ヘルシンキラット顕微側壁動脈瘤モデル

1Neurosurgery Research Group, University of Helsinki, Helsinki, Finland
Published 10/12/2014
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Medicine

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Summary

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Marbacher, S., Marjamaa, J., Abdelhameed, E., Hernesniemi, J., Niemelä, M., Frösen, J. The Helsinki Rat Microsurgical Sidewall Aneurysm Model. J. Vis. Exp. (92), e51071, doi:10.3791/51071 (2014).

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Abstract

実験嚢状動脈瘤モデルは、彼らが臨床診療に導入される前に小説外科と血管内治療の選択肢とデバイスをテストするために必要である。さらに、実験モデルは、嚢状動脈瘤の破裂につながる複雑な動脈瘤生物学を解明するために必要とされる。

嚢状動脈瘤のための実験モデルのいくつかの異なる種類の異なる種で確立されている。彼らの多くは、しかし、彼らの広範な使用が制限される、特別なスキル、高価な機器、または特別な環境を必要とします。単純堅牢で安価な実験モデルは、さまざまな機関で標準化された方法で使用することができる標準化されたツールとして必要とされる。

顕微ラット腹部大動脈側壁動脈瘤モデルは、標準化された安価な新規な血管内治療戦略や動脈瘤生物学の分子的基礎の両方を研究する可能性を兼ね備えやり方。形状、サイズ、および形状によって標準化された移植片は、ドナーラットの胸部下行大動脈から採取した後、同系レシピエントラットに移植されています。動脈瘤は、連続して、端側を縫合または大動脈、腹部大動脈に9-0ナイロン縫合糸を中断されます。

私たちは、ステップバイステップの手続きの手順、必要な機器についての情報を提示し、ラットにおける腹部大動脈側壁瘤の成功顕微作成のための重要な解剖と手術の詳細を説明します。

Introduction

嚢状脳動脈瘤の破裂は、脳卒中、永続的な神経障害、または死亡につながる生命を脅かす出血を引き起こす。破裂は、どちらか顕微クリッピングや血管内動脈瘤の閉塞を防止することができる。動脈瘤の成長および破裂を防止するための医療処置は、未だ確立されていない。

嚢状動脈瘤のための実験モデルは、動脈瘤の生物学を研究し、新たな治療デバイスおよび戦略のテストのために必要である。これらの目的のために、異なる種におけるいくつかの異なるモデルが開発され、1が公開されている。ブタ、イヌ、ウサギにおける大きな動脈瘤モデルは、好ましくは、複雑な動脈瘤アーキテクチャ1,2に血管内イノベーションを試験するために使用される。マウス動脈瘤モデルは、他の一方で、遺伝的に改変された生物種3,4における試験研究の質問を可能にし、細胞および分子で動脈瘤生物学の明確化を促進大きな種1よりもはるかに優れレベル。血管内トランス-頸動脈及びトランス腸骨のデバイスの展開が大きくラット(> 400〜500グラム)に制限されており、2.0ミリメートル、直径5,6において1.5ミリメートルより小さいステントが、ステントは、腹部大動脈への直接挿入することによっても配置することができる実験的な動脈瘤を保有するセグメント。ラット顕微腹部大動脈側壁動脈瘤モデルを用いた以前の研究は、テストの新規塞栓デバイスでの実現可能性と動脈瘤生物3,7の分子的基礎を研究する中でのその使用を実証した。

現在公開されている実験的な嚢状動脈瘤モデルの多くは、高価な機器、特殊環境(X線透視能力を持つ例えば 、滅菌手術室)、インターベンショナルラジオロジー·コンピタンス、または高価な種の使用を必要とする。これらの要件は、これらのモデルの広範な使用を制限し、そしてmは異なる研究室での異なるモデルを使用することにつながりakesデータ比較及びメタ分析不可能ではないにしても、難しい。単純堅牢で安価な実験モデルは、異なる機関から同等の結果を得るために、さまざまな研究室で標準化された方法で使用することができる標準化されたツールとして必要とされる。この目的のために、私たちはラット大動脈側壁嚢状動脈瘤モデルを作成しました。

このレポートの目的は、ステップ·バイ·ステップの手続きの手順、必要な機器についての情報を提示するために、ラットの腹部大動脈側壁瘤の成功顕微作成のための重要な解剖学的および外科的特性を議論することである。

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Protocol

注:Wistar系雄性ラット(平均体重:356±44グラム; 10〜14週齢)に22〜24°Cと12時間の明/ペレット食餌に自由に利用、水道水で明暗サイクルでの動物飼育室で飼育したまた、施設のガイドラインに準拠した人道的なケアを受けた。実験は見直され、フィンランドのヘルシンキ大学の動物福祉委員会によって承認された。

NOTE:メデトミジン塩酸塩(0.5mgの/ kg)および塩酸ケタミンの腹腔内注射(50mg / kg)の重量適応皮下注射によりラットを麻酔次のデモンストレーションでは私たちの外科的方法は以下の通りである。つま先ピンチ反射の欠如のための試験は、ラットが完全に麻酔をかけていることを確認します。どちらかアルコールや水に、例えばクロルヘキシジンのために、眼軟膏を適用し、手術部位をクリップして、適切な消毒剤で皮膚を洗浄してください。防護服、ヘッドカバーと顔を、手を洗うマスク、無菌手術用手袋。無菌手術の条件を維持するために外科助手助剤を有し、外科的特性( 表1に記載されたように)文書化する。有害刺激(足指のピンチテスト)に呼吸数、心拍数、および反応に従うことによって手術中の麻酔15分毎の深さを監視する。ブプレノルフィンの皮下注射(0.03ミリグラム/ kg)は、術後鎮痛のために与えられ、必要に応じて12時間ごとに繰り返した。

(1)ハードウェア、消耗品、およびポジショニング

  1. 小動物手術室静かな、無菌を維持し、23±3℃の室温を維持する。以下の最小限の機器が必要となる実験的な動脈瘤の手術を実行するには:
    1. 理想的にアシスタントスコープとデジタル顕微鏡カメラを搭載したテーブルトップ手術用顕微鏡を使用してください。実験台を保護するために、非多孔質の再利用可能な操作面や洗浄可能機器の表面を使用してください。
    2. 外科はさみ、組織鉗子、軟部組織スプレッダまたは自己保持リトラクター、および2つのモスキート外科クランプ:以下の標準手術器具を使用してください。
    3. 湾曲マイクロニードルホルダー、湾曲した1と2の直線マイクロピンセット、および直線または曲線microscissor:含ん基本顕​​微楽器セットを使用してください。
    4. 手術中に測定器非粘着性、清潔を保つために滅菌生理食塩水で満たされた腎臓の皿に顕微楽器を保管してください。腎臓皿をゴム製マットまたはマイクロ器具の先端の損傷を防止するための外科手袋で埋められます。すべての電源が無菌であり、手順は実験動物での生存の手術のための現在の推奨に従って、無菌技術を用いて行われていることを確認します
    5. また、血管クリップアプリケータと3非外傷性の一時的な血管クランプを使用しています。これは、使用されるクランプは、ラット大動脈の非常に薄い壁への損傷を防ぐために、低閉鎖力を有することが重要である。また、半分ミリメートルスケールバーとルーラー、小さな色ゴムパッド、ショート鈍針を準備します。
    6. 、仰臥位でラットを置き、皮膚にストレッチや圧縮を適用せずに、両方のフロントを固定化し、サージカルテープで足後肢、そして背中の腰部の下に置くことによって厚いマーカーまたは焼灼ペンで自分の背中を曲げる。これは、顕微吻合を容易に大動脈、大動脈への曝露後腹膜およびアクセスを改善するために、できるだけ多くの腰椎前彎を得ることが重要である。この位置決めは、腹部大動脈瘤の作成をお勧めしますが、胸部移植片採取のために必要されていません。

2グラフト収穫

  1. Uファインダー全身麻酔、胸腔を開いて(グラフト虚血の開始時間)。ラットは、次の手順に進む前に応答しないことを確認するために有害なつま先のピンチを適用します。 midventral腹壁を通して切断し、ちょうど肝臓の上方にダイアフラムを識別し、胸郭へのアクセスを可能にするために、ダイアフラムの下部にある結合組織を切断する。ダウン大はさみ、鈍い側では、ただ1センチメートル左肋骨と胸郭の正中線の右側を通って切断し、胸腔を開く。肺が心臓の右側に動員される。ケタミンhydrochloride.Pulmonaryトランク、左鎖骨下静脈の心臓内注射で過剰投与によってラットを生け贄に捧げる、頭蓋大静脈を離れ、奇静脈、近位胸部大動脈の収穫を妨害する。
  2. 尾は著名な静脈にマイクロはさみやマイクロピンセットを用いて、胸部下行大動脈の解剖を開始するには良いエントリポイントがあります。
  3. 胸部大動脈bをトレース上向きにモスキート外科クランプで穏やか鈍後退し、切開によって大動脈弓に胸部の背側の壁からのACK。
  4. クランプした後、ハ​​サミで静脈を切った。静脈上のクランプを維持し、基礎となる大動脈弓を露出させるために開創として使用する。
  5. ちょうど大動脈を残す最初の肋間動脈の上に、非吸収性6-0絹結紮糸を配置します。
  6. ちょうど左鎖骨下動脈の下に下行大動脈を切断した後、合字、下記。トリミングは、垂直な標準化された動脈瘤の幾何学的形状を得るために行うことができ、または必要に応じて、動脈瘤と大動脈の軸との間の特定の角度を取得する。幅と長さの移植片を測定します。
    注:収穫移植片は直ちにレシピエントラットに移植またはさらなるグラフト壁の脱細胞化を達成するために処理することができる。脱細胞化された移植片は、後日再注入( 図1)まで-4摂氏温度で保存することができる。のTh動脈瘤壁の電子の脱細胞化は、11を拡大するために動脈瘤をかかりやすくすることが示されている。

3グラフト脱細胞化

  1. フリーズドナー移植片はリン酸-4℃で緩衝生理食塩水。
  2. 次の日には、移植片を解凍し、室温にて精製し、脱イオン水ですすぎ、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム中で37℃で10時間インキュベートする。
  3. 最後に、リン酸緩衝生理食塩水で再凍結、穏やかに撹拌しながらドデシル硫酸ナトリウム処理移植片を3回洗浄し、で維持-4℃〜使用するまで。

4。動脈瘤の作成

  1. 腹部大動脈の解剖
    1. 動物を麻酔した後、手術部位から毛皮をクリップし、適切な消毒剤で皮膚を洗浄してください。前皮膚切開につま先ピンチ応答の欠如のためのテスト。私は性器に切開さ1cm近位を開始しますnはmidventral位置(操作開始時刻)。慎重に下にある筋肉から皮膚を分離する。胸骨下の2センチに終了解剖一つ。
    2. 慎重にしっかりと根底にある臓器の障害を避けるために、基本的な腹部の筋肉を引き上げます。剣状突起に上向きに白線に沿った長手方向の切り込みを拡張し、膀胱のレベルで尾方向に終わる。
    3. 静かに後腹膜腔へのアクセスを容易にするために、それを空に膀胱に圧力を加える。
    4. 右または左に小腸、著名な盲腸を移動します。腹腔の左側下部にある、すなわち下行結腸大腸を識別します。
    5. 背側体壁の広い露出を可能にするために小腸および頭蓋方向に下行結腸の間に靱帯を切った。離れて腸を保持するために、自己保持リトラクターを配置します。
    6. 端側動脈瘤吻合iの理想的なロケーション腎臓および腸腰静脈間のレベルにあるのです。腹部大動脈は、脂肪組織内に埋め込まれた後腹膜に位置しています。解剖時には対になっほぼ透明尿管および精巣血管に特に注意を払う。
    7. 腸のさらなる後退が必要な場合は、より大きなガーゼスワップを使用しています。ラットの腰の下に焼灼ペンまたは類似のオブジェクトを配置することにより、測位の間に誘導腰椎前彎は、大幅に腸後退の必要性を低減する。
    8. 背側の体壁の腹側表面は、薄い壁側腹膜で覆われている。これを開くと、ちょうど下大動脈を可視化。隣接する大静脈から腹部大動脈を慎重にシャープで鈍的切開の間、血管壁への損傷を避ける唯一の外膜を持ってください。
    9. まれに、小さな腰動脈、腹部大動脈の背側表面からセグメント容器として生じると準備を妨害する。容器の連結および切断が旧姓です動脈瘤の縫合中に逆行性滲出を回避するためにDED。湾曲したマイクロ鉗子の使用は、深さの結紮糸の配置を容易にすることができる。
  2. 端側吻合
    1. 腹部大動脈の下に着色されたゴム製のパッドを入れて、小さなガーゼ綿棒でそれをアップホルスター。計画された吻合部位のレベルでゆるい結合組織および外膜を除去します。
    2. 最初に、その後、近位側吻合に腹部大動脈遠位クランプ(大動脈のクランプ開始時刻)。これは、容器をしっかり充填を確保し、その後の動脈切開を容易にします。
    3. 直線または曲線のマイクロハサミのいずれかを使用して動脈切開を行います。マイクロ鉗子は、楕​​円形状を切り出す血管壁の非常に小さな部分をかざす。
    4. 鈍な先端の針を用いて、両方向に生理食塩水で十分に動脈をフラッシュします。
    5. (動脈切開の近位端および遠位端でこの端側吻合の最初の2本の縫合糸を配置吻合開始時刻)。可能な限り、マイクロ鉗子で血管壁の把握は避けてください。各縫合糸は血管壁の全ての層を通って配置されていることを確認してください。
    6. どちら連続または中断縫合糸などの縫合を行います。中断縫合を選択した場合、最初の裏側9 o`clock縫合糸を配置します。その後の縫合糸は、非常に第1の縫合糸に隣接する出発離間させることができる。慎重に外膜をつかみ。内膜のいずれ絞り/把持を避けてください。
    7. 後壁が終了すると、見当違いの縫合用吻合の管腔内の部分を確認してください。表側の同じ順序で同じ手順を実行します。縫合糸当たり3ノットの合計のうち、最初の事務所が、あまりにもタイトではないことを確認してください。
  3. 止血および閉鎖
    1. 端部から側部に到る吻合を(エンド吻合時間)を完了した後、終了大動脈時間と終了グラフト虚血tiのクランプ(生理食塩水サイトをすすぎ、逆流を可能にするために、第1の遠位のクランプを取り外し私)。
    2. 明らかな出血が余分なステッチが必要になる場合が逆流から発生した場合は(止血の開始時刻)。マイナーにじみ出るの場合​​には、ガーゼ綿棒の小片を使用して出血部位の上に穏やかな圧力で止血を達成。
    3. 近位血管クランプを外し、もう一度吻合部位を洗浄し、動脈瘤ドームでの合字の残りの端を切り落とした。
    4. ピーク動脈の脈波の間の動脈瘤の体積増加を観察することにより、動脈瘤の開通性を確認してください。直接「搾乳テスト」を通じて遠位腹部動脈開通性を評価する。
    5. プラスチックシートと下に小さなガーゼ綿棒を削除します。作成した動脈瘤内の脈動血旋回がはっきりと見える。
    6. 小さな染み出しがまだ存在する場合(止血の終了時刻)は、追加の止血のための脂肪組織またはSpongostanの小片を用いてその吻合部分の周りに縫合線を覆う。
    7. 軟部組織スプレッダとガーゼ綿棒を削除します。背中を正しい位置にある小腸、盲腸、および脂肪量を配置します。
    8. 5-0、4-0、または3-0 3-0再吸収polyfilament縫合(終了動作時間)で連続縫合技術を用いて、皮膚創傷の閉鎖に続く吸収性または非吸収性縫合糸を用いて、正中線腹部の筋肉を閉じます。注:私たちの経験のラットでは非吸収性モノフィラメント縫合糸よりも優れた吸収性の皮膚縫合糸を容認。

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Representative Results

パイロットシリーズは、14匹のラットを含んだ。その後84匹の動物の合計は、2012年追加の29の動物は、動脈嚢状移植片のためのドナーとして務め3月と9月の間に、いくつかの研究プロジェクトのために提示されたプロトコルに従って操作した。残りの実験を採取し、同じ性別、歪み、体重、および年齢のラットを用いた以前の実験から、記憶された前処理された移植片を用いて行った。

体重、全体的な動作時間、大動脈のクランプ時間、吻合作成のための時間は、時間が吻合作成、グラフト虚血時間の後に止血し、作成の時間(動脈瘤の幅および長さ)での動脈瘤の大きさを記録し、書き込まれた症例報告書から抽出した。すべての特性を表1及び図1に要約し、可視化される。

原因アブドの血栓症を第二操作を受けた一匹を除いて吻合部位にminal大動脈遠位には周術期死亡率や罹患率がなかった。動作時間未満の52分(52±12分)であったことを意味する。同系瘤(N = 21)の移植と動物では、移植片の虚血時間を意味する29±7分であった。全体的に平均大動脈クランプ時間は25±7分であった。動脈瘤の大きさは(2.5±0.2 mmの幅を意味し、長さは3.8±0.2ミリメートルを意味する)の大きさの低偏差一定であることが明らかになった。

収集されたデータは統計ソフトウェアを使用して記述分析と可視化を行った。値は平均±標準偏差(SD)および95%信頼区間(CI)として表される。

図1
図1:非脱細胞化または脱細胞移植片は胸部大動脈からの未処理の天然のドナーの移植片はすぐにレシピエントラットに再移植される(1)。ようにする移植片脱細胞化(2)再注入まで、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で処理し、-4摂氏格納されている。組織学的パネルは、未処理(左)および脱細胞(右)のグラフト壁を通しての縦断面を示している。ヘマトキシリン​​ - エオシン染色。

図2
図2:手術の特徴 。グラフは、単一のデータ値の分布(小さ ​​な黒いドット)、データ平均値(太字長い棒)、標準偏差(エラーバー)を可視化する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

特徴 意味する ±SD 上側95%信頼区間-下
平均体重(グラム) 363 47 350から373
動作時間の平均(分) 50 11 48から53
大動脈クランプ時間の平均(分) 25 7 23から27
吻合時間の平均(分) 18 6 16から19
止血の平均時間(分) 2 2 2から3
移植片の虚血時間は平均(分) 29 7 26から32
平均動脈瘤幅(ミリメートル) 2.5 0.2 2.4から2.5
平均動脈瘤の長さ(ミリメートル) 3.7 0.5 3.5から3.8

表1:手術の特徴 。 SD =標準偏差; CI =信頼区間

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Discussion

嚢状脳動脈瘤の複雑な生物学の理解の進歩は、動物モデル3,12,13で患者のサンプルおよび実験研究に実験室での研究によって補完疫学的および臨床データの分析に依存している。

ラットなどの小動物は、本質的に実験とハウジングの低コストに関連しており、特殊な装置の必要性が低減される。ラットでの側壁動脈瘤の顕微作成のための60分未満の平均運転時間の合計は、ウサギ及びイヌ2,14,15におけるより複雑な顕微静脈ポーチ動脈分岐部動脈瘤の作成 ​​に使用される時間よりもはるかに短い。低コストおよび動脈瘤の作成速い方法の利点は、実験より多くの及びその後の増加統計的検出力を用いた研究の伝導を容易にすることができる。また、現在のマウスモデルは、正常researcに答えるために実装されているトランスジェニック動物3,4を含む、より洗練された実験室での方法論を、必要とする時間の質問。側壁動脈瘤の作成のためのマウスを使用する場合は、必要なことを心に留めておくべき1必要性は11-0縫合糸は、追加の顕微スキルを必要中断。マウスでの提示動脈瘤モデルの性能はまた、より高い死亡率と関連している(30%;主因体液バランス麻酔し、マウス大動脈の小径(0.5〜mm)の合併症に)3。

ラット動脈瘤モデルの基本原理は、短時間で習得することができる。齧歯類顕微における入門コースは、手術用顕微鏡下で解剖し、縫合のテクニックを実行する際に経験のないものの研究者にお勧めです。提示されたプロトコルで強調表示の重要なステップは、さらに手続きを簡素化します。特に注意が隣接する大静脈から腹部大動脈の解剖中に行使されるべきである。

ntentは">中規模のラットの小さな末梢血管径が5,6困難トランス-頸動脈及びトランス腸骨血管内デバイスの展開を行いますが、デバイスも終了前に実験的な動脈瘤への直接腹部大動脈挿入または直接配置を介して配置することができます-toサイトをネック残党における7,16。体積変化を吻合し、動脈瘤の形状は、シリアルおよび非侵襲性の高周波数の超音波、マイクロCT、または高解像度磁気共鳴血管造影16とフォローアップすることができます。以前の実験では、全体的に高いが明らかになった実験的動脈瘤の一つのケース著しい成長や拡張を除いて閉経期またはイントラ手続き抗凝固および凝集防止3,7,16なしで作成後6週間の追跡期間中央値。で92.5%の開通率は観察されなかった及びそれらのどれも3破裂しない。

しかし、収穫移植片が脱細胞化された場合、動脈瘤のdem血栓症、再疎通、成長、および最終的な破裂11の不均一なパターンをonstrate。後者の研究で成長動脈瘤は顕著な外膜の線維症および炎症、完全な壁の破壊、および未組織管腔内血栓における増加した好中球の蓄積を実証した。このようにして、モデルが動脈瘤の成長および破裂を研究することを可能にし、潜在的成長に塞栓装置により誘導される生物学的応答および破裂しやすい動脈瘤を評価するために使用することができる。理想的に塞栓することができる利用可能な動脈瘤モデルはいずれも、人間の嚢状脳動脈瘤を表現したり、動脈瘤形成や破裂の背後にある正確な病理を再現します。

それは、どの程度のグラフト(静脈または動脈ポーチ)と脈管構造学(側壁または分岐構築物)の選択の選択は、臨床実践に結果の翻訳に影響を与えるために議論の余地が残る。確かに異なるモデルが異なるために最適である目的は、ある機関で非常に高いレベルに最適化することができる。提示されたモデルは他のモデルを時代遅れにすることはありません。研究者は異なる技術的なモデルと動物実験の最高の目標に合ったもの、実用性を考慮し、実験室環境の広い範囲から選択することが必要なままになります。

しかし、いくつかの実験では、理想的には、データのデバイスまたは治療のより良い比較を可能にするために、さまざまな機関や研究室の同じ標準化されたモデルで行われるべきである。これまでに存在し、血管内のデバイスの標準化されたテストのためのガイドラインは、臨床応用の前にされず、動物モデルは1を十分に活用されたまま。標準化されたモデルは、かつて多施設無作為化前臨床試験も、この研究分野に出現の重要性を得ることができます。

顕微動脈瘤の作成は、移植片の起源、体積対オリフィス比、および親血管の標準化を可能にする長軸の角度を動脈瘤である。提示技術は、最小限の動脈瘤の寸法変動、位置、及び親動脈に関連して標準化された動脈瘤を生成することを目的とする。標準化と、比較的低コストのこの高度なモデル、他のより複雑で高価なモデルで試験された塞栓材料やデバイスをテストするための良いツールとなっています。

結論として提示顕微側壁ラット動脈瘤モデルは、サイズ、形状、および親動脈に関連する動脈瘤の幾何学的構成を用いて標準化されている実験的動脈瘤を作成するために、高速で手頃な価格の、かつ一貫した方法である。

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Disclosures

著者は、使用される薬剤、材料、または装置のいずれにおいても、金融や商業の利害関係はない。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medetomidine Any genericon
Ketamin Any genericon
Buprenorphine Any genericon
Phosphate buffered saline
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)
3-0 resorbable suture Ethicon Inc., USA VCP824G
5-0 non absorbable suture Ethicon Inc., USA 8618G
6-0 non absorbable silk suture B. Braun, Germany C0761060
9-0 nylon micro suture B. Braun, Germany G1118471
Spongostan Ethicon Inc., USA MS0002
Operation microscope Leica , Germany M651
Digital microscope camera Sony, Japan SSC-DC58AP
Standard surgical instruments B. Braun, Germany Multiple See protocol 1.4
Microsurgical instruments B. Braun, Germany Multiple See protocol 1.5
Vascular clip applicator B. Braun, Germany FT495T
Temporary vascular clamps B. Braun, Germany FT250T
Graph Pad Prism statistical software  GraphPad Software, San Diego, California, USA V 6.02 for Windows

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References

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