A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

Chemistry

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Summary

Descreve-se um método para realizar a imobilização eficiente de BMP-2 em superfícies. A nossa abordagem é baseada na formação de uma monocamada auto-montada para alcançar a ligação da BMP-2 por meio dos seus resíduos de amina livres covalente. Este método é uma ferramenta útil para o estudo de sinalização na membrana celular.

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Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

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Abstract

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um factor de crescimento incorporados na matriz extracelular do tecido ósseo. BMP-2 atua como gatilho da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cura e formação de osso novo. O uso clínico de humano recombinante BMP-2 (rhBMP-2) em conjunto com andaimes suscitou controvérsias recentes, com base no modo de apresentação e a quantidade a ser entregue. O protocolo aqui apresentado fornece um meio simples e eficaz para entregar a BMP-2 para os estudos in vitro em células. Descrevemos como para formar uma monocamada auto-montada que consiste num ligante heterobifuncional, e mostram o passo de ligação posterior para obter a imobilização covalente de rhBMP-2. Com esta abordagem, é possível conseguir uma apresentação sustentada de BMP-2, enquanto que a manutenção da actividade biológica da proteína. Na verdade, a superfície de imobilização de BMP-2 permite investigações orientadas, impedindo anúncios inespecíficasorption, enquanto reduz a quantidade de factor de crescimento e, mais notavelmente, dificultando a libertação não controlada da superfície. Ambos os eventos de sinalização de curto e longo prazo são desencadeadas por BMP-2 está a ter lugar quando as células são expostas a superfícies que apresentam covalentemente imobilizada a rhBMP-2, tornando esta abordagem adequada para estudos in vitro sobre as respostas celulares a BMP-2 de estimulação.

Introduction

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um membro do factor de crescimento transformante (TGF-β) familiar e actua como indutor da formação de novo osso, bem como regulador de vários tecidos durante o desenvolvimento embrionário e adulto homeostase 1-3. Cada monómero do biologicamente activo homodimérica proteína BMP-2 contém um motivo "nó de cisteína", que é altamente conservada em todos os quatro BMPs. Seis dos sete resíduos de cisteína que formam ligações dissulfureto intramoleculares que estabilizam cada monómero, enquanto a sétima cisteína está envolvido na dimerização, formando uma ligação intramolecular entre os dois monómeros de 5,6. Este nó de cisteína altamente conservado define a estrutura tridimensional da proteína BMP-2 e determina as suas propriedades únicas, tais como a resistência ao calor, desnaturantes e ácida de pH 7-9. BMP-2 liga-se a serina / treonina-quinase de receptores transmembranares, induzindo deste modo a transdução de sinal 12-14.

No osso, a BMP-2 induz a diferenciação de células estaminais mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cicatrização e formação de novo de osso. Actualmente, expressa de forma recombinante BMP-2 é aplicada clinicamente para melhorar a cicatrização de sítios fracturados. Uma estratégia comum na engenharia de tecido ósseo é a utilização de factores de crescimento injectáveis, que é menos invasiva em relação aos sistemas de distribuição local. No entanto, estudos in vivo e aplicações clínicas têm demonstrado que a sua meia-vida biológica curta, loc inespecíficazação e rápida de domiciliação de BMP-2 pode levar a vários problemas locais, ectópica e sistêmicas 15. Assim, para obter uma apresentação eficaz, o aprisionamento ou imobilização de BMP-2 no interior de ou sobre materiais é necessário para o seu local de entrega e mantida no local alvo. Entrega sustentada pode ser conseguida com métodos de retenção não covalentes, tais como a retenção física, adsorção ou complexação de iões 16. No entanto, sabe-se que a adsorção não específica de proteínas para as superfícies podem resulta em desnaturação das moléculas de 17. Para a ligação de fatores de crescimento covalente, diferentes tipos de suportes foram desenvolvidos ao longo da última década. A utilização de moléculas de ligação bifuncionais, que se destinam a grupos amino ou carboxilo da proteína, por exemplo, é um tipo de abordagem que não requer, necessariamente, a modificação de proteínas para alcançar a sua imobilização. De facto, enquanto que a modificação de proteínas oferece a vantagem de controlar a orientação da proteína,a introdução dos domínios artificiais, as etiquetas e cadeias peptídicas específicas do local pode alterar a actividade biológica dos factores de crescimento 17. Assim, para contornar a desnaturação devido à interacção com o material de apoio, as superfícies podem ser previamente funcionalizados, por exemplo, com uma monocamada auto-montada (SAM) de uma molécula de ligação, seguido de acoplamento do fator desejado 18. Usámos uma abordagem baseada no SAM para imobilizar covalentemente BMP-2 para uma superfície de direccionamento dos seus resíduos de amina livre e têm mostrado que a proteína imobilizada retém a sua actividade biológica tanto a curto e longo prazo 19. Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente para entregar BMP-2 em células para estudos in vitro sobre os mecanismos que ocorrem na membrana celular e regulam a sinalização intracelular responsável pela sinalização osteogênica.

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Protocol

1. Síntese de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxissuccinimida (NHS-MU)

  1. Adicionar gota a gota uma solução de 500 mg de N-hidroxissuccinimida e 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina em 10 ml de acetona (aa) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanóico em 40 ml de diclorometano (aa), à temperatura ambiente (RT).
  2. Arrefecer a reacção até 0 ° C e adicionar gota a gota 1,1 g de N, N '-diciclohexilcarbodiimida em 10 ml de diclorometano (sob atmosfera de azoto). Manter a reacção a baixa temperatura durante 1 hora e, em seguida, agita-se à TA durante a noite.
  3. Filtrar o precipitado e secá-lo, sob pressão reduzida. Purifica-se o produto por cromatografia flash com o benzeno de petróleo e acetato de etilo (aa) em uma proporção de 1:1.

2. Preparação de Layers Ouro Homogêneos

  1. Lamelas de vidro limpos com toalhetes de precisão e sonicar las durante 5 minutos em uma solução contendo uma mistura de 1:1 de acetato de etilo (pa) e metanol (pa). Rinse substratos com metanol e secar sob fluxo de nitrogênio.
  2. Colocar os substratos limpos no dispositivo de revestimento por pulverização. Evacuar a câmara. Retirar a camada de óxido de cromo superior da meta de cromo por pulverização catódica para 60 seg. Coloque as amostras debaixo da viga e revesti-los com uma camada de crómio de 10 nm, seguido por revestimento com uma camada de ouro de 40 nm de metal.

3. Imobilização de superfície de BMP-2

  1. Dissolve-MU-NHS em N, N-dimethlyformamide (DMF) a uma concentração final de cerca de 1 mM e incubar substratos de ouro na solução de MU-NHS à TA durante 4 h sob atmosfera de azoto.
  2. Sonicar superfícies em DMF durante 2 minutos, enxaguar com DMF e MeOH e secar sob fluxo de azoto.
  3. Prepara-se uma solução estoque de rhBMP-2 em HCl 4 mM estéril com uma concentração de 100 ug / ml (de loja alíquotas a -80 ° C). Para diluições de trabalho (3,5 ug / ml), dilui-se a solução de reserva em PBS / NaCl (PBS contendo 1 M de NaCl) e umdjust para pH 8,5, imediatamente antes de usar.
  4. Incubar superfícies funcionalizadas MU-NHS na solução de trabalho de rhBMP-2, a 4 ° C durante a noite. Retirar o sobrenadante da incubação. Sonicar superfícies em PBS / NaCl durante 2 min e lavagem 3 x com PBS estéril / NaCl.

4. Superfície Caracterização

  1. Para bloquear a adsorção inespecífica do anticorpo, incubar as superfícies com BSA 5% (w / v) em solução de PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por incubação com um anticorpo anti-BMP-2 do anticorpo (a 1:100 em 1% (w / v ) solução de BSA / PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave as superfícies duas vezes com PBS e sonicado por 30 seg.
  2. Incubar substratos com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:1000 em 1% (w v) / solução de BSA / PBS) durante 30 min à temperatura ambiente, em seguida, lavar duas vezes com PBS.
  3. Use Ampliflu ensaio Vermelho para medir a atividade enzimática HRP a 570 nm com um leitor de placas.

5. Análise da atividade biológica

  1. Semente 1 x 10 5 rato mioblastos C2C12 por poço em 6-bem plmados em meio de crescimento, que consiste em um DMEM de glicose elevada contendo piruvato suplementado com 10% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. Starve células em DMEM isento de soro durante 3-5 horas antes da semeadura sobre as superfícies decoradas com imobilizada BMP-2.
  3. Para efeitos de investigação da indução de sinalização de curto prazo, substituir o meio por 200 ul de DMEM fresco isento de soro e colocar os imobilizadas BMP-2 superfícies superiores das células. A superfície deve ser tratado com pinças de ponta fina para evitar arranhões.
  4. Remova suavemente superfícies e aspirar o meio com uma pipeta, lavar as células duas vezes com PBS. Continuar a análise das respostas das células.
  5. Para a análise da actividade biológica de longo prazo, de células de placa sobre as superfícies e cultura los a 37 ° C / 5% de CO 2 em condições de soro baixo (2% de FBS) durante seis dias.

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Representative Results

Em nossa configuração, o ouro foi escolhido como excipiente, uma vez que fornece um sistema biologicamente inespecífica, mas quimicamente ajustável. Além disso, a aplicação de camadas auto-montagem implica muitas vantagens: SAM adsorver espontaneamente através dos seus grupos "cabeça-" sobre metais e monocamadas de formulário com poucos defeitos, enquanto os grupos terminais funcionais pode ser modificado. Assim, eles proporcionam uma plataforma para adaptar as propriedades da interface de um modo ainda altamente adaptável controlada 20.

Para a imobilização de BMP-2 em superfícies revestidas de ouro, foi utilizada uma abordagem em duas fases: 1) ligação do ligante MU-NHS para a camada de ouro, e em seguida, 2) fazer reagir o ligante com a proteína (ver Figura 1). Para comprovar a ligação do rhBMP-2, foi utilizado um ensaio imunoenzimático. Neste ensaio, apresentando superfícies imobilizada rhBMP-2 foram incubadas com um anticorpo específico de BMP-2 e um anticorpo secundário conjugado com HRP. A ligação deste último pode ser determined usando uma solução Ampliflu vermelho. Na presença de peróxido de hidrogénio, a HRP catalisa a conversão do Ampliflu incolor Vermelho (10-acetil-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) para o composto fluorescente resorufina. Detectamos superfície imobilizada de rhBMP-2 (Ibmp-2) antes e depois de se aproximar células aderentes a partir de cima com superfícies funcionalizadas. Observe que, para a detecção de rhBMP com o ensaio Ampliflu vermelha, as amostras são sujeitas a vários passos de incubação e de tratamentos. Portanto, não é possível investigar a mesma superfície, antes e após a estimulação das células. Figura 2A mostra a ligação bem sucedida do rhBMP-2 para a superfície de uma conformação reconhecida pelo anti-BMP-2 de IgG. Figura 2B mostra uma Ibmp- 2 superfície que foi usado para estimular as células durante 30 min antes do imunoensaio HRP. Mesmo após a estimulação das células, a proteína é detectado na superfície.

Respostas de células a superfícies que apresentam rh imobilizadoBMP-2 foi avaliada e comparada com o efeito de substratos não tratados ouro (controlo negativo). De modo a minimizar a influência do processo de adesão sobre a análise da sinalização de curto prazo, uma configuração especial foi desenvolvido para a estimulação celular. Aqui, as células C2C12 foram estimuladas durante 30 min com rhBMP-2 superfícies funcionalizadas que se aproximam da parte superior. A linha celular de mioblastos C2C12 de rato é uma linha de células precursoras mesenquimais pluripotentes, o que é amplamente usado como um sistema modelo para o estudo da fase inicial de diferenciação osteogénica durante a formação do osso nos tecidos musculares. Neste modelo, a BMP-2 inibe a diferenciação das células em miotubos multinucleados e induz osteoblastos fenótipos 21. A activação de Smad 1/5/8, que são repórteres jusante da BMP-2 via de sinalização, é analisada por transferência Western. Como mostrado na Figura 3A, Smad fosforilação é observada após 30 minutos de estimulação por Ibmp-2, enquanto que nenhuma fosforilação de Smad 1/5/8 ocorreem células expostas a amostras não tratadas de ouro. Este resultado indica que o processo de imobilização não altera a actividade de BMP-2, de curto prazo e desencadeia passos iniciais na sinalização Smad.

Para determinar se Ibmp-2 afecta diferenciação osteogénica a longo prazo, o nível de fosfatase alcalina (ALP) de expressão, um marcador osteogénico, foi investigada por um ensaio colorimétrico. Actividade de ALP de células C2C12 foi medida após a incubação das células durante 6 dias em ouro puro (controlo) e Ibmp-2 superfícies. Actividade de ALP em lisados ​​de células cultivadas em Ibmp-2 superfícies mostra uma absorção significativamente maior em comparação com o controlo (Figura 3B). Este resultado revela que Ibmp-2 induz a expressão do marcador de ALP osteogénico em células C2C12. Esta linha celular é conhecido por diferenciar ao atingir confluência sob baixa condição de soro, formando assim miotubos e expressando proteínas miogênicas característicos. No entanto, o tratamento com BMP-2 faz com que uma mudança noa via de diferenciação de células osteoblásticas a mioblástica, por conseguinte, suprimir a formação de miotubos. Para investigar o efeito da IBMP-2 na miogênese, as células C2C12 foram semeadas diretamente em ouro (controle) ou superfícies funcionalizadas e cultivadas em diferenciação (baixo soro) condições. Após 6 dias, a coloração da cadeia pesada de miosina (MHC), foi realizada. Como mostrado na Figura 3C, as células C2C12 não conseguem formar miotubos MHC positivas na presença de Ibmp-2, mas não sobre substratos de ouro.

Figura 1
Figura 1. Esquema do processo de imobilização de rhBMP-2 sobre as superfícies de ouro. Lamelas de vidro são revestidas com uma camada de ouro e, subsequentemente, incubada com um agente de ligação heterobifuncional (MU-NHS), resultando em uma monocamada auto-montada NHS-funcionalizado (SAM). As aminas primárias de BMP-2 reage com o ligante levando a coproteína valently imobilizado sobre o substrato. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. -Bound superfície rhBMP-2 pode ser detectada através de um imunoensaio enzimático, antes (A), bem como após (B) experiências de estimulação de células imobilizadas. RhBMP-2 foi quantificada usando ensaio colorimétrico Ampliflu vermelho. A absorção foi medida a 570 nm e os dados foram normalizados para o controle (não-tratado superfícies de ouro) valores. As barras de erro representam o desvio padrão da média de n> 3.

Figura 3
Figura 3. Imobilizado rhBMP-2 permanece biologicamente ativa e induz a curto prazo comobem como os eventos de sinalização a longo prazo. (A) células C2C12 foram estimuladas durante 30 min de exposição a superfícies de ouro (controlo) e com superfícies covalentemente imobilizada a rhBMP-2 (Ibmp-2) se aproxima da parte superior. Após a lise celular, as amostras foram imunotransferidas para p-Smad1/5/8 e β-actina. (B) A actividade enzimática de fosfatase alcalina (ALP) indica diferenciação osteogénica de células C2C12 e foi medida a partir de lisados ​​de células, após uma incubação de 6 dias período em controle ou IBMP-2 superfícies, respectivamente. Actividade de ALP foi medida como absorvância a 405 nm. Bar gráfico mostra dados adquiridos depois de 60 min de reação. As barras de erro indicam o desvio padrão, n = 3, * p <0,01. (C) As células C2C12 foram semeadas em superfícies indicados e cultivadas durante 6 dias em condições de soro baixas para permitir myogenesis. Imagens mostram miosina de cadeia pesada (MHC) coloração de miotubos multinucleados (verde) e coloração núcleos DAPI (azul). Imagem de ampliação de 20x.

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Discussion

Neste protocolo, descrevem a preparação de superfícies funcionalizadas com bioactivo rhBMP-2. Esta abordagem compreende dois passos: 1) a formação inicial de uma monocamada auto-montagem (SAM) de um ligante bifuncional sobre a superfície de ouro, 2) de imobilização covalente da proteína de rhBMP-2. Em trabalhos anteriores, que validou a ligação efectiva do ligante bifuncional e o factor de crescimento, e demonstraram que a superfície imobilizada-rhBMP-2 mantém a sua actividade biológica 19. A bioactividade de factores de crescimento apresentados numa forma imobilizada também foi demonstrado em outros estudos, indicando que a libertação das proteínas e sua internalização subsequente não são essenciais para a estimulação celular 24,25. Na verdade, a imobilização covalente de factores de crescimento permite a estimulação sustentada das células alvo, mantendo uma dose eficaz por causa da taxa de ocupação aumentada de diferentes tipos de receptores na membrana celular 22,23,26-28.

Para a preparação de superfícies que apresentam imobilizado rhBMP-2, cuidados devem ser tomados no manuseio das superfícies durante todo o procedimento e na preparação da solução rhBMP-2. As lamelas de vidro deve ser limpo e seco e sem sinais de defeito ou impurezas deve ser visível. Arranhando a superfície com uma pinça e pipetas devem ser evitados. Para a etapa de funcionalização da superfície utilizando a rhBMP-2, é essencial utilizar uma proteína recombinante isento de transportador, isto é, sem adição de albumina de soro de bovino para a preparação, a fim de evitar a imobilização indesejável do veículo sobre a superfície. A rhBMP-2 estoque (100 ug / ml) é dissolvido em HCl 4 mM. Quando as superfícies são incubadas com a solução de rhBMP-2, o pH deve ser ajustado para neutro a ligeiramente alcalino de pH para aumentar a reacção do grupo amino da proteína com o grupo NHS do ligante ligado à superfície. Se o pH é demasiado baixo, o grupo NHS pode ser hidrolisado antes que possa reagir with os grupos amino da proteína. Usamos PBS contendo 1 M de NaCl 29 e adicionar rhBMP-2 a partir de ações e, em seguida, ajustar o pH com KOH (10 mM).

Com este protocolo conseguimos a imobilização de sucesso de bioativos rhBMP-2 em superfícies, porque: 1) estabelecemos uma abordagem em duas fases, 2) foi utilizado um ligador adequado para obter distância da superfície e se ligar a proteína sem grandes interferências na sua interacção com o receptor. O alcanotiol amino-reactivo, éster 11-mercaptoundecanoyl-N-hidroxissuccinimida (NHS-MU), foi amarrado ao substrato de ouro no primeiro passo. Como alcanotióis auto-montar em metais, como o ouro, a formação de uma monocamada altamente ordenada, que facilitam a decoração de superfícies com uma variedade de moléculas de ligação 30-32. O SAM protege biomoléculas do contato direto com a superfície sólida, minimizando assim o risco de desnaturação 32. Além disso, o comprimento do ligante, também determina a reactivity da SAM. Os grupos NHS de ligantes que consistem em, pelo menos, onze átomos de carbono, tal como a MU-NHS, são mais acessíveis, o que resulta em aumento da imobilização da proteína em comparação com a ligação a ligantes mais curtos 34. A imobilização de rhBMP-2 ocorre por meio do deslocamento do grupo NHS por os resíduos de lisina da proteína 34. Considerando apenas o ambiente estérico, a reacção dos grupos NHS imobilizada de superfície mais provável ocorre entre os resíduos N-terminais flexíveis 35. No entanto, como mostrado por outros ligandos, o comprimento e a flexibilidade do ligante pode permitir a interacção com outra forma estereoquimicamente impedido locais de ligação, de modo a compensar para a orientação desfavorável 36,37. Em um trabalho inédito que comparou a um passo de uma estratégia de imobilização de duas etapas. A comparação entre o uso de uma solução contendo a proteína e ligantes, e a ligação do ligante e a proteína de superfície sequencial, mostrou que apenas a doisestratégia passo resultou na imobilização ligante bioativo. Isto pode ser devido a um efeito de blindagem do SAM, o que impede a desnaturação das proteínas que de outra forma poderia ocorrer em ouro. Além disso, uma vez que o ligante já está ancorado à superfície, ligações cruzadas entre as proteínas através dos grupos terminais do ligador e a sua inactivação resultante são contornadas 38.

Para as experiências com células estimuladas com imobilizada na superfície de rhBMP-2, é crucial para determinar de antemão que a C2C12 não formar miotubos em frasco de cultura antes da sementeira los sobre o substrato. Portanto, as células têm que ser mantidas em cultura subconfluente. O lote de soro fetal bovino utilizado para a cultura e para as experiências devem ser testados para garantir que não há estímulos osteogénicas estão presentes. Isto é realizado através da utilização do ensaio de Quantikine para a detecção de proteínas morfogenéticas dos ossos e testando as células para os marcadores de diferenciação osteogénicas, por exemplo alkal expressão da fosfatase ine. Ao manipular os substratos para a estimulação da parte superior da culturas, é novamente importante para evitar quaisquer riscos com a pinça. A secagem da cultura e compressão das células deve ser evitado, em qualquer caso, de outro modo a distorção e morte celular irá afectar negativamente a resposta a BMP-2 de estimulação. Recomendamos pipetagem cerca de 100 ul de DMEM em cada poço de uma placa de 6 poços, onde as células são cultivadas antes da aplicação do substrato para as células. As células devem ser observadas ao microscópio para assegurar que não há mudanças morfológicas são disparados pela presença das superfícies de topo das culturas. Finalmente, quando a remoção dos substratos, de um lado é cuidadosamente levantada com as pinças e o substrato é desenrolada suavemente. Uma verificação imediata de qualquer dano celular com um microscópio de campo brilhante deve ser realizada, bem como um controlo dos substratos, para determinar se quaisquer amarras celulares ou as impurezas principais estão presentes.

_content "> Em conclusão, o processo de dois passos apresentada fornece uma ferramenta útil para imobilizar a rhBMP-2 sobre substratos por meio dos seus resíduos de amina para estudar o seu impacto na resposta celular. A estratégia descrita combina muitas vantagens. Por um lado, não é restrita a BMP-2, mas pode também ser aplicado a outros factores de crescimento da família de BMP, uma vez que apresentam uma estrutura de aminoácidos altamente conservada. Por outro lado, através da prevenção da adsorção não específica, esta abordagem permite a investigação de BMP-2 alvejado , ao mesmo tempo reduzir a quantidade de factor de crescimento e, mais notavelmente, dificultando libertação não controlada da superfície.

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Disclosures

Autores têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Prof JP Spatz (Departamento de Química Biofísica, da Universidade de Heidelberg e do Departamento de Novos Materiais e Biosystems, do Instituto Max Planck para Sistemas Inteligentes, Stuttgart) por seu apoio gentil. O apoio financeiro do Max-Planck-Gesellschaft ea Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) São também reconheceu muito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

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References

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