Kovalent Bindning av BMP-2 på ytorna med en själv monterade monolager Approach

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver ett förfarande för att åstadkomma en effektiv immobilisering av BMP-2 på ytor. Vår strategi bygger på bildandet av en själv monterat cellslager för att uppnå den kovalenta bindningen av BMP-2 via dess fria aminrester. Denna metod är ett användbart verktyg för att studera signalering på cellmembranet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Benmorfogenetiskt protein 2 (BMP-2) är en tillväxtfaktor som är inbäddad i den extracellulära matrisen av benvävnad. BMP-2 fungerar som utlösare av mesenkymala celldifferentiering i osteoblaster, och därmed främja läkning och de novo benbildning. Den kliniska användningen av rekombinant humant BMP-2 (rhBMP-2) i samband med byggnadsställningar har höjt senaste tidens kontroverser, baserad på läget för presentation och det belopp som skall levereras. Protokollet presenteras här ger ett enkelt och effektivt sätt att leverera BMP-2 för in vitro-studier på celler. Vi beskriver hur man bildar ett själv monterade monolager bestående av en heterobifunktionell linker, och visar den efterföljande bindande steg för att få kovalent immobilisering av rhBMP-2. Med denna metod är det möjligt att uppnå en ihållande presentation av BMP-2 under bibehållande av den biologiska aktiviteten av proteinet. I själva verket ytan immobilisering av BMP-2 möjliggör målinriktade undersökningar genom att förhindra ospecifika annonserorption, samtidigt som mängden av tillväxtfaktor och, framför allt, vilket hindrar okontrollerat utsläpp från ytan. Både på kort och lång sikt signalering händelser som utlöses av BMP-2 sker när cellerna utsätts för ytor som uppvisar kovalent immobiliserade rhBMP-2, vilket gör denna metod lämplig för in vitro-studier på cell svar på BMP-2-stimulering.

Introduction

Benmorfogenetiskt protein 2 (BMP-2) är en medlem av den transformerande tillväxtfaktor (TGF-β)-familjen och verkar som inducerar de novo benbildning samt regulator av flera vävnader under embryonal utveckling och vuxen homeostas 1-3. Varje monomer av den biologiskt aktiva homodimera BMP-2-proteinet innehåller en "cysteinknuten" motiv, som är starkt konserverad i alla BMP 4. Sex av de sju cysteinrester bilda intramolekylära disulfidbindningar som stabiliserar varje monomer, medan den sjunde cystein är involverad i dimerisering, som bildar en intermolekylär bindning mellan de två monomererna 5,6. Denna starkt konserverade cysteinknuten definierar den tredimensionella strukturen av BMP-2-protein och bestämmer dess unika egenskaper, såsom motståndskraft mot värme, denatureringsmedel och sura pH 7-9. BMP-2 binder till serin / treonin-kinas-transmembranreceptorer och därigenom inducera signaltransduktion 12-14.

I ben, BMP-2 inducerar differentiering av mesenkymala stamceller till osteoblaster, och därmed främja läkning och nybildning av ben. För närvarande rekombinant uttryckta BMP-2 appliceras kliniskt för att förbättra läkningen av brutna platser. En vanlig strategi i benvävnadsteknik är användningen av injicerbara tillväxtfaktorer, som är mindre invasiv jämfört med lokala administreringssystem. Emellertid har in vivo-studier och kliniska tillämpningar visat att korta biologiska halveringstiden, ospecifik localisering och snabb lokal clearance av BMP-2 kan leda till flera lokala, ektopiska och systematiska problem 15. Därför är nödvändigt för dess lokala och ihållande leverans vid målplatsen för att få en effektiv presentation, den fastnar eller immobilisering av BMP-2 inom eller på material. Fortsatt leverans kan uppnås med icke-kovalenta behålla metoder, såsom fysisk entrapment, adsorption eller jon komplex 16. Emellertid är det känt att ospecifik adsorption av proteiner till ytor kan resulterar i denaturering av molekylerna 17. För den kovalenta bindningen av tillväxtfaktorer har olika typer av bärare har utvecklats under det senaste decenniet. Användningen av bifunktionella länkmolekyler som riktar amino-eller karboxylgrupper av proteinet till exempel, är en typ av tillvägagångssätt som inte nödvändigtvis kräver proteinmodifiering för att uppnå sitt immobilisering. I själva verket erbjuder medan proteinmodifiering fördelen av att styra proteinorientering,införandet av artificiella domäner peptidmärkningar och platsspecifika kedjorna kan förändra den biologiska aktiviteten av tillväxtfaktorerna 17. Således, för att kringgå denaturering på grund av växelverkan med det stödjande materialet, ytor kan funktionaliseras i förväg, till exempel, med ett självmonterat monoskikt (SAM) i en sammanlänkande molekyl, följt av koppling av den önskade faktorn 18. Vi har använt en SAM-baserad metod för att kovalent immobilisera BMP-2 på en yta genom att rikta dess fria aminrester och har visat att det immobiliserade proteinet behåller både sin korta-och långsiktiga biologiska aktiviteten 19. Protokollet ger ett enkelt och effektivt sätt att leverera BMP-2 till celler för in vitro studier av de mekanismer som sker vid cellmembranet och reglerar intracellulär signalering ansvarig för osteogena signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntes av 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxisuccinimidester (MU-NHS)

  1. Tillsätt droppvis en lösning av 500 mg N-hydroxisuccinimid och 30 mg 4 - (dimetylamino) pyridin i 10 ml aceton (pa) till 1 g 11-mercaptoundecanoic syra i 40 ml diklormetan (pa) vid rumstemperatur (RT).
  2. Kyl reaktionsblandningen till 0 ° C och tillsätt droppvis 1,1 g N, N'-dicyklohexylkarbodiimid i 10 ml diklormetan (under kväveatmosfär). Håll reaktionen vid låg temperatur under 1 timme och rör sedan om vid RT över natten.
  3. Filtrera fällningen och torka under reducerat tryck. Rena produkten genom flash-kromatografi med petroleum bensen och etylacetat (pa) i ett förhållande av 01:01.

2. Beredning av Homogena Gold Layers

  1. Rena glastäckglas med precision våtservetter och sonikera dem under 5 min i en lösning innehållande en 01:01 blandning av etylacetat (pa) och metanol (Pa). Rinse-substrat med metanol och torka under kväveflöde.
  2. Placera de rena substrat i sputterbeläggning enheten. Evakuera kammaren. Ta bort det översta skiktet av kromoxid från krom målet genom sputtering för 60 sek. Placera proverna på undersidan av metallbalk och belägga dem med en 10 nm kromskikt, följt av beläggning med en 40 nm guldskikt.

3. Ytans Immobilisering av BMP-2

  1. Lös MU-NHS i N, N-dimethlyformamide (DMF) till en slutlig koncentration av cirka 1 mM och inkubera guldsubstrat i MU-NHS-lösning vid RT i 4 h under kväveatmosfär.
  2. Sonikera ytor i DMF under 2 minuter, sköljdes med DMF och MeOH och torka under kväveflöde.
  3. Bered en förrådslösning av rhBMP-2 i steril 4 mM HCl med en koncentration av 100 | ig / ml (lagra alikvoter vid -80 ° C). För arbetsspädningar (3,5 | ig / ml), utspädd stamlösning i PBS / NaCl (PBS innehållande 1 M NaCl) och endjust till pH 8,5 omedelbart före användning.
  4. Inkubera ytor functionalized MU-NHS i den rhBMP-2 arbetslösning vid 4 ° C över natten. Ta inkubation supernatanten. Sonikera ytor i PBS / NaCl under 2 min och tvätta 3x med steril PBS / NaCl.

4. Ytkarakterisering

  1. För att blockera ospecifik adsorption av antikropp, inkubera ytor med en 5% BSA (vikt / volym) i PBS-lösning under 1 timme vid RT, följt av inkubation med en anti-BMP-2-antikropp (1:100 i 1% (vikt / volym ) BSA / PBS-lösning) under 1 h vid RT. Tvätta ytorna två gånger med PBS och sonikera under 30 sek.
  2. Inkubera substrat med HRP-konjugerad sekundär antikropp (1:1000 i 1% (vikt / volym) BSA / PBS-lösning) under 30 min vid RT, sedan tvätta två gånger med PBS.
  3. Använd Ampliflu Röd analys för att mäta HRP enzymatisk aktivitet vid 570 nm med en plattläsare.

5. Analys av biologisk aktivitet

  1. Seed 1 x 10 5 mouse C2C12 myoblaster per brunn i 6-brunnars plates i tillväxtmedium, bestående av en hög glukos DMEM innehållande pyruvat supplementerat med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin och inkubera dem i 24 timmar vid 37 ° C / 5% CO2.
  2. Svälta celler i serumfritt DMEM under 3-5 h före ympning på ytorna dekorerad med immobiliserad BMP-2.
  3. För att utreda kortsiktiga signalering induktion, byt mediet med 200 l färska serumfritt DMEM och placera immobiliserade BMP-2 ytor ovanför cellerna. Ytan ska hanteras med fin spets pincett för att undvika repor.
  4. Ta försiktigt ytor och aspirera mediet med en pipett, tvätta cellerna två gånger med PBS. Gå vidare till analys av svaren cell.
  5. För analys av långsiktig biologisk aktivitet, plåtceller på ytor och kultur dem vid 37 ° C / 5% CO 2 i låga serumförhållanden (2% FBS) för sex dagar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vår inställning, var guld valdes som hjälpämne, eftersom det ger en biologiskt ospecifik men kemiskt avstämbara systemet. Dessutom tillämpningen av självorganiserande monolager medför många fördelar: SAMs spontant adsorbera via deras "huvud-grupper" på metaller och bildar monolager med få defekter, medan deras funktionella slut grupper kan ytterligare modifieras. Alltså de ger en plattform för att skräddarsy egenskaperna för gränssnittet på ett kontrollerat men mycket anpassningsbart sätt 20.

För immobilisering av BMP-2 på guldbelagda ytor, använde vi en strategi i två steg: en) bindning MU-NHS-länk till guld lager, och sedan 2) reaktion av länkaren med proteinet (se figur 1). För att visa bindningen av rhBMP-2, använde vi en enzym immunoanalys. I denna analys ytorna presenter immobiliserad rhBMP-2 inkuberades med en BMP-2-specifik antikropp och en sekundär antikropp konjugerad med HRP. Bindningen av den senare kan vara determined använder en Ampliflu röd lösning. I närvaro av väteperoxid, HRP katalyserar omvandlingen av den färglösa Ampliflu Röd (10-acetyl-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) till den fluorescerande föreningen resorufin. Vi detekterade ytan immobiliserad rhBMP-2 (IBMP-2) före och efter närmar vidhäftande celler från ovan med funktionaliserade ytor. Observera att för detektion av rhBMP med Ampliflu Red analysen, proverna är föremål för flera inkubationssteg och behandlingar. Därför är det inte möjligt att undersöka samma yta före och efter cellstimulering. Figur 2A visar den framgångsrika bindningen av rhBMP-2 på ytan i en konformation som känns igen av anti-BMP-2-IgG. Figur 2B visar en IBMP- 2 yta som användes för att stimulera cellerna under 30 min före den HRP-immunoanalys. Även efter cellstimulering proteinet detekteras på ytan.

Cell reaktioner på ytor som utgör immobiliserade rhBMP-2 utvärderades och jämfördes med effekten av icke-behandlade guldsubstrat (negativ kontroll). För att minimera påverkan av adhesionen processen på en analys av den kortsiktiga signalerades en speciell uppställning utvecklad för cellstimulering. Här var C2C12-celler stimulerades under 30 min med rhBMP-2 functionalized ytor närmar sig från toppen. Musen myoblast cellinje C2C12 är en pluripotenta mesenkymala föregångare cellinje, som ofta används som ett modellsystem för att studera det tidiga stadiet av osteogen differentiering under benbildning i muskelvävnader. I denna modell, BMP-2 hämmar differentiering av celler i flerkärniga myotubes och inducerar osteoblast fenotyper 21. Aktiveringen av Smad 1/5/8, som är nedströms reportrar i BMP-2 signalväg, analyseras genom Western blotting. Såsom visas i figur 3A, Smad fosforylering observerades efter 30 minuters stimulering med IBMP-2, medan ingen fosforylering av Smad 1/5/8 inträffari celler som utsätts för obehandlade guldprover. Detta resultat indikerar att immobiliseringsprocessen inte ändrar BMP-2 korttidsverksamhet och utlöser tidiga steg i Smad signalering.

För att bestämma huruvida IBMP-2 påverkar långtids osteogen differentiering, expressionsnivån av alkaliskt fosfatas (ALP), ett osteogent markör, undersöktes genom en kolorimetrisk analys. ALP-aktiviteten av C2C12-celler mättes efter inkubation av cellerna under 6 dagar på vanligt guld (kontroll) och IBMP-två ytor. ALP-aktivitet i lysat från celler odlade på IBMP-två ytor uppvisar en betydligt högre absorption i jämförelse med kontrollen (figur 3B). Detta resultat visar att IBMP-2 leder till uttryck av den osteogena markör ALP i C2C12 celler. Denna cellinje är känd för att skilja på att nå sammanflytning under lågt serum tillstånd, och därigenom bilda myotuber och uttrycka karakteristiska myogenic proteiner. Men behandling med BMP-2 orsakar en förskjutning idifferentieringsvägen från myoblastic till osteoblastiska, därför undertrycka bildningen av myotuber. För att undersöka effekten av IBMP-2 på myogenes ades C2C12 celler ut direkt på guld (kontroll) eller funktionaliserade ytor och odlas under differentiering (låg serum) förhållanden. Efter 6 dagar tillsattes färgning av myosin tung kedja (MHC) utförs. Såsom visas i figur 3C, C2C12-celler att misslyckas att bilda MHC positiva myotuber i närvaro av IBMP-2, men inte på guldsubstrat.

Figur 1
Figur 1. Scheme of immobiliseringsprocessen av rhBMP-2 på guldytor. Täckglas av glas belagda med ett guldskikt och inkuberades därefter med en heterobifunktionell linker (MU-NHS), vilket gav en NHS-functionalized egna sammansatta monolager (SAM). Primära aminer med BMP-2 reagerar med den linker som leder till covalently immobiliserade protein på substratet. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Ytbundna rhBMP-2 kan detekteras genom enzymatisk immunanalys före (A) och efter (B) cellstimuleringsexperiment. Immobiliserade rhBMP-2 kvantifierades med hjälp Ampliflu Red kolorimetrisk analys. Absorptionen uppmättes vid 570 nm och data normaliserades för att styra (obehandlad guld ytor) värden. Felstaplar representerar standardavvikelsen från medelvärdet n> 3.

Figur 3
Figur 3. Immobiliserad rhBMP-2 förblir biologiskt aktiva och inducerar kortsiktiga somsåväl som långsiktiga signalering händelser. (A) C2C12 celler stimulerades i 30 min efter exponering för guld ytor (kontroll) och ytor med kovalent immobiliserade rhBMP-2 (IBMP-2) närmar sig från toppen. Efter cellys togs prover immunoblottades för p-Smad1/5/8 och β-aktin. (B) Den enzymatiska aktiviteten hos alkaliskt fosfatas (ALP) indikerar osteogen differentiering av C2C12-celler och mättes från cellysat efter en 6 dagars inkubation period på kontroll eller IBMP-2 ytor, respektive. ALP-aktivitet mättes som absorbans vid 405 nm. Staplarna visar data som erhållits efter en 60-min reaktion. Felstaplarna anger standardavvikelse, n = 3, * p <0.01. (C) C2C12 såddes på angivna ytor och odlades under 6 dagar vid för lite serum för att möjliggöra myogenes. Bilder visar myosin tung kedja (MHC) färgning av flerkärniga myotubes (grön) och DAPI kärnor färgning (blå). Bild förstoring 20x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll beskriver vi förberedelserna av ytor funktion med bioaktiva rhBMP-2. Denna metod innefattar två steg: 1) den initiala bildningen av ett självsamlande monoskikt (SAM) av en bifunktionen linker på guldytan, 2) kovalent immobilisering av rhBMP-2-protein. I tidigare arbete, validerade vi en effektiv bindning av den bifunktionella linkern och tillväxtfaktorn, och visade att yt-immobiliserade rhBMP-2 bibehåller sin biologiska aktivitet 19. Bioaktiviteten av tillväxtfaktorer som presenteras i en immobiliserad form har också visats i andra studier, vilket tyder på att frisättningen av proteinerna och deras efterföljande intemalisering är inte nödvändiga för cellstimulering 24,25. I själva verket är den kovalenta immobiliseringen av tillväxtfaktorer tillåter fördröjd stimulering av målceller under upprätthållande av en effektiv dos på grund av förbättrad beläggning på olika typer av receptorer på cellmembranet 22,23,26-28.

För beredning av ytor som uppvisar immobiliserade rhBMP-2, försiktighet bör iakttas vid hantering av ytor under hela förfarandet och i förberedelserna av rhBMP-2-lösning. De glas täckglas ska vara ren och torr och inga tecken på defekt eller föroreningar ska vara synliga. Repa ytan med pincett och pipetter bör undvikas. För ytan funktionsteg med hjälp av rhBMP-2, är det viktigt att använda en bärare fritt rekombinant protein, dvs utan tillsatt bovinserumalbumin i beredningen, för att undvika oönskad immobilisering av bäraren på ytan. Den rhBMP-2 lager (100 ^ g / ml) löses i 4 mM HCl. När ytorna inkuberas med rhBMP-2-lösning, bör pH-värdet justeras till neutralt till svagt alkaliskt pH för att förbättra reaktion av aminogruppen av proteinet med NHS grupp av den ytbundna linker. Om pH-värdet är för lågt, kan NHS-gruppen hydrolyseras innan det kan reagera with aminogrupperna av proteinet. Vi använder PBS innehållande 1 M NaCl 29 och lägga rhBMP-2 från lager och sedan justera pH med KOH (10 mM).

Med detta protokoll vi uppnått den framgångsrika immobilisering av bioaktiva rhBMP-2 på ytor eftersom: 1) vi etablerat en strategi i två steg, 2) vi använt en lämplig länkaren för att få avstånd från ytan och att binda proteinet utan större störningar på dess interaktion med receptorn. Aminreaktiva alkantiol, 11-mercaptoundecanoyl-N-hydroxisuccinimidester (MU-NHS) var bundna till guld substratet i det första steget. Som alkantioler själv montera på metaller som guld, som utgör en mycket beställde monolager, de underlättar dekoration av ytor med olika linkermolekyler 30-32. SAM skyddar biomolekyler från direkt kontakt med fast yta, vilket minimerar risken för denaturering 32. Vidare, längden av länken bestämmer också reactivity av SAM. The NHS-grupperna av linkers som består av åtminstone elva kolatomer, såsom MU-NHS, är mer tillgängligt, vilket resulterar i ökad protein immobilisering jämfört med bindning till kortare linkers 34. Immobiliseringen av rhBMP-2 sker genom förskjutning av den NHS-gruppen av lysinrester i proteinet 34. Med tanke på enbart den steriska miljön, sker reaktionen av yt-immobiliserade NHS grupper troligen rum vid de flexibla N-terminala resterna 35. Emellertid, såsom visas för andra ligander, kan längden och flexibiliteten hos linker möjliggöra interaktion med annars steriskt hindrad bindningsställen och därmed kompensera för ogynnsam orientering 36,37. I opublicerat arbete jämförde vi ett steg med en två-stegs immobilisering strategi. Jämförelsen mellan användning av en lösning innehållande både protein och linkers, och den sekventiella ytbindning av linkern och proteinet, visade att endast den två-steg strategi ledde bioaktiva ligand immobilisering. Detta kan vara på grund av en skärmningseffekt av SAM, vilket hindrar proteindenaturering som i annat fall skulle kunna äga rum på guld. Eftersom vidare linkern är redan förankrad till ytan, är tvärbindning mellan proteiner via ändgrupperna av linkern och deras resulterande inaktive kringgås 38.

För experiment med celler som stimulerats med utanpå immobiliserade rhBMP-2, är det viktigt att bestämma på förhand att C2C12 inte bildar myotubes i odlingskolven före sådd dem på underlaget. Därför celler måste hållas subkonfluenta i kultur. Det parti av fetalt bovint serum som används för odling och för experimenten måste testas för att säkerställa att inga osteogena stimuli är närvarande. Detta utförs med hjälp av Quantikine-analys för detektering av ben morfogenetiska proteiner och genom att testa de celler för osteogena differentieringsmarkörer, exempelvis alkal ine fosfatas uttryck. Vid hantering av substraten för stimuleringen från toppen av kulturer, är det återigen viktigt att undvika eventuella repor med pincetten. Torkning av kulturen och pressning av cellerna bör undvikas i alla fall, annars cell distorsion och död kommer att negativt påverka svaret på BMP-2-stimulering. Vi rekommenderar pipettering ca 100 | il av DMEM i varje brunn i en 6-brunnars platta där cellerna odlas före applicering av substratet på cellerna. Celler bör observeras under mikroskop för att försäkra att inga morfologiska förändringar utlöses av närvaron av ytorna ovanpå kulturerna. Slutligen, när man tar bort substraten, en sida är noggrant lyftas med pincetten och substratet försiktigt avskalades. En omedelbar check på någon cellskada med en ljus fältmikroskop bör utföras, samt en kontroll av substraten för att bestämma om några cell tjuder eller betydande föroreningar är närvarande.

_content "> Sammanfattningsvis ger den presenterade tvåstegsförfarande ett användbart verktyg för att immobilisera rhBMP-2 på substrat via dess aminrester för att studera dess effekter på cellulära svar. Den beskrivna strategin kombinerar många fördelar. Å ena sidan är det inte begränsade till BMP-2, men den kan också tillämpas på andra tillväxtfaktorer av BMP-familjen, eftersom de utgör en mycket konserverad aminosyrastruktur. Å andra sidan, genom att förhindra ospecifik adsorption, detta tillvägagångssätt möjliggör målinriktad undersökning av BMP-2 , samtidigt som mängden av tillväxtfaktor och, framför allt, hindrar okontrollerat utsläpp från ytan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi tackar Prof. JP Spatz (Institutionen för biofysikalisk kemi, Heidelbergs universitet och institutionen för nya material och Biosystems, Max Planck-institutet för intelligenta system, Stuttgart) för hans vänliga stöd. Det ekonomiska stödet från Max-Planck-Gesellschaft och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 till EAC-A.) Är också i hög grad erkänt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27, (16S), S9 (2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13, (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287, (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18, (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7, (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16, (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277, (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20, (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28, (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2, (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8, (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127, (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53, (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50, (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30, (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71, (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56, (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11, (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23, (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237, (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105, (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21, (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88, (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22, (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13, (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21, (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24, (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98, (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23, (9), 2079-2087 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics