공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

우리는 표면에 BMP-2를 효율적으로 고정화를 달성하기위한 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 유리 아민 잔기를 통해 BMP-2 공유 결합을 달성하기 위해 자기 조립 단분자막의 형성에 기초한다. 이 방법은 세포막에서 신호를 연구 할 수있는 유용한 도구입니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2) 뼈 조직의 세포 외 매트릭스에 포함 된 성장 인자이다. 따라서 치유와 드 노보 골 형성을 자극하는 조골 세포에 중간 엽 세포 분화의 트리거로 BMP-2의 역할. 비계와 함께 재조합 인간 BMP-2 (rhBMP-2)의 임상 프레 젠 테이션의 형태에 따라, 최근의 논쟁을 제기하고 양이 전달 될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 세포에 대한 생체 외 연구에 BMP-2를 제공하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 우리는 이종 링커 이루어진 자기 조립 단분자막을 형성하는 방법을 설명하고, rhBMP-2의 공유 고정화를 구하는 후속 결합 단계를 나타낸다. 이 방법으로는 단백질의 생물학적 활성을 유지하면서, BMP-2의 지속적인 프레젠테이션을 달성하는 것이 가능하다. 사실, BMP-2의 표면 고정화는 불특정 광고를 방지하여 타겟 조사를 허용orption, 성장 인자의 양을 줄임과 동시에, 특히, 표면에서 제어되지 않는 방출을 방해. 세포가 공유 고정 된 rhBMP-2를 제시 표면에 노출되었을 때 BMP-2에 의해 트리거 모두 단기 및 장기의 신호 이벤트는 BMP-2 자극에 대한 세포 반응에 체외 연구를위한이 방법이 적합하다 일어나고있다.

Introduction

뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2) 형질 전환 성장 인자 (TGF-β) 가족과 드 노보 골 형성 유도뿐만 아니라 배아 발달과 성인 동안 여러 조직의 조절기 역할을 1-3 항상성의 구성원입니다. 생물학적 활성 homodimeric BMP-2 단백질의 각 단량체는 매우 모든 BMP에 4에 보존되어있는 "시스테인 매듭"모티브가 포함되어 있습니다. 일곱 번째 시스테인이 두 단량체 5,6 사이의 분자간 결합을 형성, 이량에 관여하는 반면, 일곱 시스테인 잔기의 여섯, 각각의 단량체를 안정 분자 내 이황화 결합을 형성한다. 이것은 고도로 보존 된 시스테인 매듭은 BMP-2 단백질의 입체 구조를 정의하고 열, 변성제 및 산성 pH 7-9 대한 저항으로서 독특한 특성을 결정한다. BMP-2함으로써 신호 전달을 유도 세린 / 트레오닌 키나아제 막 관통 수용체 바인딩 12 ~ 14과 같은 특정 표적 유전자.

뼈, BMP-2, 따라서 치료 및 뼈의 드 노보 형성을 자극하는 골아 세포에 중간 엽 줄기 세포의 분화를 유도한다. 현재 재조합 BMP-2가 골절 사이트의 치유를 강화하기 위하여 임상 적으로 적용되는 표현. 뼈 조직 공학의 일반적인 전략은 로컬 배달 시스템에 비해 덜 침습적 주사 성장 인자의 사용이다. 그러나, 생체 내 연구 및 임상 응용 프로그램을 보여 그 짧은 생물학적 반감기, 불특정 LOCalization와 BMP-2의 빠른 현지 통관 여러 지역 자궁외 및 조직 문제 (15)가 발생할 수 있습니다. 따라서, 효과적인 프리젠 테이션, 물질 내에서 또는 상 BMP-2의 함정 수사 또는 고정을 얻으려면 대상 사이트에서 로컬 및 지속적인 전달을 위해 필요합니다. 지속 전달은 물리적 포착, 흡착 또는 이온 착물 (16)과 같은 비공유 결합 고정 방식으로 달성 될 수있다. 그러나, 그것은 알려져있다 분자 (17)의 변성의 표면에 단백질의 비특이적 흡착 할 수있다 결과. 성장 인자의 결합을 공유 결합의 경우, 지지체의 종류가 지난 십 년간 개발되어왔다. 예를 들어 단백질의 아미노 또는 카르복시기를 대상으로 관능 링킹 분자의 사용은 반드시 그 고정화를 달성하는 단백질 수정을 요구하지 않는 방식의 한 유형이다. 사실, 반면 단백질 변형 단백질 배향을 제어 이점을 제공한다인공 도메인, 펩타이드 태그 및 부위 특이 적 쇄의 도입은 성장의 생물학적 활성은 17 요인 변경할 수있다. 따라서, 인해 담체와의 상호 작용에 변성을 회피하는, 표면은 원하는 요소 (18)의 결합에 의해 다음에 링킹 분자의 자기 조립 단분자막 (SAM), 예를 들어, 미리 관능 화 될 수있다. 우리는 그것의 유리 아민의 잔류를 대상으로 공유 표면에 BMP-2를 고정시키기 SAM-기반 접근 방식을 사용하고 고정 된 단백질의 단기 및 장기 생물학적 활성 19 두를 유지하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 세포막에서 발생하고 골 형성 신호에 대한 책임 세포 내 신호를 조절하는 메커니즘에 체외 연구를위한 세포에 BMP-2를 제공하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 11-Mercaptoundecanoyl-N-히드 록시 에스테르 (MU-NHS)의 합성

  1. 실온 (RT)에서 40 ㎖ 디클로로 메탄 (PA)에있는 10 ㎖의 아세톤 (PA)에있는 (디메틸 아미노) 피리딘 1g에 11 mercaptoundecanoic 산 - 500 mg의 N-하이드 록시의 솔루션과 30 mg의 4 적하 추가합니다.
  2. 0 ° C에 대한 반응을 냉각과 적하 1.1 g의 N (질소 분위기 하에서) 10 ㎖ 용액에 N '- 디시 클로 헥실를 추가합니다. 1 시간 동안 저온에서 반응을 계속 한 후 실온에서 밤새 교반 하였다.
  3. 침전물을 여과하고 감압 하에서 건조. 1:1 비율 석유 벤젠, 에틸 아세테이트 (PA)으로 플래쉬 크로마토 그래피에 의해 생성물을 정제 하였다.

2. 동종 골드 레이어의 준비

  1. 정밀 물티슈 및 에틸 아세테이트 (PA) 및 메탄올 (PA)의 1:1 혼합물을 함유하는 용액에 5 분 동안 초음파 처리들을 깨끗한 유리 커버 슬립. RINS전자 메탄올 기판 및 질소 흐름 하에서 건조.
  2. 스퍼터 코팅 장치의 깨끗한 기판을 놓습니다. 챔버 대피. 60 초간 스퍼터링에 의해 크롬 타겟으로부터 최상부의 크롬 산화물 층을 제거한다. 금속 빔과 40 nm의 금 층으로 코팅 한 다음에 10 nm의 크롬 층과 코트를 아래의 샘플을 놓습니다.

3. BMP-2의 표면 고정화

  1. 약 1 ㎜의 최종 농도에서 N MU-NHS, N-dimethlyformamide (DMF)에 용해시키고, 질소 대기 하에서 4 시간 동안 RT에서 MU-NHS 용액에 금 기판을 부화.
  2. 2 분 DMF에 초음파 처리 표면은, DMF 및 MeOH로 세척하고 질소 흐름 하에서 건조.
  3. 100 ㎍ / ㎖ (-80 ° C에서 보관 분량 씩)의 농도로 멸균 4 mM의 염산에 rhBMP-2의 주식 솔루션을 준비합니다. 작업 희석액 (3.5 ㎍ / ㎖)의 경우, PBS / 염화나트륨 (PBS 1 M NaCl을 함유)과의 원액을 희석사용하기 직전에 pH를 8.5로 djust.
  4. 4 ° C 하룻밤에 rhBMP-2 작업 솔루션에 MU-NHS를 기능화 표면을 품어. 배양 상층 액을 제거합니다. 초음파 처리 2 분 동안 PBS / 염화나트륨의 표면과 멸균 PBS / NaCl로 3 배 씻는다.

4. 표면 특성

  1. 항체의 비특이적 흡착을 차단하기 위해, 5 % BSA와 표면을 품어 (w / v)의 안티 - BMP-2 항체 (1:100 1 % (W / V를 배양 한 다음 실온에서 1 시간을위한 PBS 용액 RT에서 1 시간 동안) BSA / PBS 용액). PBS와 30 초 동안 초음파 처리로 두 번 표면을 세척 할 것.
  2. 다음 PBS로 두 번 씻어 RT에서 30 분 동안 HRP - 복합 이차 항체 (1:1,000 1 % (W / V) BSA / PBS 용액)으로 기판을 품어.
  3. 플레이트 리더로 ​​570 nm에서 HRP의 효소 활성을 측정하기 위해 Ampliflu 레드 분석을 사용합니다.

5. 생물학적 활성 분석

  1. 6 자 PL 잘 당 종자 1 × 10 5 마우스 C2C12의 근육 아세포10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 37 ° C / 5 % CO 2에서 24 시간 동안 배양들을 보충 된 피루브산을 함유하는 하이 글루코스 DMEM 이루어진 증식 배지에서 ATES.
  2. 고정 된 BMP-2 장식 표면에 파종하기 전에 3-5 시간 동안 혈청이없는 DMEM 세포를 굶어.
  3. 단기 신호 유도의 조사를 위해, 200 ㎕의 신선한 혈청이없는 DMEM에 의해 매체를 교체하고 세포 위의 고정 된 BMP-2 표면을 배치합니다. 표면이 긁히지 않도록 좋은 팁 핀셋으로 취급되어야한다.
  4. 부드럽게 표면을 제거하고 피펫 매체를 대기음, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포 반응의 분석을 진행합니다.
  5. 장기 생물학적 활성, 플레이트 세포의 분석 상 6 일 동안 낮은 혈청 조건 (2 % FBS)에서 37 ° C / 5 % CO 2의 표면과 문화를 그들.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

그것은 생물학적으로 불특정 화학적으로 조정할 수있는 시스템을 제공하기 때문에 우리의 설정에서, 금은 부형제로 선정되었습니다. 또한, 자기 조립 단분자막의 응용 프로그램이 많은 이점을 수반한다 : 자신의 기능 최종 그룹이 추가로 수정 될 수있는 반면 SAM에 자발적으로, 금속 및 결함이 거의 형태의 단일 층에 자신의 "머리 그룹"을 통해 흡착. 따라서 그들은 통제 아직 높은 적응력 방법 (20)에 인터페이스의 속성을 조정할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

금 - 코팅 된 표면에 BMP-2의 고정화를 위해, 우리는 두 단계 접근법을 사용 : 1) 2))도 1을 참조 (단백질 링커를 반응 후 금 층으로 MU-NHS 링커를 바인딩하고. rhBMP-2의 바인딩을 증명하기 위해, 우리는 효소 면역 측정법을 사용했다. 이 분석에서, rhBMP-2는 BMP-2 특이 항체와 HRP가 결합 이차 항체와 배양 고정 제시 표면. 후자의 바인딩 ㄹ 수Ampliflu 레드 솔루션을 사용 etermined. 과산화수소의 존재하에, HRP는 형광 화합물로 레조 루핀 (resorufin) 무색 Ampliflu 레드 (10 - 아세틸 -3,7 - dihydroxyphenoxazine)의 전환을 촉매한다. 우리는 고정 된 표면을 감지 rhBMP-2 (iBMP-2) 이전과 기능화 표면 위에서 자기편 세포에 접근 한 후. Ampliflu 레드 분석과 rhBMP의 검출을 위해, 샘플이 여러 배양 단계와 치료가 부과됩니다. 따라서,이.도 2a는 항-BMP-2의 IgG에 의해 인식 형태의 표면 rhBMP-2의 성공적인 결합을 도시하기 전에 세포의 자극 후 동일한 표면을 조사 가능하지 않다.도 2b 도시 iBMP- 종래 HRP 면역법으로 30 분 동안 세포를 자극하는 데 사용 된이 표면. 비록 세포의 자극 후 단백질을 표면에 검출된다.

고정 된 상대 습도를 제시 표면에 세포 반응BMP-2를 평가하고 비 처리 금 기판 (음성 대조군)의 효과를 비교 하​​였다. 단기 신호의 분석에 접착 공정의 영향을 최소화하기 위하여, 특수 셋업은 세포 자극을 위해 개발되었다. 여기서, C2C12 세포는 상부로부터 접근 rhBMP-2 관능면에서 30 분간 자극 하였다. 마우스 근원 세포 세포주 C2C12 널리 근육 조직에서의 골 형성 동안 골 형성 분화의 초기 단계를 연구하는 모델 시스템으로 사용되는 다 능성 간엽 전구 세포주이다. 이 모델에서, BMP-2는 다핵 myotubes로 세포의 분화를 억제하고 조골 21 표현형을 유도한다. BMP-2 신호 전달 경로의 하류 기자입니다 Smad의 1/5/8의 활성화는, 웨스턴 블롯으로 분석된다. 도 3a에 도시 된 바와 같이 TGF 계통 1/5/8의 제공된 인산화가 발생하는 동안, Smad의 인산화는 iBMP-2 30 분 자극 후에 관찰미처리 세포에서 골드 시료에 노출. 이 결과는 고정 프로세스가 BMP-2 단기 활동을 변경하고 Smad의 신호의 초기 단계를 트리거하지 않음을 나타냅니다.

iBMP -2 장기 조골 세포의 분화에 영향을 미치는지 확인하기 위해 알칼리 포스 파타 아제 (ALP)의 발현 량은, 골 형성 마커, 비색 분석에 의해 조사 하였다. C2C12 세포의 ALP 활성은 일반 골드 (제어) 및 iBMP -2 표면 6 일 동안 세포를 배양 한 후 측정 하였다. iBMP-2 표면에 배양 된 세포의 용 해물의 ALP 활성은 컨트롤 (그림 3B)에 비해 상당히 높은 흡수를 보여줍니다. 이 결과는 iBMP-2는 C2C12 세포의 골 형성 마커 ALP의 발현을 유도함을 보여준다. 이 세포주함으로써 myotubes을 형성 특성 근육 조직의 단백질을 발현, 낮은 혈청 조건에서 도달 포화 상태에 분화하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나, BMP-2와 치료의 변화가 발생따라서 myotubes의 형성을 억제하는 조골 세포에 myoblastic에서 차별화 통로. 근육 생성에 iBMP-2의 영향을 조사하기 위해, C2C12 세포는 골드 (대조군) 또는 기능화 된 표면과 분화 (낮은 혈청) 조건 하에서 배양에 직접 플레이 팅 하였다. 육일 후, 마이 오신 중쇄 (MHC)의 염색을 시행 하였다. 도 3c에 도시 된 바와 같이, C2C12 세포 iBMP-2의 존재하에 MHC 긍정적 myotubes을 형성하지 못할 수 있지만 금 기판 상.

그림 1
그림 1. 금 표면 상 rhBMP-2의 고정화 방법의 방식이. 유리 커버 슬립은 금 층으로 코팅하고,이어서 NHS 기능화 된 자기 조립 단분자막 (SAM)의 결과 이종 링커 (MU-NHS)와 함께 배양된다. BMP-2 차 아민은 공동 선두 링커와 반응기판에 valently 고정 된 단백질. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. rhBMP-2 (A) 전에, 효소 면역 분석법에 의해 검출뿐만 아니라 (B) 세포 자극 실험. 고정화가 rhBMP-2 Ampliflu 레드 비색 분석을 사용하여 정량 한 후, 수 표면 바인딩. 흡수는 570 nm에서 측정 한 데이터 (금 표면 처리하지 않은) 값을 제어하기 위해 표준화되었다. 오차 막대는 평균 N> 3 표준 편차를 나타냅니다.

그림 3
그림 3. 고정 된 rhBMP-2는 생물학적으로 활성 상태로 유지로 단기 유도뿐만 아니라 장기적으로 신호 이벤트는. (A) C2C12 세포를 공유 고정 된 rhBMP-2 (iBMP-2) 상단에서 접근 골드 표면 (제어) 및 표면에 노출에 의해 30 분 동안 자극 하였다. 세포 용해 후, 샘플을 p-Smad1/5/8 및 β-액틴에 immunoblotted했다. (B), 알칼리 인산 분해 효소의 효소 활성 (ALP)는 C2C12 세포의 골 형성 분화를 표시하고 6 일간 배양 한 후 세포 용 해물에서 측정 하였다 제어 또는 각각 iBMP-2면에 기간. ALP 활성은 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 막대 그래프를 보여줍니다 60 분 반응 후 획득 한 데이터. 오차 막대는 0.01. (C) C2C12 세포가 근육 생성 할 수 있도록 낮은 혈청 조건 아래에 6 일 동안 표시된 표면 배양에 접종 하였다 * P <, 표준 편차를 표시, N = 3. 이미지는 마이 오신 중쇄 다핵 myotubes의 (MHC) 염색 (녹색) 및 DAPI 핵 얼룩 (파란색)를 보여줍니다. 이미지 배율 20 배.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜에서 우리는 생리 활성 rhBMP-2와 기능화 표면의 준비에 대해 설명합니다. ; rhBMP-2 단백질의 2) 공유 고정화 금 표면에 관능 링커의 자기 조립 단분자막 (SAM)의 1) 초기 형성 :이 방법은 두 단계를 포함한다. 이전의 연구에서, 우리는 관능 링커 및 성장 인자의 효과적인 결합을 검증하고, 표면 고정화 rhBMP-2의 생물학적 활성 (19)를 유지 것을 보여 주었다. 고정화 된 형태로 제공 성장 인자의 생리 활성은 단백질의 방출 및 그 이후의 내재화는 세포의 자극 (24, 25)에 필수적되지 않는 것을 나타내는 다른 연구에서 밝혀졌다. 세포막 22,2로 인해 수용체의 다른 유형의 개선 된 점유율의 효과적인 투여 량을 유지하면서 실제로, 성장 인자의 공유 결합 고정화는 표적 세포의 지속적인 자극을 허용3,26-28.

고정화 rhBMP-2,주의를 제시하는 표면의 제조를위한 전체 공정에 걸쳐 표면 처리 및 rhBMP-2 용액을 준비하는데주의해야한다. 유리 커버 슬립은 깨끗하고 건조해야하며 결함이나 불순물의 흔적은 볼 수 없어야합니다. 핀셋과 피펫으로 표면을 긁는 것은 피해야한다. rhBMP-2를 사용하여 표면 작용 화 공정의 경우, 표면에 캐리어의 바람직하지 않은 고정화를 피하기 위하여, 제제에 첨가 소 혈청 알부민없이 캐리어 프리 재조합 단백질, 예를 사용하는 것이 필수적이다. rhBMP-2 주식 (100 ㎍ / ㎖)을 4 mM의 염산에 용해된다. 표면이 rhBMP-2 용액으로 배양 될 때, pH는 표면 바인딩 링커의 NHS 기와 단백질의 아미노기의 반응을 향상시키기 위해 약간의 알칼리 pH를 중성으로 조정되어야한다. pH가 너무 낮 으면 그것이 재치 반응 할 수 있기 전에, NHS 기는 가수 분해 될 수도단백질 H 아미노기. 우리는 1 M의 NaCl (29)를 포함하는 PBS를 사용하여 주식에서 rhBMP-2를 추가 한 다음 KOH (10 ㎜)로 pH를 조정합니다.

때문에이 프로토콜을 통해 우리는 표면에 생체 활성 rhBMP-2의 성공적인 고정화를 달성 : 1) 우리는 두 단계를 설립, 2) 우리는 표면으로부터 거리를 얻고에 큰 간섭없이 단백질을 결합하는 적절한 링커를 사용하여 그 수용체와의 상호 작용. 아민 반응성 알칸 티올, 11-mercaptoundecanoyl-N-히드 록시 에스테르 (MU-NHS)를, 첫 번째 단계에서 금 기판에 닿는 하였다. 알칸 티올으로 매우 정렬 된 단층을 형성, 금과 같은 금속에 자기 조립, 그들은 링커 분자의 다양한 30 ~ 32과 표면의 장식을 용이하게합니다. SAM시켜 변성 (32)의 위험을 최소화하는, 고체 표면과 직접 접촉으로부터 생체를 보호한다. 또한, 링커의 길이는 REA를 결정SAM의 ctivity. MU-NHS처럼 11 개 이상의 탄소 원자 이루어진 링커 NHS 기는 짧은 링커 (34)에 대한 결합에 비해 증가 된 단백질 고정화 결과보다 접근 가능하다. rhBMP-2의 고정화는 단백질 (34)의 리신 잔기에 의해 NHS 기의 변위를 통해 발생한다. 단순히 입체 환경을 고려하면, 표면에 고정화 NHS 기의 반응은 대부분가요 N-말단 잔기 (35)에서 일어난다. 다른 리간드 같이하지만, 길이 및 링커의 유연성 따라서 불리한 방향 36,37 보상 달리 입체적 힌 더드 결합 부위와의 상호 작용을 가능하게 할 수 있습니다. 미발표 연구에서 우리는 두 단계 전략을 고정화 한 단계를 비교했다. 단백질 및 링커, 및 링커와 단백질의 결합을 순차적 표면을 모두 포함하는 용액을 사용 간의 비교가 보여 주었다 단지 두단계 전략은 생리 활성 리간드 고정화 결과. 이것은 그렇지 않으면 금에 일어날 수있는 단백질의 변성을 방해 SAM의 차폐 효과에 의한 수 있습니다. 링커가 이미 표면에 고정되어 있기 때문에 한층, 링커 및 그 결과의 불활 단부 그룹을 통해 단백질 간의 가교가 38을 우회한다.

표면 고정화 rhBMP-2로 자극 세포 실험의 경우, C2C12은 기판 상들을 파종 전에 배양 플라스크 myotubes을 형성하지 않았다고 미리 결정하기 위하여 중요하다. 따라서 세포는 문화 subconfluent을 유지해야합니다. 배양과 실험에 사용되는 소 태아 혈청의 배치는 더 골 형성 자극이 존재하지 않는 것을 보장하기 위해 테스트해야합니다. 이것은 뼈 형태 발생 단백질의 검출을 위해 Quantikine 분석법을 이용하여 조골 세포와 분화 마커 세포를 테스트하여 수행되고, alkal 오프라인 인산 식입니다. 문화의 상단에서 자극에 대한 기판을 처리 할 때, 핀셋 긁힘을 방지하기 위해 다시 중요합니다. 세포의 문화와 압착의 건조는 달리 세포 왜곡과 죽음에 부정적인 BMP-2 자극에 대한 반응에 영향을 미칠 것입니다, 어떤 경우에도 피해야한다. 우리는 세포가 세포에 기판을 적용하기 전에 배양 6 - 웰 플레이트의 각 웰에 피펫에게 DME​​M 약 100 μl를 추천합니다. 세포는 형태 학적 변화는 문화의 상단에 표면의 존재에 의해 발생되지 않도록 보장하기 위해 현미경으로 관찰해야한다. 기판을 제거 할 때 마지막으로, 일측은 신중 핀셋으로 들어 올려, 기판 부드럽게 박리된다. 밝은 필드 현미경으로 모든 세포 손상에 대한 즉각적인 확인뿐만 아니라 모든 세포의 사슬이나 주요 불순물이있는 경우에는 결정하기 위해 기판의 검사로 수행해야합니다.

_content는 "> 결론적으로, 제시된 두 단계의 절차는 세포 반응에 미치는 영향을 연구하기 위해 그것의 아민 잔기를 통해 기판 ​​상에 rhBMP-2를 고정화하기 위해 유용한 도구를 제공한다. 기재된 전략은 많은 장점을 결합한다. 한편, 그렇지 BMP-2로 제한하지만, 그들은 고도로 보존 된 아미노산의 구조를 제시 이후 또한, BMP 패밀리의 다른 성장 인자에 적용될 수있다. 한편, 비특이적 흡착을 방지하여,이 접근법은 BMP-2의 조사 대상 가능하게 성장 인자의 양을 줄임과 동시에, 특히, 표면에서 제어되지 않는 방출을 방해.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 자신의 종류의 지원에 교수 JP 파츠 (생물 물리 화학과, 하이델베르크 대학교 및 새로운 재료 및 바이오 시스템학과, 지능형 시스템을위한 맥스 플랑크 연구소, 슈투트가르트) 감사합니다. 막스 플랑크 먼과 도이치 Forschungsgemeinschaft (EAC-A에 DFG SFB/TR79.)에서 재정 지원도 크게 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27, (16S), S9 (2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13, (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287, (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18, (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7, (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16, (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277, (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20, (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28, (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2, (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8, (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127, (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53, (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50, (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30, (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71, (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56, (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11, (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23, (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237, (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21, (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88, (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22, (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13, (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21, (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24, (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98, (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23, (9), 2079-2087 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics