التساهمية تجليد BMP-2 على السطوح باستخدام نهج أحادي الطبقة تجميعها الذاتي

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نحن تصف طريقة لإنجاز الشلل كفاءة BMP-2 على السطوح. ويستند نهجنا على تشكيل أحادي الطبقة الذاتي تجميعها لتحقيق التساهمية ملزم من BMP-2 عبر مخلفاتها أمين الحرة. هذا الأسلوب هو أداة مفيدة لدراسة الإشارات في غشاء الخلية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بروتين مخلق العظام 2 (BMP-2) هو عامل النمو جزءا لا يتجزأ من المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة والعظام. BMP-2 بمثابة الزناد من تمايز الخلايا الوسيطة في بانيات، وبالتالي تحفيز الشفاء وتكوين العظام نوفو دي. وقد أثار استخدام السريرية البشرية المؤتلف BMP-2 (rhBMP-2) بالتزامن مع السقالات الخلافات الأخيرة، استنادا إلى طريقة العرض وكمية ليتم تسليمها. بروتوكول المعروضة هنا يوفر وسيلة بسيطة وفعالة لتقديم BMP-2 للدراسات في المختبر على خلايا. ونحن تصف كيفية تشكيل أحادي الطبقة الذاتي تجميعها يتكون من رابط heterobifunctional، وتظهر الخطوة اللاحقة ملزمة للحصول على تجميد التساهمية من rhBMP-2. مع هذا النهج فمن الممكن لتحقيق العرض المستمر من BMP-2، مع المحافظة على النشاط البيولوجي من البروتين. في الواقع، فإن تجميد سطح BMP-2 يسمح التحقيقات المستهدفة من خلال منع الإعلانات غير محددةorption، مع تقليل كمية عامل النمو، وعلى الأخص، مما يعوق جامحا من على سطح الأرض. كلا الحدثين الإشارات القصيرة والطويلة الأجل والناجمة عن BMP-2 تجري عندما تتعرض الخلايا على الأسطح تقديم يجمد تساهميا rhBMP-2، مما يجعل هذا النهج مناسب لفي المختبر دراسات عن مدى استجابة الخلية لBMP-2 التحفيز.

Introduction

عظم بروتين مخلق 2 (BMP-2) هو عضو عامل النمو التحويلي (TGF-β) الأسرة وبمثابة محفز للدي نوفو تكوين العظام وكذلك تنظيم العديد من الأنسجة أثناء التطور الجنيني والكبار التوازن 1-3. كل مونومر من النشطة بيولوجيا homodimeric البروتين BMP-2 يحتوي على "عقدة السيستين" عزر، والتي يتم حفظها للغاية في جميع أفضل الممارسات الإدارية 4. ستة من بقايا السيستين شكل سندات ثاني كبريتيد سبعة داخل الجزيء أن استقرار كل مونومر، في حين تشارك السيستين السابع في dimerization، تشكيل السندات الجزيئات بين اثنين من مونومرات 5،6. يحدد هذا عقدة السيستين حفظا للغاية هيكل ثلاثي الأبعاد للبروتين BMP-2 ويحدد خصائص فريدة من نوعها، مثل مقاومة ضد الحرارة، وdenaturants الحمضية درجة الحموضة 7-9. BMP-2 بربط سيرين / ثريونين كيناز مستقبلات عبر الغشاء، مما يحفز نقل الإشارة 12-14.

في العظام، BMP-2 الحث على تمايز الخلايا الجذعية الوسيطة في بانيات، وبالتالي تحفيز الشفاء ودي نوفو تشكيل العظام. حاليا، أعرب recombinantly يتم تطبيق BMP-2 سريريا لتعزيز الشفاء من مواقع كسر. استراتيجية مشتركة في هندسة الأنسجة العظام هو استخدام عوامل النمو عن طريق الحقن، والتي هي أقل الغازية مقارنة مع أنظمة التسليم المحلي. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات المجراة في والتطبيقات السريرية أن قصيرة العمر النصفي البيولوجي، في الموضع غير محددةالتخلف والتهميش والتخليص السريع للالمحلية BMP-2 قد يؤدي إلى العديد من المشاكل المحلية، خارج الرحم والنظامية 15. وبالتالي، للحصول على العرض الفعال، وانحباس أو تجميد BMP-2 داخل أو على مواد ضرورية للتسليم المحلي والمستدام لها في الموقع المستهدف. ويمكن تحقيق استدامة التسليم مع نهج الاستبقاء غير التساهمية، مثل فخ المادية، والامتزاز أو أيون complexation 16. ومع ذلك، فمن المعروف أن الامتزاز غير محدد من البروتينات على الأسطح يجوز النتائج في تمسخ من الجزيئات 17. لالتساهمية ملزم من عوامل النمو، وقد تم تطوير أنواع مختلفة من الدعم على مدى العقد الماضي. استخدام جزيئات ربط bifunctional التي تستهدف الأمينية أو الكربوكسيل مجموعات من البروتين على سبيل المثال، هو نوع واحد من النهج الذي لا يتطلب بالضرورة تعديل البروتين لتحقيق الشلل فيها. في الواقع، في حين أن التعديل البروتين يوفر ميزة السيطرة على التوجه البروتين،مقدمة من المجالات الصناعية، والعلامات وسلاسل الببتيد في مواقع محددة قد يغير النشاط البيولوجي من عوامل النمو 17. وبالتالي، للتحايل تمسخ بسبب التفاعل مع المواد الداعمة، السطوح يمكن بين functionalized مسبقا، على سبيل المثال، مع أحادي الطبقة الذاتي تجميعها (SAM) من جزيء ربط، تليها اقتران عامل المطلوب 18. وقد استخدمنا نهج قائم على SAM-لشل حركة تساهميا BMP-2 على سطح من خلال استهداف مخلفاتها أمين حرة وأظهرت أن بروتين يجمد يحتفظ كلا من النشاط البيولوجي القصيرة والطويلة الأجل و19. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لتقديم BMP-2 إلى الخلايا في المختبر لدراسات عن الآليات التي تحدث في غشاء الخلية وتنظيم الإشارات بين الخلايا المكونة للعظم مسؤولة عن إرسال الإشارات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تركيب 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide استر (MU-NHS)

  1. إضافة قطرة قطرة محلول من 500 ملغم N-hydroxysuccinimide و 30 ملغ 4 - (dimethylamino) البيريدين في 10 مل الأسيتون (السلطة الفلسطينية) إلى 1 ز حامض 11-mercaptoundecanoic في 40 مل ثنائي كلورو ميثان (السلطة الفلسطينية) في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. تهدئة رد الفعل إلى 0 درجة مئوية وإضافة قطرة قطرة 1.1 ز ن، ن 'dicyclohexylcarbodiimide في 10 مل ثنائي كلورو ميثان (تحت جو من النيتروجين). الحفاظ على التفاعل في درجة حرارة منخفضة لمدة 1 ساعة ثم يقلب في RT بين عشية وضحاها.
  3. تحديد راسب وجففه تحت ضغط منخفض. تنقية المنتج من قبل فلاش اللوني مع البنزين البترول وخلات الإيثيل (سنويا) في نسبة 1:1.

2. إعداد طبقات متجانسة الذهب

  1. coverslips الزجاج نظيفة مع مناديل الدقة ويصوتن لهم لمدة 5 دقائق في محلول يحتوي على 1:1 خليط من خلات الإيثيل (السلطة الفلسطينية) والميثانول (السلطة الفلسطينية). Rinsركائز الإلكترونية مع الميثانول ويجف حالا في ظل تدفق النيتروجين.
  2. وضع ركائز نظيفة في الجهاز تفل الطلاء. إخلاء القاعة. إزالة طبقة أكسيد الكروم العلوي من الكروم الهدف الاخرق من قبل لمدة 60 ثانية. وضع العينات تحت شعاع المعادن ومعطف لهم مع طبقة الكروم 10 نانومتر، تلتها طلاء بطبقة من الذهب 40 نانومتر.

3. تجميد سطح BMP-2

  1. حل MU-NHS في N، N-dimethlyformamide (DMF) إلى تركيز النهائي من حوالي 1 ملم واحتضان ركائز الذهب في حل MU-NHS في RT لمدة 4 ساعة تحت جو النيتروجين.
  2. السطوح يصوتن في DMF لمدة 2 دقيقة، وشطف مع DMF وMeOH وتجف حالا في ظل تدفق النيتروجين.
  3. إعداد محلول المخزون من rhBMP-2 في العقيمة 4 ملم حمض الهيدروكلوريك بتركيز 100 ميكروغرام / مل (مأخوذة تخزينها في -80 درجة مئوية). لالتخفيفات العمل (3.5 ميكروغرام / مل)، وتمييع الحل الأسهم في برنامج تلفزيوني / كلوريد الصوديوم (PBS تحتوي على 1 M كلوريد الصوديوم) وdjust لدرجة الحموضة 8.5 مباشرة قبل الاستعمال.
  4. احتضان السطوح بين functionalized MU-NHS في حل العاملة rhBMP-2 في 4 درجات مئوية خلال الليل. إزالة طاف الحضانة. السطوح يصوتن في برنامج تلفزيوني / كلوريد الصوديوم لمدة 2 دقيقة ويغسل 3X مع برنامج تلفزيوني العقيمة / كلوريد الصوديوم.

4. توصيف السطح

  1. لمنع امتصاص غير محدد من الأجسام المضادة، واحتضان الأسطح مع BSA 5٪ (ث / ت) في حل برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT، تليها الحضانة مع الأضداد المضادة للBMP-2 (1:100 في 1٪ (ث / ت ) حل BSA / PBS) لمدة 1 ساعة على RT. غسل الأسطح مرتين مع برنامج تلفزيوني ويصوتن لمدة 30 ثانية.
  2. احتضان ركائز مع الضد HRP، مترافق الثانوية (1:1،000 في 1٪ (ث / ت) حل BSA / PBS) لمدة 30 دقيقة في RT، ثم يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  3. استخدام Ampliflu الأحمر فحص لقياس HRP النشاط الأنزيمي في 570 نانومتر مع قارئ لوحة.

5. تحليل النشاط الحيوي

  1. البذور 1 × 10 5 الماوس myoblasts C2C12 لكل بئر في 6 جيدا ررآتش في النمو المتوسط، وتتألف من DMEM الجلوكوز المرتفعة التي تحتوي على البيروفات تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين واحتضان لهم لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
  2. تجويع الخلايا في المصل خالية DMEM لمدة 3-5 ساعة قبل البذر على أسطح مزينة يجمد BMP-2.
  3. للتحقيق في المدى القصير يشير الاستقراء، استبدال المتوسطة بنسبة 200 ميكرولتر الطازجة DMEM المصل خالية ووضع يجمد BMP-2 فوق أسطح الخلايا. وينبغي التعامل مع السطح مع ملاقط غيض غرامة لتجنب خدش.
  4. إزالة بلطف الأسطح ونضح المتوسطة مع ماصة، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. الشروع في تحليل استجابات الخلايا.
  5. لتحليل النشاط البيولوجي على المدى الطويل، وخلايا لوحة على السطوح والثقافة لهم عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 في ظروف المصل منخفضة (2٪ FBS) لمدة ستة أيام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الإعداد لدينا، وقد تم اختيار الذهب وسواغ لأنه يوفر نظام غير محددة بيولوجيا ولكن الانضباطي كيميائيا. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق الطبقات الوحيدة الذاتي تجميع يستلزم العديد من الفوائد: صواريخ سام كثف بعفوية عبر بهم "وجها لمجموعات" على المعادن والطبقات الوحيدة شكل مع عدد قليل من العيوب، في حين وظيفية الجماعات نهايتهم يمكن تعديلها أخرى. وبالتالي فإنها توفر منبرا لتفصيل خصائص واجهة بطريقة قابلة للتكيف للغاية بعد سيطرة 20.

لتجميد BMP-2 على الأسطح المغلفة بالذهب، استخدمنا نهج من خطوتين: 1) ملزمة رابط MU-NHS إلى طبقة الذهب، ثم 2) رد فعل رابط مع البروتين (انظر الشكل 1). لإثبات ملزمة للrhBMP-2، استخدمنا انزيم المناعه. في هذا الاختبار، السطوح تقديم يجمد وحضنت rhBMP-2 مع الأجسام المضادة المحددة BMP-2 والأجسام المضادة الثانوية مترافق مع HRP. الربط هذا الأخير يمكن دالعزم باستخدام محلول Ampliflu الأحمر. في حضور بيروكسيد الهيدروجين، HRP يحفز تحويل Ampliflu الأحمر عديم اللون (10-أسيتيل 3 ،7-dihydroxyphenoxazine) في مجمع resorufin الفلورسنت. اكتشفنا سطح يجمد rhBMP-2 (iBMP-2) قبل وبعد الاقتراب من الخلايا الملتصقة من فوق السطوح مع بين functionalized. يرجى ملاحظة أن للكشف عن rhBMP مع مقايسة Ampliflu الأحمر، والعينات تخضع لعدة خطوات الحضانة والعلاجات. وبالتالي، فإنه ليس من الممكن تحقيق نفس السطح قبل وبعد التحفيز الخلية. يبين الشكل 2A الناجحة الملزمة لrhBMP-2 إلى السطح في التشكل معترف بها من قبل مفتش مكافحة BMP-2. يبين الشكل 2B على iBMP- 2 السطح الذي تم استخدامه لتحفيز الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل المناعية HRP. حتى بعد تحفيز الخلايا يتم الكشف عن البروتين على السطح.

استجابات الخلايا على الأسطح تقديم RH يجمدتم تقييم BMP-2 ومقارنة لتأثير ركائز الذهب غير المعالجة (مراقبة سلبية). من أجل تقليل تأثير عملية التصاق على تحليل إشارات قصيرة الأجل، وضعت خاصة مجموعة المتابعة لتحفيز الخلايا. هنا، وحفز الخلايا C2C12 لمدة 30 دقيقة قبل rhBMP-2 السطوح بين functionalized يقترب من أعلى. خط الخلية myoblast الماوس C2C12 هو الوسيطة خط الخلية السلائف المحفزة، والذي يستخدم على نطاق واسع كنظام نموذج لدراسة المرحلة المبكرة من التمايز المكونة للعظم خلال تكوين العظام في الأنسجة العضلية. في هذا النموذج، BMP-2 يحول دون تمايز الخلايا في myotubes متعددة النوى ويدفع بناء العظم الظواهر 21. تفعيل صماد 1/5/8، والتي هي صحفيين المصب من إشارات مسار BMP-2، يتم تحليلها من قبل النشاف الغربية. كما هو مبين في الشكل 3A، لوحظ صماد الفسفرة بعد 30 دقيقة عن طريق التحفيز iBMP-2، في حين لم يحدث الفسفرة من صماد 1/5/8في الخلايا المعرضة لعينات الذهب دون علاج. هذه النتيجة تشير إلى أن عملية تجميد لا يغير BMP-2 النشاط على المدى القصير ويؤدي الخطوات في وقت مبكر من صماد الإشارة.

لتحديد ما إذا iBMP-2 يؤثر على المدى الطويل المكونة للعظم التمايز، ومستوى التعبير عن الفوسفاتيز القلوية (ALP)، علامة المكونة للعظم، وكان التحقيق من قبل مقايسة اللونية. وقد تم قياس النشاط ALP الخلايا C2C12 بعد احتضان الخلايا لمدة 6 أيام على الذهب العادي (السيطرة) وiBMP-2 السطوح. النشاط في ALP لست] الخلايا مثقف على iBMP-2 السطوح يظهر امتصاص أعلى بكثير بالمقارنة مع التحكم (الشكل 3B). هذه النتيجة يكشف عن أن iBMP-2 الحث على التعبير عن ALP علامة المكونة للعظم في الخلايا C2C12. ويعرف هذا الخط خلية للتمييز عند بلوغ confluency تحت حالة انخفاض مصل، وبالتالي تشكيل myotubes والتعبير عن البروتينات عضلي مميزة. ومع ذلك، والمعاملة مع BMP-2 يسبب تحولا فيمسار التمايز من أرومي لبانية للعظم، وبالتالي قمع تشكيل myotubes. لدراسة تأثير iBMP-2 على تكون العضل، كانت مطلية الخلايا C2C12 مباشرة على الذهب (السيطرة) أو الأسطح بين functionalized ومثقف تحت التمايز (منخفض المصل) الظروف. بعد 6 أيام، تم تنفيذ تلطيخ ميوسين الثقيلة سلسلة (MHC). كما هو مبين في الشكل 3C، تفشل الخلايا C2C12 لتشكيل myotubes إيجابية MHC بحضور iBMP-2، ولكن ليس على ركائز الذهب.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط عملية تجميد rhBMP-2 على السطوح الذهب. والمغلفة coverslips الزجاج بطبقة من الذهب وحضنت مع رابط heterobifunctional (MU-NHS) مما أدى إلى تجميعها الذاتي أحادي الطبقة NHS بين functionalized (SAM) في وقت لاحق. الأمينات الأولية من BMP-2 تتفاعل مع رابط يؤدي إلى التعاونالبروتين يجمد valently على الركيزة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2. ربط السطح ويمكن الكشف عن rhBMP-2 بواسطة المقايسة المناعية الأنزيمية قبل (A) وكذلك بعد (B) التجارب تحفيز الخلية. مشلول كان كميا rhBMP-2 باستخدام Ampliflu الأحمر اللونية الفحص. تم قياس الامتصاص في 570 نانومتر وتم تطبيع البيانات للتحكم (غير المعالجة السطوح الذهب) القيم. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري عن المتوسط ​​ن> 3.

الرقم 3
الرقم 3. لا يزال يجمد rhBMP-2 النشطة بيولوجيا والحث على المدى القصير كماكذلك يشير الأحداث على المدى الطويل. (A) وحفز خلايا C2C12 لمدة 30 دقيقة قبل التعرض للأسطح الذهب (السيطرة) والسطوح مع يجمد تساهميا rhBMP-2 (iBMP-2) يقترب من أعلى. بعد تحلل الخلية، وimmunoblotted عينات للp-Smad1/5/8 وβ-الأكتين. (B) والنشاط الأنزيمي من الفوسفاتيز القلوية (ALP) يشير إلى تمايز الخلايا المكونة للعظم C2C12 وتم قياس من الخلية لست بعد الحضانة 6 أيام. الفترة على السيطرة أو iBMP-2 الأسطح، على التوالي. وقد تم قياس النشاط ALP كما الامتصاصية في 405 نانومتر. شريط الرسم البياني يبين البيانات التي حصل عليها بعد رد فعل 60 دقيقة. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري، ن = 3، ص * <وكانت المصنفة 0.01 (C) خلايا C2C12 على الأسطح أشارت وتربيتها لمدة 6 أيام تحت ظروف المصل منخفضة للسماح تكون العضل. تظهر الصور ميوسين الثقيلة سلسلة (MHC) تلطيخ myotubes متعددة النوى (الخضراء) ودابي نوى تلطيخ (الازرق). صورة التكبير 20x و.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول وصفنا إعداد الأسطح النشطة بيولوجيا بين functionalized مع rhBMP-2. ويتألف هذا النهج خطوتين: 1) التشكيل الأولي للأحادي الطبقة الذاتي تجميع (SAM) من رابط bifunctional على سطح الذهب، 2) تجميد التساهمية من البروتين rhBMP-2. في الأعمال السابقة، ونحن التحقق من صحة الربط الفعال للرابط bifunctional وعامل النمو، وأثبتت أن يجمد سطح rhBMP-2 يحافظ على النشاط البيولوجي في 19. وقد تبين أيضا أن النشاط الحيوي من عوامل النمو التي قدمت في شكل يجمد في دراسات أخرى، مشيرا إلى أن الإفراج عن البروتينات واستيعاب لاحقا ليست ضرورية لتحفيز الخلايا 24،25. في الواقع، فإن تجميد التساهمية من عوامل النمو يسمح التحفيز المستمر للخلايا المستهدفة مع الحفاظ على جرعة فعالة بسبب تعزيز نسبة الإشغال من أنواع مختلفة من المستقبلات في غشاء الخلية 22،23،26-28.

لإعداد الأسطح تقديم يجمد rhBMP-2، ينبغي الحرص في التعامل مع السطوح في جميع أنحاء الإجراء بأكمله وإعداد الحل rhBMP-2. يجب أن يكون coverslips الزجاج نظيفة وجافة، وينبغي أن لا توجد مؤشرات على خلل أو شوائب تكون مرئية. خدش السطح مع ملاقط وماصات يجب تجنبها. للخطوة functionalization السطحية باستخدام rhBMP 2، فمن الضروري استخدام البروتين المؤتلف خالية من الناقل، أي من دون وأضاف ألبومين المصل البقري في إعداد، لتجنب الشلل غير مرغوب فيها الناقل على السطح. يذوب الأسهم rhBMP-2 (100 ميكروغرام / مل) في 4 ملم حمض الهيدروكلوريك. عندما يتم تحضين الأسطح مع الحل rhBMP-2، ينبغي تعديل الرقم الهيدروجيني إلى محايد لدرجة الحموضة القلوية طفيف لتعزيز تفاعل مجموعة الأمينية من البروتين مع مجموعة من NHS رابط محدد السطح. إذا كانت درجة الحموضة منخفضة جدا، يمكن أن تحلل مجموعة NHS قبل أن تتفاعل الطرافةح المجموعات الأمينية من البروتين. ونحن نستخدم برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 M كلوريد الصوديوم 29 وإضافة rhBMP-2 من الأسهم ومن ثم ضبط درجة الحموضة مع KOH (10 ملم).

مع هذا البروتوكول حققنا نجاحا من الشلل النشطة بيولوجيا rhBMP-2 على الأسطح للأسباب التالية: 1) أنشأنا نهج من خطوتين؛ 2) استخدمنا رابط المناسبة للحصول على المسافة من السطح وربط البروتين دون تدخلات كبيرة على ل التفاعل مع مستقبلات. وalkanethiol-الأمينات رد الفعل، واستر 11 mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide (MU-NHS)، ومصطفة على الركيزة الذهب في الخطوة الأولى. كما alkanethiols الذاتي تجميع على المعادن مثل الذهب، وتشكيل أحادي الطبقة أمر غاية، وتسهيل تزيين السطوح مع مجموعة متنوعة من الجزيئات رابط 30-32. وSAM الدروع الجزيئات الحيوية من الاتصال المباشر مع سطح صلب، وبالتالي التقليل من خطر تمسخ 32. وعلاوة على ذلك، وطول رابط يحدد أيضا الجرميةctivity من SAM. المجموعات NHS من أدوات الربط، ويتألف من أحد عشر على الأقل ذرات الكربون، مثل MU-NHS، هي أكثر يسرا، مما أدى إلى زيادة الشلل البروتين مقارنة ملزمة لأقصر وأدوات الربط 34. وتجميد rhBMP-2 يحدث من خلال تهجير مجموعة NHS من قبل بقايا يسين البروتين 34. مجرد النظر في البيئة الفراغية، رد فعل الجماعات NHS-يجمد سطح الأرجح يقام في مرونة بقايا N-35 محطة. ومع ذلك، كما هو مبين للبروابط أخرى، وطول ومرونة رابط قد تمكن التفاعل مع إعاقته بأي شكل آخر sterically مواقع الربط، وبالتالي التعويض عن التوجه غير المواتية 36،37. في عمل غير منشورة قارنا خطوة واحدة مع استراتيجية الشلل من خطوتين. المقارنة بين استخدام محلول يحتوي على كل من البروتين وأدوات الربط، والسطح متتابعة ملزمة من رابط والبروتين، وأظهرت أن فقط يومينأدت خطوة في استراتيجية النشطة بيولوجيا يجند الشلل. قد يكون هذا بسبب تأثير التدريع من SAM، مما يعوق تمسخ البروتين يمكن أن تأخذ مكان إلا على الذهب. علاوة على ذلك، منذ يرتكز رابط بالفعل إلى السطح، يتم التحايل عبر الربط بين البروتينات من خلال مجموعات نهاية رابط والخاصة مما أدى تعطيل 38.

للتجارب مع الخلايا حفز مع يجمد سطح rhBMP-2، من الأهمية بمكان لتحديد مسبقا أن C2C12 لم تشكل myotubes في قارورة ثقافة قبل البذر لهم على الركيزة. لذلك، الخلايا يجب أن يوضع subconfluent في الثقافة. دفعة من مصل بقري جنيني المستخدمة لزراعة والتجارب لابد من اختبارها للتأكد من عدم وجود المحفزات المكونة للعظم موجودة. يتم تنفيذ ذلك عن طريق استخدام الفحص Quantikine للكشف عن البروتينات التخلق العظام والخلايا عن طريق اختبار لعلامات التمايز المكونة للعظم، على سبيل المثال alkal المعهد الوطني للإحصاء الفوسفاتيز التعبير. عند التعامل مع ركائز للتحفيز من أعلى الثقافات، فمن المهم مرة أخرى لتجنب أي خدوش مع ملاقط. وينبغي تجنب تجفيف ثقافة والضغط من الخلايا في أي حال من الأحوال، وإلا تشويه الخلايا والموت سوف تؤثر سلبا على الاستجابة لBMP-2 التحفيز. نوصي pipetting لحوالي 100 ميكرولتر من DMEM في كل بئر من لوحة 6 جيدا حيث يتم استزراع الخلايا قبل تطبيق الركيزة على الخلايا. ينبغي التقيد الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن يتم تشغيل أي تغيرات شكلية من خلال وجود الأسطح على أعلى من الثقافات. أخيرا، عند إزالة ركائز، ورفع جانب واحد بعناية مع ملاقط ومقشر الركيزة بلطف. التحقق الفوري عن أي تلف الخلايا باستخدام المجهر حقل مشرق يجب أن يتم تنفيذ، فضلا عن الاختيار من ركائز لتحديد إن وجدت الحبال الخلية أو الشوائب الرئيسية موجودة.

_content "> وفي الختام، يقدم عرض الإجراء من خطوتين أداة مفيدة لشل rhBMP-2 على ركائز عبر بقايا أمين لدراسة تأثيرها على الاستجابات الخلوية. استراتيجية وصفها يجمع العديد من المزايا. فمن ناحية، فإنه ليس من تقتصر على BMP-2، ولكنه يمكن أن ينطبق أيضا على عوامل النمو الأخرى من عائلة BMP، نظرا لأنها تشكل بنية حمض أميني حفظا للغاية. من ناحية أخرى، عن طريق منع امتصاص غير محددة، وهذا النهج يمكن استهداف التحقيق في BMP-2 ، في حين خفض كمية عامل النمو، وعلى الأخص، مما يعوق جامحا من على سطح الأرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر الأستاذ JP شباتز (قسم كيمياء البيوفيزيائية في جامعة هايدلبرغ وإدارة المواد الجديدة والنظم البيولوجية، ومعهد ماكس بلانك للأنظمة الذكية، ومقرها شتوتغارت) لدعمه النوع. كما اعترف الدعم المالي من ماكس بلانك غزلشافت وجمعية الألمانية للبحوث (DFG SFB/TR79 لEAC-A.) إلى حد كبير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27, (16S), S9 (2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13, (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287, (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18, (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7, (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16, (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277, (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20, (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28, (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2, (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8, (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127, (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53, (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50, (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30, (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71, (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56, (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11, (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23, (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237, (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21, (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88, (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22, (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13, (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21, (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24, (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98, (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23, (9), 2079-2087 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics