Reversibly छोटे अणुओं या Biosensor अनुप्रयोगों के लिए बहु घटक संरचनाएं स्थिर microfluidic पर चिप कब्जा cycloaddition के रिएक्शन

Published 9/23/2013
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Chemistry

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Summary

हम अनुक्रमिक पर चिप bioorthogonal cycloaddition के रसायन शास्त्र और एंटीबॉडी प्रतिजन कब्जा का उपयोग, छोटे अणुओं की तेजी, प्रतिवर्ती स्थिरीकरण और सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) के अध्ययन के लिए क्रियाशील nanoparticle विधानसभाओं के लिए एक तरीका मौजूद है.

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Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., et al. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

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Abstract

अभिविन्यास और स्थिरीकरण घनत्व पर नियंत्रण के साथ bioactive छोटे अणुओं की तेजी से सतह स्थिरीकरण के लिए तरीके biosensor और माइक्रोएरे अनुप्रयोगों के लिए अति आवश्यक हैं. इस अध्ययन में, हम TCO / TZ-derivatized अणुओं की microfluidic स्थिरीकरण सक्षम करने के लिए एक अत्यधिक कुशल सहसंयोजक bioorthogonal पार cyclooctene (TCO) के बीच [4 2] cycloaddition प्रतिक्रिया और 1,2,4,5-tetrazine (Tz) का उपयोग करें . हम सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) का उपयोग निरंतर प्रवाह परिस्थितियों में वास्तविक समय में प्रक्रिया की निगरानी. प्रतिवर्ती स्थिरीकरण सक्षम और सतह सेंसर की प्रयोगात्मक सीमा का विस्तार करने के लिए, हम cycloaddition प्रतिक्रिया के साथ एक गैर सहसंयोजक प्रतिजन प्रतिरक्षी कब्जा घटक गठबंधन. बारी - बारी से सेंसर सतह को TCO या Tz moieties पेश करके, एकाधिक कब्जा cycloaddition प्रक्रियाओं बहु घटक संरचनाओं की एक किस्म पर चिप विधानसभा और बातचीत के अध्ययन के लिए एक संवेदक सतह पर अब संभव है. हम मैंएक छोटा सा अणु, FK506 बाध्यकारी प्रोटीन 12 (FKBP12) कि बांध AP1497; दो एक biosensor चिप पर अलग स्थिरीकरण प्रयोगों के साथ इस पद्धति llustrate और एक ही छोटे अणु एक स्थिर और में सीटू-क्रियाशील nanoparticle के हिस्से के रूप में.

Introduction

कुशल संयोजन प्रतिक्रियाओं जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए सतहों को bioactive अणुओं संलग्न करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं. हाल ही में, बहुत तेजी से bioorthogonal पार cyclooctene (TCO) के बीच [4 2] cycloaddition प्रतिक्रिया और 1,2,4,5-tetrazine (Tz) सेल सतहों, subcellular संरचनाओं, एंटीबॉडी और नैनोकणों लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 1. - यहाँ 7, हम सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) बातचीत के विश्लेषण के लिए बहु - घटक संरचनाओं की प्रतिवर्ती पर चिप संश्लेषण के लिए प्रतिजन / एंटीबॉडी कब्जा (जीएसटी / विरोधी जीएसटी) के साथ संयोजन में [4 2] cycloaddition प्रतिक्रिया का उपयोग और निगरानी वास्तविक समय में प्रक्रिया (चित्रा 1). नई परख की विविधता के लिए ligand अभिविन्यास और घनत्व पर नियंत्रण के साथ स्थिर सेंसर सतहों का एक परिणाम, विधानसभा के रूप में 8,9 विशेष रूप से, कब्जा cycloaddition रणनीति एक स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सतह उत्थान में सक्षम बनाता है. 8 स्वरूपों अब संभव है. का प्रयोगइस रणनीति हम TCO / TZ-derivatized छोटे अणुओं के स्थिरीकरण का प्रदर्शन और बफर स्थितियों की एक किस्म में cycloaddition दरों की विशेषताएँ. हम या तो सीधे immobilized जीएसटी एंटीजन को संलग्न जब कब्जा cycloaddition रणनीति अपने लक्ष्य के साथ बातचीत करने के लिए छोटे अणु की क्षमता को बरकरार रखता है, इसकी पुष्टि करने के लिए एक उदाहरण के रूप FKBP12 10-12 कि बांध FKBP12 और एक अणु AP1497 के बीच प्रसिद्ध बातचीत चुना या immobilized नैनोकणों (एनपीएस) के लिए.

यह विधि कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, संवेदक चिप्स पर छोटे अणुओं की प्रतिवर्ती गतिहीनता संभव है. दूसरा, छोटे अणुओं की TCO / Tz स्थिरीकरण भी विहित एसपीआर पढ़ाई के उन्मुखीकरण को उल्टा उस लेबल से मुक्त बातचीत पढ़ाई सक्षम बनाता है, और एक बाध्यकारी बातचीत का एक पूरक दृश्य प्रदान कर सकते हैं. तीसरा, इस विधि लक्षित नैनोकणों के microfluidic संश्लेषण, और उनके bindin का तत्काल मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता हैजी गुण. यह लक्षित नैनोकणों के मूल्यांकन या स्क्रीनिंग की दक्षता में सुधार, और भी आवश्यक नैनोकणों की मात्रा में कमी करने का वादा किया. चौथा 13-15, इस दृष्टिकोण निरंतर प्रवाह के तहत वास्तविक समय में bioorthogonal cycloaddition प्रतिक्रियाओं की प्रतिक्रिया कैनेटीक्स उपाय कर सकते हैं. अंत में, TCO / Tz स्थिरीकरण रसायन विज्ञान सीरम की उपस्थिति में मजबूत है. साथ में ले ली, हम इस बहुमुखी दृष्टिकोण मोटे तौर पर इन विट्रो और इन विवो सेलुलर अनुप्रयोगों में करने के लिए प्रासंगिकता के साथ microfluidic अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए स्थिर सेंसर सतहों के निर्माण की सुविधा करेंगे.

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Protocol

1. जीएसटी और nanoparticle (एनपी) conjugates की तैयारी

  1. जीएसटी TCO तैयारी:
    1. जीएसटी (पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μl को TCO-एनएचएस समाधान के 8 μl (DMSO में 50 मिमी) जोड़ें और 1 घंटे के लिए आरटी पर मिश्रण हिला.
    2. एक Zeba स्पिन desalting स्तंभ का उपयोग अतिरिक्त अभिकर्मक निकालें. जीएसटी TCO संयुग्म युक्त बरामद छानना का उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है.
  2. जीएसटी-TZ तैयारी:
    1. जीएसटी (पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल) की 75 μl के लिए TZ-एनएचएस समाधान के 6 μl (DMF में 25 मिमी) जोड़ें और 1 घंटे के लिए आरटी पर मिश्रण हिला.
    2. पीबीएस के 25 μl के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण पतला और एक स्पिन desalting स्तंभ का उपयोग कर शुद्ध. जीएसटी-TZ संयुग्म युक्त छानना का उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है.
    नोट: मास विश्लेषण (MALDI-TOF) औसतन ~ 10 Tz या TCO अणुओं जीएसटी संयुग्मित थे.
  3. एनपी TCO तैयारी:
    1. को TCO-एनएचएस समाधान के 100 μl (DMSO में 50 मिमी) जोड़ें150 aminated nanoparticle (एनपी एनएच 2, पीबीएस में 8.7 मिलीग्राम फ़े / एमएल, 3 एनएम लोहे की कोर ~ 8000 फ़े / एन पी) के μl और 1 घंटे के लिए आरटी पर मिश्रण हिला.
    2. पीबीएस बफर के साथ eluted एक झपकी-10 कॉलम का उपयोग कर जेल निस्पंदन द्वारा अतिरिक्त अभिकर्मक निकालें. एनपी TCO उत्पाद युक्त रंग का बैंड लीजिए.
    3. एक केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस (100 K MWCO) का उपयोग ~ 150 μl के अंतिम मात्रा को छानना ध्यान लगाओ.
    4. एनपी TCO समाधान करने succinic एनहाइड्राइड के 50 μl, (DMSO में 0.1 एम) जोड़ें और 1 घंटे के लिए आरटी पर हिला (एनहाइड्राइड टर्मिनल कार्बोक्जिलिक एसिड फार्म करने के लिए किसी भी शेष amines के साथ प्रतिक्रिया करता है. इस dextran सतह के साथ अविशिष्ट बातचीत रोकता है).
    5. पीबीएस के साथ eluting एक झपकी-10 कॉलम का उपयोग एनपी TCO उत्पाद शुद्ध. उपयोग करने के लिए पिछले 4 डिग्री सेल्सियस एनपी TCO के समाधान स्टोर.

2. सतह तैयारी

सभी सतह plasmon अनुनाद assays में एक Biacore T100 साधन (जीई हेल्थकेयर) पर प्रदर्शन कर रहे हैं25 डिग्री सेल्सियस चल रहा है बफर के रूप में एक CM5 सेंसर चिप और पीबीएस पी का उपयोग कर जब तक अन्यथा नोट. साधन के साथ आपूर्ति Biacore नियंत्रण और मूल्यांकन सॉफ्टवेयर प्रयोगों की स्थापना और डेटा का विश्लेषण करने के लिए नियोजित कर रहे हैं. दो आपरेशन के मोड, आवेदन जादूगरों और मैनुअल रन सतह तैयारी और निगरानी पर चिप कब्जा cycloaddition के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. विधि बिल्डर मोड रिवर्स उन्मुखीकरण बंधन प्रयोगों की स्थापना के लिए और cycloaddition प्रतिक्रिया दर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. डाटा डबल संदर्भ घटाया और गतिज विश्लेषण एक 1:1 Langmuir बंधन मॉडल का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. प्रवाह कोशिकाओं पर amine स्थिरीकरण विज़ार्ड टेम्पलेट का चयन करें और स्थिरीकरण 1 (संदर्भ) और 2 (पहचान) का प्रयोग करें. 0.4 एम EDC की एक 1:1 समाधान के इंजेक्शन से सतह कार्बोक्जिलिक समूहों को सक्रिय करने के अमाइन विधि सुधारे: 480 सेकंड के लिए 0.1 एम एन एच एस 10 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर. पर 420 सेकंड संपर्क समय के लिए शेष सक्रिय एस्टर बुझाने के ethanolamine इंजेक्शन सेट10 μl / मिनट की एक प्रवाह दर.
  2. इनपुट ligand नाम, विरोधी जीएसटी (एसीटेट बफर, 5.0 पीएच में 18 माइक्रोग्राम / एमएल) और 10 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर 420 सेकंड के साथ संपर्क समय के लिए इंजेक्षन करने के लिए निर्धारित किया है.
  3. सामग्री की सूची के साथ पदों मैच सुनिश्चित बनाने अभिकर्मक रैक 2 में अपेक्षित समाधान शीशियों रखें. सहेजें और स्थिरीकरण शुरू करते हैं.
    नोट: ~ 14,000 17,000 आरयू के रेंज में विरोधी जीएसटी स्थिरीकरण के स्तर में इस तरह के परिणाम में स्थिरीकरण विज़ार्ड चल रहा है.
  4. केवल संदर्भ प्रवाह कक्ष 1 से अधिक 5 μl / मिनट पर 420 सेकंड के लिए (20 माइक्रोग्राम / एमएल) समाधान जीएसटी ligand इंजेक्षन स्थिरीकरण जादूगर संपादित करें.

3. Functionalized अणु की निगरानी पर चिप कब्जा cycloaddition

  1. पर चिप वास्तविक समय में कब्जा cycloaddition (चित्रा 2) की निगरानी करना.
    1. जीएसटी TCO (20 माइक्रोग्राम / एमएल), TZ-BnNH 2 (10 माइक्रोन) और उत्थान (10 मिमी ग्लाइसिन, = पीएच 2.0) अभिकर्मक रैक 2 में समाधान शीशियों रखें. आदमी का चयन करेंUAL रन विधि, 5 μl / मिनट प्रवाह दर निर्धारित और सेल 2 प्रवाह करने के लिए पथ प्रवाह.
    2. 420 सेकंड के लिए जीएसटी TCO का समाधान इंजेक्षन.
    3. 600 सेकंड के लिए TZ-BnNH 2 का समाधान इंजेक्षन.
    4. उत्थान समाधान के दो 30 सेकंड इंजेक्शन के साथ सतह पुनर्जन्म.
  2. वास्तविक समय (चित्रा 3) में बहु - घटक संरचनाओं पर चिप विधानसभा मॉनिटरिंग:
    1. जीएसटी-TZ (20 माइक्रोग्राम / एमएल), एनपी TCO (100 माइक्रोग्राम फ़े / एमएल), TZ-BnNH 2 (10 माइक्रोन) और उत्थान (10 मिमी ग्लाइसिन, = पीएच 2.0) अभिकर्मक रैक 2 में समाधान शीशियों रखें. साधन पुस्तिका रन पद्धति का चयन करें, सेल 2 प्रवाह करने के लिए 5 μl / मिनट और प्रवाह पथ को प्रवाह की दर निर्धारित किया है.
    2. 60 सेकंड के लिए जीएसटी-TZ का समाधान इंजेक्षन.
    3. 60 सेकंड के लिए एनपी TCO का समाधान इंजेक्षन.
    4. 60 सेकंड के लिए TZ-BnNH 2 का समाधान इंजेक्षन.
    5. उत्थान समाधान के दो 30 सेकंड इंजेक्शन के साथ सतह पुनर्जन्म.

4. एमcycloaddition दरों के स्थिरीकरण घनत्व और निर्धारण onitoring

  1. छोटे अणु cycloaddition प्रतिक्रिया दर (चित्रा 4) की विशेषता.
    1. नई विधि और इनपुट सामान्य मापदंडों का चयन करें. परख कदम पैनल में एक नया कदम है और यह नाम नमूना बनाएँ. प्रयोजन सेट और नमूने के आधार सेटिंग्स कनेक्ट करें.
    2. साइकिल प्रकार पैनल में एक नया चक्र कदम बनाएँ और निम्न कमांड डालें; कब्जा, नमूना, पुनर्जनन 1 और पुनर्जनन 2.
    3. कैद आदेश का चयन करें, इनपुट ligand नाम (जीएसटी TCO, 20 माइक्रोग्राम / एमएल), के लिए 5 μl / मिनट और सेट प्रवाह पथ पर संपर्क समय 120 सेकंड: दूसरा. नमूना आदेश का चयन करें, इनपुट 180 सेकंड संपर्क समय, 60 सेकंड हदबंदी समय, 30 μl / मिनट प्रवाह दर और करने के लिए सेट प्रवाह पथ: दोनों. पुनर्जनन 1 आदेश का चयन करें, इनपुट उत्थान समाधान के नाम (10 मिमी ग्लाइसिन-एचसीएल पीएच 2.0), 30 μl / मिनट और करने के लिए सेट प्रवाह पथ पर 30 सेकंड के संपर्क समय: दूसरा. पुनर्जनन 2 आदेश के लिए एक ही दोहराएँ. </ ली>
    4. चयन सेटअप को चलाने और करने के लिए सेट प्रवाह पथ: 2-1. अगले चुने और analyte समाधान (TZ-BnNH 2) और एकाग्रता श्रृंखला (0.3-10 माइक्रोन, 1:2 कमजोर पड़ने) के साथ नमूना सूची भरें. स्थिति पैनल रैक के बगल का चयन करें. 96 अच्छी तरह से थाली में अभिकर्मक रैक 2 और कमजोर पड़ने श्रृंखला में जगह समाधान शीशियों सामग्री की सूची के साथ पदों मैच के लिए सुनिश्चित कर रही है. विधि टेम्पलेट सहेजें और बाध्यकारी परख शुरू. डेटा बाइंडिंग और गतिज विश्लेषण चित्रा 4 में दिखाया गया.
  2. एनपी cycloaddition प्रतिक्रिया दर (चित्रा 4) की विशेषता.
    1. ऊपर से बचाया विधि टेम्पलेट खोलें और निम्न पैरामीटर बदल जाते हैं. कब्जा पैनल का चयन करें; जीएसटी TZ, 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर परिवर्तन ligand नाम. नमूना पैनल का चयन करें; परिवर्तन संपर्क समय 120 सेकंड संपर्क समय और हदबंदी समय के लिए 120 सेकंड के लिए.
    2. नमूना सूची का चयन करें, एनपी TCO और एकाग्रता श्रृंखला (7 एनएम 224, 1:2 कमजोर पड़ने) को analyte बदल जाते हैं. अभिकर्मक रैक में रखें समाधान शीशियों2 और सामग्री की सूची के साथ पदों मैच के लिए सुनिश्चित करते हुए 96 अच्छी तरह से थाली में कमजोर पड़ने श्रृंखला. विधि टेम्पलेट सहेजें और बाध्यकारी परख शुरू. डेटा बाइंडिंग और गतिज विश्लेषण चित्रा 4 में दिखाया गया.

5. Immobilized AP1497 को FKBP12 के बंधन मापने

उलट उन्मुखीकरण बंधन पढ़ाई immobilized ligand के रूप में analyte और यौगिक AP1497 (चित्रा 5) के रूप में FKBP12 रोजगार. विधि बिल्डर उपकरण का उपयोग कर के रूप में निम्नानुसार इस परख के लिए सामान्य विधि की स्थापना की है:

  1. नई विधि और इनपुट सामान्य मापदंडों का चयन करें. परख कदम पैनल में बना सकते हैं और नाम कब्जा, नमूना और पुनर्जनन कदम. इसी उद्देश्य का चयन और आधार सेटिंग्स कनेक्ट करें.
  2. साइकिल प्रकार पैनल का चयन करें और 3 चक्र कदम बनाने: कब्जा, नमूना और पुनर्जनन.
  3. कब्जा चक्र कदम के तहत दो बार कब्जा कमांड डालें. Variabl के रूप में कैद 1 पैनल का चयन करें और कब्जा समाधान का चयनदूसरा: ई, 5 / मिनट μl और सेट प्रवाह पथ की एक प्रवाह दर पर संपर्क समय 300 सेकंड के लिए निर्धारित किया है. दूसरा: करने के लिए 5 μl / मिनट और सेट प्रवाह पथ के प्रवाह की दर पर 250 सेकंड के लिए संपर्क समय सेट चर के रूप में कैद 2 पैनल का चयन करें और कब्जा समाधान का चयन करें.
  4. नमूना चक्र कदम के तहत नमूना आदेश डालें. नमूना पैनल का चयन करें; 60 सेकंड के लिए सेट संपर्क समय, एक 30 μl / न्यूनतम के प्रवाह की दर और करने के लिए सेट प्रवाह पथ पर 200 सेकंड के लिए हदबंदी समय: दोनों.
  5. उत्थान चक्र कदम के तहत दो बार पुनर्जनन कमांड डालें. पुनर्जनन 1 पैनल का चयन करें; इनपुट उत्थान समाधान के नाम (10 मिमी ग्लाइसिन-एचसीएल पीएच 2.0), 30 μl / मिनट और करने के लिए सेट प्रवाह पथ पर 30 सेकंड के संपर्क समय: दूसरा. पुनर्जनन 2 पैनल के लिए एक ही दोहराएँ.
  6. चयन सेटअप को चलाने और करने के लिए सेट प्रवाह पथ: 2-1. अगले और इनपुट पर कब्जा समाधान नेम (जीएसटी TCO और AP1497-TZ), नमूना नाम (FKBP12), एकाग्रता श्रृंखला (0.020-5 ग्राम / एमएल, 1:2 कमजोर पड़ने) और मेगावाट (13,000) का चयन करें. आर में जगह समाधान शीशियों96 अच्छी तरह से थाली में eagent रैक 2 और कमजोर पड़ने श्रृंखला सामग्री की सूची के साथ पदों मैच के लिए सुनिश्चित कर रही है. विधि टेम्पलेट सहेजें और बाध्यकारी परख शुरू. काइनेटिक विश्लेषण डेटा चित्रा 5 में दिखाया गया.

6. Immobilized एनपीएस के लिए संलग्न AP1497 को FKBP12 के बंधन मापने

nanoparticle स्थिरीकरण, छोटे अणु derivatization और FKBP12 बाध्यकारी परख के लिए सामान्य विधि सेट अप है विधि बिल्डर उपकरण का उपयोग इस प्रकार है:

  1. ऊपर से बचाया विधि टेम्पलेट खोलें और संशोधित. कब्जा चक्र कदम के तहत एक अतिरिक्त कैद कमांड डालें. कैद 1 पैनल का चयन करें; चर और नाम कब्जा समाधान 1 (जीएसटी-TZ) के रूप में कब्जा समाधान अचयनित. एक 5 μl / मिनट के प्रवाह की दर और दूसरे सेट प्रवाह पथ पर 60 सेकंड के लिए सेट संपर्क समय. कब्जा 2 पैनल का चयन करें; चर और नाम कब्जा समाधान 2 (एनपी TCO) के रूप में कब्जा समाधान अचयनित. सेट संपर्क समय 5 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर 90 सेकंड के लिए औरसेट प्रवाह पथ के लिए दूसरा. कब्जा 3 पैनल का चयन करें; चर और नाम कब्जा समाधान 3 (AP1497-TZ) के रूप में कब्जा समाधान अचयनित. एक 5 μl / मिनट के प्रवाह की दर और दूसरे सेट प्रवाह पथ पर 180 सेकंड के लिए सेट संपर्क समय.
  2. चयन सेटअप को चलाने और करने के लिए सेट प्रवाह पथ: 2-1. दो बार अगला का चयन करें. 96 अच्छी तरह से थाली में अभिकर्मक रैक 2 और कमजोर पड़ने श्रृंखला में जगह समाधान शीशियों सामग्री की सूची के साथ पदों मैच के लिए सुनिश्चित कर रही है. विधि टेम्पलेट सहेजें और बाध्यकारी परख शुरू. काइनेटिक विश्लेषण डेटा चित्रा 5 में दिखाया गया.

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Representative Results

डेटा और आंकड़ों के संदर्भ में 8 से अनुकूलित किया गया है.

अभिविन्यास और घनत्व पर नियंत्रण के साथ bioactive छोटे अणुओं के कुशल प्रतिवर्ती स्थिरीकरण नए biosensor अनुप्रयोगों के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. TCO और Tz के बीच तेजी से bioorthogonal प्रतिक्रिया का उपयोग करना, हम चरणबद्ध विधानसभा और जैविक गतिविधि की अवधारण के साथ ligand सतहों के उत्थान के लिए एक विधि का वर्णन. 2 TZ-BnNH 2 स्थिरीकरण के वास्तविक समय की निगरानी से पता चलता है. जीएसटी TCO का समाधान जवाब में ~ 400 आरयू वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप एक पूर्व immobilized विरोधी जीएसटी सतह पर इंजेक्ट किया जाता है. TZ-BnNH 2 के साथ एक दूसरे इंजेक्शन जवाब में एक तेज ~ 15 RU वृद्धि दर्शाता है. Derivatized प्रतिजन की कोई हदबंदी संरचना स्थिरता के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने के बफर चलाने के लिए स्विचन के बाद मनाया जाता है. सतह एकाधिक कब्जा cycloaddition के चक्र को सक्षम करने के चक्र के अंतिम चरण में पुनर्जीवित है. हमेंइस प्रक्रिया आईएनजी और AP1497-TZ अणु के साथ TZ-BnNH 2 आधा भाग की जगह अपने लक्ष्य FKBP12 (चित्रा 5) के साथ बातचीत के अध्ययन के लिए इस्तेमाल एक bioactive सतह उत्पन्न करता है. एंटीबॉडी / प्रतिजन बातचीत का विघटन (चित्रा 2 में दिखाया गया है) एक नया आणविक विधानसभा का निर्माण किया जाना है, की अनुमति विरोधी जीएसटी सतह पुन: बनाता है. इस मामले में, एक जीएसटी-TZ इंजेक्शन (~ 800 आरयू के कब्जा) को प्रभावी ढंग से सेंसर की सतह के लिए nanoparticle (चित्रा 3) immobilizing, एनपी TCO (cycloaddition ~ 600 आरयू) का एक इंजेक्शन के साथ पीछा किया जाता है. एनपी पर unreacted TCO समूहों इंजेक्शन TZ-BnNH 2 (~ 22 आरयू) के साथ cycloaddition के लिए उपलब्ध हैं. वैकल्पिक रूप से, AP1497-TZ functionalized nanoparticle में FKBP12 बातचीत (चित्रा 5) की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है. बहु घटक संरचनाओं का कोई हदबंदी (GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2) संरचना स्थिरता और bioactivity (AP1497-Tz/FKBP12 बी के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने मनाया जाता हैकर्मचारियों INDING).

वास्तविक समय स्थिरीकरण (cycloaddition) प्रतिक्रिया निगरानी और सतह के उत्थान के लिए क्षमताओं के साथ, संघ की दर से सीधा लक्षण वर्णन चित्रा 4 में दिखाया गया के रूप में एक (cycloaddition दर) पूरा किया है कश्मीर. प्रतिक्रिया कैनेटीक्स का ज्ञान स्थिरीकरण घनत्व (संपर्क समय और एकाग्रता), biosensor assays के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर को नियंत्रित करने के लिए दिशा निर्देश प्रदान करता है. जीएसटी TCO या जीएसटी चतुर्थ सतहों पर दो प्रतियों में TZ-BnNH 2 या एनपी TCO की सांद्रता बढ़ इंजेक्शन, क्रमशः, बंधन डेटा (लाल लाइनों) उत्पन्न करता है. एक ही सतह पर एक ही एकाग्रता के दो अनुक्रमिक analyte नमूने लिए बाध्यकारी डेटा लगभग superimposable कारण कब्जा cycloaddition और उत्थान की कई चक्र की क्षमता बाध्यकारी एंटीबॉडी का कम से कम नुकसान को दर्शाती हैं. मूल्यांकन सॉफ्टवेयर सबसे फिट गतिज विश्लेषण (काली लाइनें प्रदान करता है ग) के लिएycloaddition प्रतिक्रिया दरों में एक 4 चित्र में दिखाया k.

चित्रा 1
चित्रा 1. Derivatized अणुओं. ए पार cyclooctene (TCO) के बीच [4 2] cycloaddition प्रतिक्रिया और 1,2,4,5-tetrazine (Tz) moieties 1,4 dihydropyridazine अभिवर्तन देने के लिए की प्रतिवर्ती स्थिरीकरण के लिए Bioorthogonal विकार रणनीति . Tz / TCO की प्रतिवर्ती स्थिरीकरण के लिए बी प्रायोगिक योजना के अणुओं में चिह्नित. प्रतिवर्ती nanoparticle स्थिरीकरण और functionalization के लिए सी. प्रायोगिक योजना. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. . छोटे अणु स्थिरीकरण के वास्तविक समय की निगरानी 1) आधारभूत:. चल बफर (टी इंजेक्शन द्वारा पीछा विरोधी जीएसटी एंटीबॉडी (टी = 0-420 सेकंड) द्वारा इंजेक्शन जीएसटी TCO के पूर्व immobilized विरोधी जीएसटी 2) पर कब्जा, जवाब में ~ 15 RU वृद्धि; टी 540-1,140 सेकंड =). कब्जा कर लिया जीएसटी TCO और tetrazine (TZ-BnNH बीच 2 = 420-540 सेकंड) बातचीत की दृढ़ता दिखा 3) cycloaddition. कोई संकेत क्षय. 4) 10 मिमी ग्लाइसिन, पीएच 2.1 (टी = 1,820-2,000 एसईसी) के 2 छोटे इंजेक्शन के साथ विरोधी जीएसटी सतह के उत्थान बफर (टी = 1,140-1,820 सेकंड) चलाने के लिए मोबाइल चरण स्विचन के बावजूद होता.

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चित्रा 3. पर कब्जा कर लिया जीएसटी-TZ और एनपी TCO (टी = 135-195 इंजेक्शन के बीच इंजेक्शन जीएसटी-TZ (टी = 0-60 सेकंड के nanoparticle स्थिरीकरण और functionalization की वास्तविक समय की निगरानी. 1) बेसलाइन. 2) पर कब्जा). 3) cycloaddition एसईसी), सिग्नल में कोई क्षय के साथ बफर चलाने का इंजेक्शन द्वारा पीछा (टी = 195-300 सेकंड). 4) cycloaddition एनपी TCO से स्थिर और TZ-BnNH 2 इंजेक्शन (~ जवाब में 22 RU वृद्धि, टी 300-360 = के बीच सेक). कोई संकेत क्षय बहु घटक स्थिरता के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने के बफर (टी = 360-480 सेकंड) चलाने के लिए मोबाइल चरण स्विचन के बावजूद है.

चित्रा 4
चित्रा 4. बी दिखा प्रतिनिधि sensorgramsTz और TCO के बीच cycloaddition प्रतिक्रिया के लिए inding डेटा (लाल लाइनों) और गतिज विश्लेषण (काली लाइनें) 100% FBS की उपस्थिति या अनुपस्थिति में अणुओं में चिह्नित. टेबल एसोसिएशन (cycloaddition) दर स्थिरांक सारांशित, एक कश्मीर.

चित्रा 5
चित्रा 5. . AP1497 और AP1497-TZ: अलग विन्यास में छोटे अणु / प्रोटीन बातचीत (शीर्ष) FK506 का सिंथेटिक डेरिवेटिव के एसपीआर पढ़ाई. तालिका गतिज से पता चलता है और बाध्यकारी डेटा से व्युत्पन्न संतुलन दर स्थिरांक. प्रोटीन स्थिर है जहां बाध्यकारी प्रयोगों (यानी पारंपरिक SPR प्रयोगों) से डेटा की तुलना के लिए शामिल किए गए हैं.

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Discussion

यहाँ वर्णित कब्जा cycloaddition विधि लेबल से मुक्त चिप आधारित बातचीत और गतिज अध्ययन के लिए संशोधित नैनोकणों और छोटे अणुओं की तेजी, प्रतिवर्ती स्थिरीकरण सक्षम बनाता है. स्थिरीकरण प्रोटोकॉल <छोटे अणु ligands की 10 माइक्रोन एकाग्रता की आवश्यकता होती मिनट में किया जा सकता है. Ligand एकाग्रता और संपर्क समय स्थिरीकरण घनत्व modulating द्वारा बारीकी से नियंत्रित किया जा सकता है. हमारे आंकड़े पर चिप bioorthogonal प्रतिक्रियाओं उनके लक्ष्य के साथ बातचीत करने के लिए सीटू क्रियाशील नैनोकणों या immobilized छोटे अणुओं में की क्षमता को संरक्षित करता है. हम भी कम आणविक वजन के साथ दो छोटे अणुओं, (TCO और Tz) के बीच bimolecular cycloaddition दरों की विशेषता है. हम इसी तरह assays के अन्य तेज bioorthogonal प्रतिक्रियाओं की दर को मापने और तुलना करने के लिए किया जा सकता है कि कल्पना.

प्रतिवर्ती, निरंतर प्रवाह पर चिप nanoparticle स्थिरीकरण और सीटू functionalization जनसंपर्कovides सभी शुद्धि, स्थिरीकरण और जांच के लिए विभिन्न चरणों की आवश्यकता है जो पारंपरिक nanoparticle संश्लेषण, की तुलना में एक ही प्रयोग. 13-15 में स्क्रीनिंग और बातचीत के विश्लेषण के लिए संशोधित नैनोकणों की एक किस्म के लिए तेजी से पहुँच, हमारे विधि बहुत biomaterials के इनपुट मात्रा, विलायकों कम कर देता है और अभिकर्मकों, एक साथ nanoparticle उपयोग और निपटान के साथ काम कर पर्यावरण संबंधी चिंताओं को कम करते हुए. 16 महत्वपूर्ण बात है, nanoparticle functionalization प्रतिक्रियाओं आमतौर पर सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए इस्तेमाल सीरम सांद्रता की उपस्थिति को मजबूत कर रहे हैं, और यहां तक कि अत्यंत उच्च सीरम सांद्रता के लिए. इस सुविधा के सीरम की उपस्थिति (nanoparticle का प्रोटीन कोरोना और सतह गुण को प्रभावित कर सकते हैं) में nanoparticle डिजाइन के लिए संरचना गतिविधि रिश्तों की सुविधा कर सकते हैं. 17,18

प्रोटीन छोटे अणु बातचीत का अध्ययन कर रहे हैं, जहां सबसे एसपीआर assays में, प्रोटीन (ligand) हैएक आकर्षण टैग (जीएसटी, बायोटिन, आदि) के माध्यम से या सहसंयोजक एमाइड संपर्कों के माध्यम से स्थिर. analyte तो ligand पर से गुजर रहा है जहां अपवर्तनांक परिवर्तन के रूप में पाया जाता है जो सतह जन विविधताओं, बंधन का परिणाम है. विहित एसपीआर अभिविन्यास पीछे और एक सुविधाजनक और प्रतिवर्ती ढंग से छोटे अणु immobilizing घुलनशील macromolecular लक्ष्य का प्रत्यक्ष बंधन अध्ययन करने के लिए सरल पहुँच प्रदान करता है और कलाकृतियों (घुलनशील बनाम immobilized) चरण विशिष्ट स्पष्ट करता है. इस प्रकार के 19,20 परख स्वरूप हैं विशेष रूप से निषेध और प्रतिस्पर्धा के अध्ययन के लिए मूल्यवान. उन्मुखीकरण के 21 उलटा भी कई परिस्थितियों में फायदेमंद हो सकता है, यानी एक) बाध्यकारी संकेत बड़े पैमाने पर परिवर्तन ख) एकत्रीकरण और हाइड्रोफोबिक analytes 22 की गैर विशिष्टता सतह के लिए आनुपातिक विचार है कि कम आणविक भार के analytes, साथ उच्च आत्मीयता बाँधने के डेटा विश्लेषण सीधी सी) लक्षण वर्णन कर सकते हैं कर समाप्त हो रहा हैकारण लंबे निवास टाइम्स (सहसंयोजक inhibitors के साथ काम कर रहा है, खासकर जब ऑफ दरें धीमी गति से) 23 और अगले विश्लेषण चक्र डी) उत्थान एजेंटों की संरचना या समारोह पर अपमानजनक प्रभाव हो सकता है के लिए तैयारी में सतह उत्थान स्थितियों के लिए जरूरत के लिए चुनौतीपूर्ण हो immobilized प्रोटीन.

हमारे स्थिरीकरण रणनीति के हिस्से के रूप में bioorthogonal कब्जा cycloaddition विधि को शामिल करके, हम पारंपरिक छोटे अणु स्थिरीकरण तकनीक के साथ जुड़े कठिनाइयों के कुछ दरकिनार. प्रोटीन स्थिरीकरण प्रोटोकॉल के लिए ठेठ पूर्व सांद्रता सतह के लिए अग्रणी electrostatic आकर्षण छोटे अणुओं के साथ अप्रभावी कर रहे हैं, क्योंकि ये काफी ज्यादा ligand सांद्रता की आवश्यकता होती है. तदनुसार, ligands की सांद्रता बढ़ ligand विघटन के लिए जैविक सह विलायक के अनुपात में वृद्धि की ओर जाता है. इन दोनों स्थितियों के सूक्ष्म fluidic प्रवाह प्रणाली के साथ संगत और के रूप में नहीं कर रहे हैं एक परिणाम, पारंपरिक मैंmmobilizations वास्तविक समय की निगरानी. 24 अन्त में, एक सफल पारंपरिक स्थिरीकरण की घटना में, सहसंयोजक सतह संशोधन सतह उत्थान को रोकता है और समय, प्रयास में बढ़ता निवेश में जिसके परिणामस्वरूप biosensor सतहों की प्रयोगात्मक सीमा सीमा संभव नहीं है जहां साधन के बाहर प्रदर्शन किया जाना चाहिए और लागत.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgements

हम एनआईएच (NHLBI अनुबंध नहीं HHSN268201000044C, एसएच और SYS आरडब्ल्यू के लिए) से धन स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30  
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50  
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23  
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01  
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK  
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54  
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55  
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100  

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References

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