 pl av Tz-NHS-lösning (25 mM i DMF) till 75 ul av GST (1 mg / ml i PBS) och skaka blandningen vid RT under 1 timme.
    2. Späd reaktionsblandningen med 25 | il PBS och renades med användning av en spinn-avsaltningskolonn. Filtratet innehållande GST-Tz Konjugatet lagrades vid 4 ° C före användning.
    OBS: Mass analyser (MALDI-TOF) visade att i genomsnitt ~ 10 Tz eller TCO molekyler konjugerade till GST.
  3. NP-TCO preparatet:
    1. Tillsätt 100 l av TCO-NHS-lösning (50 mM i DMSO) till150 | il av aminerad nanoparticle (NP-NH2, 8,7 mg Fe / ml i PBS, 3 nm järnkärna ~ 8000 Fe / NP) och skaka blandningen vid RT under 1 timme.
    2. Avlägsna överskottet av reagens genom gelfiltrering med användning av en NAP-10 kolonn eluerad med PBS-buffert. Samla det färgade bandet innehåller NP-TCO produkt.
    3. Koncentrera filtratet till en slutlig volym av ~ 150 | il med hjälp av en centrifugal-filteranordning (100 K MWCO).
    4. Lägg 50 pl bämstensyraanhydrid, (0,1 M i DMSO) till NP-TCO-lösning och skaka vid rumstemperatur i 1 timme (anhydrid reagerar med eventuella kvar aminer för att bilda terminala karboxylsyror. Detta förhindrar ospecifika interaktioner med dextran yta).
    5. Rena den NP-TCO produkt med användning av en NAP-10-kolonn och eluerades med PBS. Förvara lösning av NP-TCO vid 4 ° C före användning.

2. Ytbehandling

Alla ytplasmonresonans analyser utförs på en Biacore T100 instrument (GE Healthcare) på25 ° C med användning av ett CM5-sensorchip och PBS-P som löpbufferten inget annat anges. Biacore kontroll och utvärderingsprogram som medföljer instrumentet används för att sätta upp experiment och analysera data. Två driftlägen, applikations guider och manuell körning kommer att användas för beredning och uppföljning yta on-chip capture-cykloadditionen. Metoden byggare förfaranden kommer att användas för att inrätta omvända orientering bindningsförsök och för att mäta cykloadditionsreaktioner reaktionshastigheter. Data är dubbel referens subtraheras och kinetiska analyser utförs med en 1:1 Langmuir bindande modell.

  1. Använd amin immobilisering guiden mall och välj immobilisering på Flow celler 1 (referens) och 2 (detektion). Modifiera amin metod för att aktivera ytan karboxylgrupper genom injektion av en 1:01 lösning av 0,4 M EDC: 0,1 M NHS för 480 sekunder vid en flödeshastighet av 10 pl / min. Ställ injektion av etanolamin för att släcka återstående aktiverade estrar till 420 sek kontakttid påen flödeshastighet av 10 pl / min.
  2. Inmatnings ligand namn, anti-GST (18 ng / ml i acetatbuffert, pH 5,0) och inställd på att injicera under en kontakttid av 420 sek vid en flödeshastighet av 10 pl / min.
  3. Placera flaskorna krävs lösning i reagensställ 2 och se till att matcha positioner med innehållslistan. Spara och starta immobilisering.
    Notera: Köra immobilisering guiden på detta sätt leder till anti-GST immobilisering nivåer i intervallet ~ 14.000 till 17.000 RU.
  4. Redigera immobilisering guiden för att endast injicera GST-ligand (20 | ig / ml) lösning till 420 sek vid 5 | il / min under referens Flödescell 1.

3. Övervakning On-chip Capture-cykloaddition av Functionalized Molekyler

  1. Övervakning på-chip capture-cykloadditionen i realtid (figur 2).
    1. Placera GST-TCO (20 pg / ml), Tz-BnNH 2 (10 pM) och regenerering (10 mM glycin, pH = 2,0)-lösning flaskorna i reagensställningen 2. Välj mannenUAL run metod, ställa flödet till 5 l / min och flödesvägen till Flow cell 2.
    2. Injicera lösningen av GST-TCO för 420 sek.
    3. Injicera lösningen av Tz-BnNH 2 för 600 sek.
    4. Regenerera ytan med två 30 sek injektioner av regenereringslösning.
  2. Övervakning på-chip montering av flerkomponents strukturer i realtid (Figur 3):
    1. Placera GST-Tz (20 pg / ml), NP-TCO (100 ug Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 pM) och regenerering (10 mM glycin, pH = 2,0)-lösning flaskorna i reagensställningen 2. Markera instrumentet manuella metoden run, ställ in flödet till 5 l / min och flödesvägen till Flow cell 2.
    2. Injicera en lösning av GST-Tz för 60 sek.
    3. Injicera en lösning av NP-TCO för 60 sek.
    4. Injicera en lösning av Tz-BnNH 2 för 60 sek.
    5. Regenerera ytan med två 30 sek injektioner av regenereringslösning.

4. MPPFÖLJNING Immobilisering Densitet och Fastställande av Cykloaddition priser

  1. Karakterisering av små molekyler cykloadditionen reaktionshastigheter (Figur 4).
    1. Välj nya metod och ingångs allmänna parametrar. I analyssteg panelen skapa ett nytt steg och kalla den Sample. Ställ Syfte och Anslut grundinställningar till prov.
    2. I cykeln Typer panelen Skapa en ny cykel steg och sätt följande kommandon, Capture, Sample, Regeneration 1 och Regeneration 2.
    3. Välj kommandot Capture, ingång ligand namn (GST-TCO, 20 mikrogram / ml), kontakttid 120 sek vid 5 l / min och ställa flödesväg till: Second. Välj kommandot Sample, ingång 180 sek kontakttid, 60 sek dissociation tid, 30 l / min flöde och inställt flödesväg till: Båda. Välj Regeneration 1-kommandot, ingång regenerelösning namn (10 mM glycin-HCl pH 2,0), kontakttid på 30 sek vid 30 l / min och ställa flödesväg till: Second. Upprepa samma sak för Regeneration 2 kommandot. </ Li>
    4. Välj Kör Setup och ställer flödesväg till: 2-1. Välj nästa och fylla prov lista med analytlösning (Tz-BnNH 2) och koncentration serien (0.3-10 ^ M, 1:02 utspädning). Välj bredvid rack läge panel. Placera lösningsflaskor i reagensställ 2 och spädningsserie i 96-brunnar och se till att matcha positioner med innehållslistan. Spara metod mall och börja bindningsanalys. Bindningsdata och kinetisk analys visas i Figur 4.
  2. Karakterisering av NP cykloadditionen reaktionshastigheter (Figur 4).
    1. Öppna den sparade metoden mallen från ovan och ändra följande parametrar. Välj Capture panel, förändring ligand namn till GST-Tz, 20 mikrogram / ml. Välj Sample panel, förändring kontakttid till 120 sek kontakttid och dissociation tid till 120 sek.
    2. Välj provlistan, ändra analyt till NP-TCO och koncentrationsserie (7-224 nM, 1:02 utspädning). Placera lösningsflaskor i reagensställ2 och spädningsserie i 96-brunnar och se till att matcha positioner med innehållslistan. Spara metod mall och börja bindningsanalys. Bindningsdata och kinetisk analys visas i Figur 4.

5. Att mäta bindningen av FKBP12 till Immobiliserat AP1497

Reversed-orienteringsbindningsstudier anställa FKBP12 som analyt och förening AP1497 som immobiliserad ligand (figur 5). Den allmänna metoden för denna analys är inställd på följande sätt med hjälp av metoden builder verktyg:

  1. Välj nya metod och ingångs allmänna parametrar. I analyssteg panelen skapar och namn Capture, Sample och Regeneration steg. Välj motsvarande Syfte och Connect grundinställningar.
  2. Välj cykel Typer panelen och skapa 3 cykel steg: Capture, Sample och förnyelse.
  3. Infoga kommandot Capture två gånger i Capture cykelsteg. Välj Capture 1 panel och välj fånga lösning som variable, uppsättning kontakttiden till 300 sekunder vid en flödeshastighet av 5 | il / min och inställd flödesväg till: Second. Välj Capture 2 panelen och välj fånga lösning som variabel, ange kontakttiden till 250 sek med en flödeshastighet av 5 ml / min och ställa flödesväg till: Second.
  4. Sätt kommandot Prov under provcykeln steg. Markera provpanel; uppsättning kontakttiden till 60 sek, dissociation tid till 200 sekunder vid en flödeshastighet av 30 ul / min och inställd flödesväg till: Båda.
  5. Sätt kommandot Regeneration två gånger under regenerecykelsteg. Välj Regeneration 1 panel, ingång regenerelösning namn (10 mM glycin-HCl pH 2,0), kontakttid på 30 sek vid 30 l / min och ställa flödesväg till: Second. Upprepa samma sak för Regeneration 2 panelen.
  6. Välj Kör Setup och ställer flödesväg till: 2-1. Välj nästa och input capture lösning namn (GST-TCO och AP1497-Tz), provnamn (FKBP12), serie koncentration (0,020 till 5 mikrogram / ml, spädning 1:2) och MW (13.000). Placera lösningsflaskor i reagent rack 2 och spädningsserie i 96-brunnar och se till att matcha positioner med innehållslistan. Spara metod mall och börja bindningsanalys. Uppgifter kinetisk analys visas i Figur 5.

6. Att mäta bindningen av FKBP12 till AP1497 Bifogat till Immobilized NPs

Den allmänna metoden för nanopartiklar immobilisering, liten molekyl derivatisering och FKBP12 bindningsanalys sätts upp på följande sätt med hjälp av metoden builder verktyg:

  1. Öppna den sparade metoden mallen från ovan och ändra. Sätt i en extra kommando Capture i Capture cykelsteg. Välj Capture 1 panel, avmarkera fånga lösning som variabel och namn fånga lösning 1 (GST-Tz). Fasta kontakttiden till 60 sekunder vid en flödeshastighet av 5 | il / min och inställd flödesväg till det andra. Välj Capture 2 panel, avmarkera fånga lösning som variabel och namn fånga lösning 2 (NP-TCO). Fasta kontakttiden till 90 sekunder vid en flödeshastighet av 5 | il / min ochinställd flödesväg till andra. Välj Capture 3 panel, avmarkera fånga lösning som variabel och namn fånga lösning 3 (AP1497-Tz). Fasta kontakttiden till 180 sekunder vid en flödeshastighet av 5 | il / min och inställd flödesväg till det andra.
  2. Välj Kör Setup och ställer flödesväg till: 2-1. Välj Nästa två gånger. Placera lösningsflaskor i reagensställ 2 och spädningsserie i 96-brunnar och se till att matcha positioner med innehållslistan. Spara metod mall och börja bindningsanalys. Uppgifter kinetisk analys visas i Figur 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data och siffror har anpassats efter referens 8.

Effektiv reversibel immobilisering av bioaktiva små molekyler med kontroll över riktning och täthet spelar en nyckelroll i utvecklingen av nya biosensorapplikationer. Med användning av snabb bioorthogonal reaktionen mellan TCO och Tz, beskriver vi en metod för en stegvis montering och regenerering av ligand-ytor med retention av biologisk aktivitet. Figur 2 visar realtidsövervakning av Tz-BnNH 2 immobilisering. En lösning av GST-TCO sprutas över en förut immobiliserad anti-GST yta vilket resulterar i ~ 400 RU ökning av svar. En andra injektion med Tz-BnNH 2 visar ett snabbt ~ 15 RU stigande svar. Ingen dissociation av derivatiserade antigenet observerats efter byte att köra buffert som ger belägg för struktur stabilitet. Ytan regenereras i det sista steget i cykeln för att möjliggöra flera capture-cykloadditionsreaktioner cykler. Usning detta förfarande och byte av Tz-BnNH 2-delen med AP1497-Tz molekyl genererar en bioaktiva yta som används för interaktionsstudier med sitt mål FKBP12 (Figur 5). Rubbning av antikropp / antigen-interaktion (såsom visas i figur 2) regenererar anti-GST-ytan, vilket gör att en ny molekylär aggregatet byggas. I detta fall är ett GST-Tz injektion (infångning av ~ 800 RU) följt en injektion med NP-TCO (cykloaddition ~ 600 RU), vilket effektivt immobilisera nanopartikeln till sensorytan (figur 3). Oreagerat TCO-grupper på NP är tillgängliga för cykloaddition med injicerat Tz-BnNH 2 (~ 22 RU). Alternativt är AP1497-Tz användas för att övervaka functionalized nanopartikel-FKBP12 interaktioner (figur 5). Ingen dissociation av de flerkomponentstrukturer (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) observeras fram bevis för struktur stabilitet och biologisk aktivitet (AP1497-Tz/FKBP12 bINDANDE).

Med funktioner för realtids immobilisering (cykloadditionen) reaktionsövervakning och yta regeneration, den enkla karakterisering av föreningens hastigheten k a (cykloadditionen ränta) sker enligt Figur 4. Kunskap om reaktionskinetik ger riktlinjer för kontroll av immobilisering densitet (kontakttid och koncentration), en viktig parameter för biosensoranalyser. Injektion av ökande koncentrationer av Tz-BnNH 2 eller NP-TCO i två exemplar över GST-TCO eller GST-TZ ytor, respektive, genererar bindningsdata (röda linjer). Bindnings data för två sekventiella analyt prover av samma koncentration över samma yta är nästan överlagrings avspeglar minimal förlust av antikroppsbindande förmåga på grund av flera cykler av capture-cykloadditionen och förnyelse. Utvärderings programvara ger de mest fit kinetiska analyser (svarta linjer ) för cycloaddition reaktionshastigheter k en visas i fig 4.

Figur 1
Figur 1. Bioorthogonal konjugering strategi för reversibel immobilisering av derivatiserade molekyler. A. [4 +2] cykloadditionsreaktion mellan trans cyklookten (TCO) och 1,2,4,5-tetrazin (Tz)-grupper för att ge den 1,4-dihydropyridazine addukt . B. Experimentell system för reversibel immobilisering av Tz / TCO märkta molekyler. C. Experimentell system för reversibel nanopartikel immobilisering och funktionalisering. Klicka här för att visa en större bild .

mg src = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2.jpg" alt = "Bild 2" fo: innehåll-width = "4.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50772/50772fig2highres.jpg" />
Figur 2. Realtidsövervakning av små molekyler immobilisering 1) Baseline:.. Pre-immobiliserade anti-GST 2) Fånga av injicerad GST-TCO med anti-GST antikropp (t = 0 till 420 sekunder), följt av injektion av löpande buffert (t . = 420-540 sek) visar ihållande interaktion 3) Cykloaddition mellan fångade GST-TCO och tetrazin (Tz-BnNH 2; ~ 15 RU stigande respons, t = 540-1,140 sek). Ingen signal sönderfall inträffar trots att växla den mobila fasen till rinnande buffert (t = 1,140-1,820 sek). 4) Regenerering av anti-GST-yta med två korta injektioner av 10 mM glycin, pH 2,1 (t = 1,820-2,000 sek).

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50772/50772fig3highres.jpg "/>
Figur 3. 1 realtidsövervakning av nanopartiklar immobilisering och funktionalisering.) Baseline. 2) Fånga av injicerad GST-Tz (t = 0-60 sek). 3) Cykloaddition mellan fångade GST-Tz och injicerade NP-TCO (t = 135-195 sek), följt av injektion av rinnande buffert utan någon försämring i signal (t = 195 till 300 sekunder). 4) Cykloaddition mellan immobiliserad NP-TCO och injicerades Tz-BnNH 2 (~ 22 RU stigande gensvar, t = 300 till 360 sek). Det finns ingen signal decay trots omkoppling den mobila fasen till rinnande buffert (t = 360 till 480 sek) tillhandahålla bevis för flerkomponentstabilitet.

Figur 4
Figur 4. Representativa sensorgrammen visar bINDANDE data (röda linjer) och kinetiska analyser (svarta linjer) för cykloadditionsreaktionen mellan Tz och TCO taggade molekyler i närvaro eller frånvaro av 100% FBS. tabellen sammanfattas association (cykloaddition) hastighetskonstanter, k a.

Figur 5
Figur 5. SPR studier av små molekyler / protein-interaktioner i olika konfigurationer (Top) Syntetiska derivat av FK506:. AP1497 och AP1497-Tz. Tabellen visar kinetiska och jämviktskonstanter härledda från bindningsdata. Data från bindningsexperiment där proteinet immobiliserade (dvs. traditionella SPR experiment) ingår för jämförelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fångst-cykloadditionen metod som beskrivs här möjliggör snabb, reversibel immobilisering av modifierade nanopartiklar och små molekyler för etikett-fri chip-baserad interaktion och kinetiska studier. Immobiliseringen protokoll kan utföras på några minuter som kräver <10 pM koncentrationer av småmolekylära ligander. Genom att modulera ligand koncentration och kontakttid immobilisering tätheter kan kontrolleras noga. Våra data visar att on-chip bioorthogonal reaktioner bevara möjligheten för in situ funktionaliserade nanopartiklar eller immobiliserade små molekyler för att interagera med sina mål. Vi har också karakteriseras bimolekylära cykloadditionsreaktioner priser mellan två små molekyler, (TCO och Tz) med låg molekylvikt. Vi ser framför oss att liknande analyser kan utföras för att mäta och jämföra priser för andra snabba bioorthogonal reaktioner.

Vändbar, kontinuerligt flöde på-chip nanopartikel immobilisering och in-situ funktion provides snabb tillgång till en mängd av modifierade nanopartiklar för screening och interaktionsanalys i samma experiment. 13-15 Jämfört med konventionell nanopartiklar syntes, vilket kräver olika steg för rening, immobilisering och screening, vår metod minskar avsevärt Insatsmängderna av biomaterial, lösningsmedel och reagenser, samtidigt minskar miljöhänsyn som behandlar nanopartiklars användning och avfallshantering. 16 Viktigt nanopartiklar funktion reaktioner är stabila för att närvaron av serumkoncentrationer som vanligtvis används för cellkulturexperiment, och även för extremt höga serumkoncentrationer. Denna funktion kan underlätta struktur-aktivitetssamband för nanopartiklar design i närvaro av serum (som kan påverka protein corona och ytegenskaper hos nanopartiklar). 17,18

I de flesta SPR-analyser, där protein-interaktionen mellan små molekyler studeras, är det protein (ligand)immobiliseras genom en affinitetsmarkör (GST, biotin, etc.) eller genom kovalenta amidbindningar. Analyten sedan över liganden då bindande resultat i ytan massvariationer, som detekteras som brytningsindexförändringar. Att vända den kanoniska SPR orientering och immobilisera den lilla molekylen på ett bekvämt och reversibelt sätt ger facile tillgång att studera direkt bindning av lösliga makromolekylära mål och förtydligar fas-specifika (immobiliserade vs lösliga) artefakter. 19,20 Analys format av denna typ är särskilt värdefullt för hämning och konkurrensstudier. 21 Återföring av orientering kan också vara fördelaktigt under flera omständigheter, det vill säga a) med analyter med låg molekylvikt, med tanke på att bindande signalen är proportionell mot ytan massförändringar b) aggregering och icke-selektivitet av hydrofoba analyter 22 elimineras göra dataanalys okomplicerad c) karakterisering av hög affinitet bindemedel kanvara en utmaning på grund av långa uppehållstider (långsam off-priser, speciellt när det handlar om kovalenta hämmare) 23 och behovet av yt-regenereringsförhållanden i förberedelse för nästa analyscykel d) regenereringsmedel kan ha nedbrytande effekter på struktur eller funktion immobiliserat protein.

Genom att införliva den bioorthogonal capture-cykloadditionen metod som en del av vår immobilisering strategi, kringgår vi några av de svårigheter som är förknippade med konventionella liten molekyl immobiliseringstekniker. Dessa kräver mycket högre ligandkoncentrationer eftersom elektrostatiska attraktioner som leder till ytan pre-koncentrationer som är typiska för protein immobilisering protokoll är ineffektiva med små molekyler. Följaktligen ökande koncentrationer av ligander leder till en ökande förhållanden av organiskt samlösningsmedel för ligand upplösning. Båda dessa tillstånd är inte kompatibla med mikrofluidiska flödessystem och som en konsekvens, konventionell immobilizations måste utföras utanför instrumentet där realtidsövervakning är inte möjlig. 24 Slutligen, i händelse av en framgångsrik konventionell immobilisering, förhindrar kovalent ytbearbetning ytan förnyelse och begränsar den experimentella olika biosensorytor som leder till ökade investeringar i tid, ansträngning och kostnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Vi erkänner finansiering från NIH (NHLBI Kontrakt nr HHSN268201000044C att RW, SH och SYS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. Edition AB, (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats