La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG
1Department of Neurology, University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF), Münster, 3Institute of Physiology – Neuropathophysiology, University of Münster

Immunology and Infection
 

Summary

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal establecido de la esclerosis múltiple. C57BL / 6 ratones se inmunizan con mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG) péptido 35-55 (MOG 35-55), dando como resultado una parálisis flácida ascendente causada por las células inmunes autorreactivas en el sistema nervioso central. Se discutirán Protocolos para la inducción de la enfermedad y el seguimiento.

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Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

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Abstract

La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante neuroinflamatoria crónica del sistema nervioso central con un fuerte componente neurodegenerativo. Mientras que la etiología exacta de la enfermedad todavía no está claro, se cree que los linfocitos T autorreactivos a jugar un papel central en su fisiopatología. Tratamiento de la EM es sólo parcialmente eficaz hasta el momento y los esfuerzos de investigación continúe ampliando nuestro conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo animal más común para MS compartir muchas características clínicas y patofisiológicas. Hay una amplia diversidad de modelos de EAE que reflejan diferentes aspectos clínicos, inmunológicos e histológicos de la EM humanos. EAE activamente inducida en ratones es el modelo inducible más fácil con resultados robustos y reproducibles. Es especialmente adecuado para la investigación de los efectos de las drogas o de determinados genes mediante el uso de ratones transgénicos impugnadas por Neurol autoinmunenflammation. Por lo tanto, los ratones son inmunizados con homogeneizado de SNC o péptidos de proteínas de la mielina. Debido a la baja potencial inmunogénico de estos péptidos, se utilizan adyuvantes fuertes. EAE susceptibilidad y fenotipo depende del antígeno elegido y la tensión de los roedores. C57BL / 6 ratones son la cepa utilizada para la construcción de ratón transgénico y responden entre otras a la mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG). El MOG epítopo inmunogénico 35-55 se suspende en adyuvante completo de Freund (CFA) antes de la inmunización y la toxina pertussis se aplica en el día de la inmunización y dos días más tarde. Los ratones desarrollan un "clásico" EAE monofásico autolimitada con parálisis fláccida ascendente dentro de 9-14 días después de la inmunización. Los ratones son evaluados diariamente utilizando un sistema de puntuación clínica de 25 a 50 días. Se discuten las consideraciones especiales para el cuidado de los animales con EAE, así como las posibles aplicaciones y limitaciones de este modelo.

Introduction

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria desmielinizante crónica del sistema nervioso central en el que la destrucción de oligodendrocitos y neuronas resultados en los síntomas clínicos heterogéneos y acumulación. MS es considerado como un trastorno autoinmune prototípica del sistema nervioso central (SNC) y se han desarrollado modelos animales para arrojar luz sobre su compleja patogenia. Por otra parte, las terapias actuales sólo son parcialmente eficaces y orientados principalmente a la fase inflamatoria de la enfermedad, mientras que el componente neurodegenerativo es, probablemente, el mayor reto para el futuro terapéutico se acerca 1,2.

Mientras que la etiología exacta de la enfermedad todavía no está claro, se supone que una reacción autoinmune contra epítopos en la vaina de mielina de los axones en el SNC para provocar la aparición de la enfermedad. La desregulación del sistema inmune, la vulnerabilidad genética y los factores ambientales (por ejemplo, las infecciones, la vitamina D) se cree queaspectos centrales de influencia de los mecanismos fisiopatológicos de la MS.

Tres tipos diferentes de modelos animales se han establecido actualmente para la exploración de los patrones patológicos de MS: modelos virales como el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV), los modelos inducidos por agentes tóxicos como cuprizone y, finalmente, las diferentes variantes de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) 3, 4. Aunque todos ellos imitan las características de la EM, difieren enormemente en las características patológicas subyacentes como la participación del sistema inmune adaptativo. EAE es el modelo animal más común, ya que es especialmente útil para investigar las vías neuroinflamatorios ya menudo sirve como un modelo de "prueba de principio" para la eficacia de nuevas estrategias de tratamiento 5,6. La EAE puede ser inducida en muchos animales diferentes (por ejemplo, ratones, ratas, miniswine, cobayas, pollos, o primates). Sin embargo, los ratones se han convertido en los más ampliamente utilizar especies que es al menos en parte,a ampliar el repertorio de transgénicos sofisticados o ratones knockout 7.

La fisiopatología de la EAE se basa en la reacción del sistema inmune contra antígenos específicos del cerebro. Esta reacción induce la inflamación y la destrucción de las estructuras en libros de antígeno, lo que resulta en características neurológicas y patológicos comparables que los observados en pacientes con EM. Tres enfoques diferentes se pueden distinguir: EAE activamente inducida (EAEa; inmunización activa), de forma pasiva transferidos EAE (peae; transferencia de células encefalitogénicas de un animal inmunizado), y los modelos más recientemente espontáneas EAE ratón (SEAE), que permiten el estudio de enfermedades autoinmunes mecanismos sin manipulación exógena. El modelo más sencillo es inducible EAEa en ratones que producen en resultados rápidos y robustos. Este modelo es considerado como el "estándar de oro" de los modelos animales neuroinmunológicas por muchos investigadores en el campo 8.

Para EAEa de inducción, el animalse inmuniza con una inyección subcutánea de una emulsión que consiste en el antígeno elegido y completar adyuvante de Freund (CFA) acompañado de una inyección intraperitoneal de la toxina pertussis en el día de la inmunización y dos días más tarde. En consecuencia, los linfocitos T específicas para la mielina se activan en la periferia y migran en el SNC a través de la barrera hematoencefálica. A la entrada en el SNC, las células T se vuelven a activar por las células locales e infiltrantes presentadoras de antígeno resultantes en la posterior cascadas inflamatorias, la participación de otras células tales como monocitos o macrófagos y, finalmente, en la desmielinización y la muerte celular axonal 9. Dependiendo del protocolo de inmunización y combinación de cepa de ratón (por ejemplo, ratones C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) y el antígeno (por ejemplo, glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG), proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica de mielina (PLP)), la enfermedad Por supuesto se puede tomar un curso progresivo o recurrente aguda, crónica enfermedad en remisión.

35-55 péptido 10 que resulta en una EAE monofásico con primeros síntomas después de 9-14 días, máximo enfermedad alrededor de 3-5 días después de la aparición de la enfermedad y la recuperación de los síntomas lenta y parcial en los próximos 10-20 días. A medida que el potencial inmunogénico de MOG 35-55 péptido por sí sola no es suficiente para inducir la enfermedad, adyuvantes tales como CFA son necesarios. Se supone, que los componentes de CFA activan los fagocitos mononucleares que inducen la fagocitosis de estas moléculas y la secreción de citoquinas. Esto da como resultado la prolongación de la presencia de antígenos y un transporte más eficiente de estos para el sistema linfático. La inducción de EAE es facilitado por la aplicación de la toxina de pertussis (PT), que ha sido sugerido entre otros para modularla barrera sangre-cerebro y el propio 11 de respuesta inmunológica. Después de la inducción de la enfermedad, la atención especial se debe tomar para la evaluación diaria de los ratones para los síntomas de la enfermedad.

Protocol

1. Observaciones generales para experimentos con ratones

  1. Todos los experimentos con ratones se deben realizar de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso respectivo.
  2. Mantener los ratones en condiciones libres de patógenos y les permitirá tener acceso a alimentos y agua ad libitum. Nota: Es importante la utilización de ratones sexo, con ajuste por edad y en los grupos experimentales ya la susceptibilidad a la enfermedad puede variar con la edad y el género.
  3. Dependiendo de las condiciones experimentales elegidas, un grupo de control inmunizados de manera simulada puede ser considerado donde MOG 35-55 péptido se sustituye por PBS sin antígeno o un péptido nonencephalitogenic.
  4. Por favor considerar aspectos metodológicos antes de los experimentos iniciales (véase también más adelante). Se recomienda involucrar a uno o dos observadores cegados para la puntuación de EAE.

2. Preparación de MOG 35-55 Emulsión

  1. 200 l de una relación 1:1 de MOG de solución de péptido 35-55 y CFA deben inyectarse a cada ratón. Hay una cierta pérdida de la emulsión viscosa, mientras que la preparación y la inyección. Por lo tanto, preparar 1,5-2x de la cantidad necesaria. Calcular el volumen total de la emulsión y se divide por 2 para las cantidades necesarias de tanto solución de péptido MOG 35-55 y CFA.
  2. Diluir MOG liofilizado 35-55 en ddH2O a una concentración final de 2 mg / ml. Utilizamos generalmente 200 mg MOG 35-55 péptido por ratón. Esta cantidad está contenida en 100 l de la solución madre. La solución de péptido debe almacenarse a -20 ° C.
  3. Coloque el contenido de 1 vial de desecado de Mycobacterium tuberculosis H37RA (100 mg) en un mortero.
    1. Planta con mortero hasta obtener un polvo fino.
    2. Añadir 10 ml de adyuvantes de Freund incompleto para obtener una solución madre de 10 mg / ml de CFA que se puede almacenar a 4 ° C.
    3. Antes de la inmunización, diluir CFA solución madre del ingenioh IFA a una concentración final de 2 mg / ml. Mezclar bien antes de cada uso para resuspender material particulado y considerar una cierta pérdida de volumen de la solución viscosa durante las preparaciones experimentales.
    4. Mezclar 1:1 con solución de péptido MOG 35-55 hasta / ml se alcanza la concentración final de 1 mg.
      PRECAUCIÓN: Heat-muertos Mycobacterium tuberculosis estimula la respuesta inmune innata. Evitar la inhalación, ingestión y contacto con la piel y los ojos.
  4. PreCool soluciones en hielo.
    1. Elaborar 1 ml de 2 mg / ml de CFA y 1 ml de 2 mg / ml de MOG 35-55 solución en dos jeringas de 2 ml. Calcular el número de jeringas necesarias de acuerdo con el número de animales inmunizados.
      ATENCIÓN: Evitar estrictamente la costura durante la preparación del adyuvante, ya que puede provocar granulomas o inducir reacciones autoinmunes.
    2. Utilice un G cánula 27 para el 35-55 solución MOG y un G cánula 20 de CFA. Evite las burbujas de aire y conectar ambas jeringas con alhree-way-válvula.
    3. Enviar la emulsión de una jeringa a la otra y mezclar bien durante al menos 10 min como una buena emulsificación es un paso crítico. Cerca-cerrar la válvula de tres vías para apoyar la emulsificación. La solución debe ser blanca, rígida y viscosa sin separación de fases.
    4. Emulsión se puede almacenar durante varios días antes de la inmunización. Espere al menos 30 minutos después de la preparación de las emulsiones para observar si son estables. Antes de la inmunización, dibujar la solución en una de las dos jeringas y conectar un G cánula 27.

3. Preparación de toxina pertussis

  1. Diferentes cantidades de toxina de pertussis se pueden encontrar en la literatura que también depende de la vía de administración (por ejemplo, por vía intravenosa o por vía intraperitoneal). Nuestro laboratorio utiliza 400 ng de toxina pertussis en 200 l de PBS por vía intraperitoneal en el día de la inmunización, y dos días más tarde. PRECAUCIÓN: La toxina pertussis tiene muchos efectos biológicos. Evitar la inhalación, ingestión y contacto con la piel y los ojos.
  2. Reconstituir 50 g de toxina pertussis en 500 l de ddH2O para una solución madre de 100 mg / ml. Almacenar a 4 ° C.
  3. Diluir 1:50 con PBS. 200 l ahora contienen 400 ng de PBS. Preparar la cantidad necesaria de jeringas y considerar un exceso de volumen adicional de ~ 100 l para cada cubo de la aguja.

4. Animal Inmunización

  1. Por favor, consulte el comité cuidado de los animales y el uso institucional de criterios específicos para la eutanasia requiere a corto plazo. Nuestro laboratorio utiliza breve narcosis con isoflurano, mientras que otros protocolos, como la inyección de ketamina / xilazina o halothan también pueden ser posibles. Espere a que la anestesia y usar una pizca dedo del pie frontal para evaluar el nivel de anestesia.
  2. Asegúrese de que la inmunización se lleva a cabo por una persona con experiencia para minimizar el estrés de los animales y para asegurar la inmunización óptima.
  3. Inyectar 100 l de luchagen / CFA emulsión subcutáneamente en dos sitios diferentes en cada flanco trasero. Asegúrese de que se forma una masa de bulbo debajo de la piel que debe persistir durante todo el experimento.
  4. Inyectar 200 l de toxina de pertussis intraperitonelly.
  5. Asegúrese de que los ratones individuales pueden ser fácilmente identificados por la evaluación diaria, por ejemplo, mediante marcas de color en la base de la cola.
  6. Administrar una segunda dosis de la toxina pertussis en el segundo día después de la inmunización.

5. Monitoreo de la EAE

  1. El peso y la puntuación clínica deben ser evaluados diariamente. El inicio de la EAE generalmente se correlaciona con la pérdida de peso, que se puede utilizar como un indicador de actividad de la enfermedad. Por favor, consulte el cuidado de los animales institucional y el empleo de predefinir criterios cuando los ratones individuales tienen que ser sacado de los experimentos. Esto debe ser considerado cuando la pérdida de peso superior al 20% del peso corporal inicial o cuando los signos clínicos graves (puntuación de EAE 7 o peor) se producen. Por favor refiérase a la relineamientos prospectivos del cuidado de los animales institucional y el empleo Comisión respectiva para las puntuaciones máximas permitidas.
  2. Cuando los ratones tienen síntomas clínicos de la EAE, es importante asegurarse de que la botella de agua todavía se puede alcanzar y que la comida se coloca en el suelo de la jaula.
  3. Diferentes síntomas de puntuación se pueden utilizar. En nuestro laboratorio se establece una escala de 0 a 10.
Grado Signo clínico Comentario
0 Ausencia de signos clínicos Marcha normal, la cola se mueve y puede ser levantada, la cola se envuelve alrededor de un objeto redondo si el ratón se mantiene en la base de la cola
1 Cola parcialmente cojera Marcha normal, punta de la cola cae
2 Cola Paralizado Marcha normal, la cola cae
3 Paresia de las extremidades posteriores, la falta de coordinación Andar descoordinado, cola cojea, extremidades posteriores responden a pellizcos
4 Una extremidad posterior paralizado Andar descoordinado con una extremidad trasera de arrastre, cola cojea, una de las extremidades posteriores no responde a pellizcar
5 Ambas patas traseras paralizadas Andar descoordinado con ambas extremidades traseras arrastrando, cola cojea, ambos miembros posteriores no responden a pellizcar
6 Las patas traseras paralizadas, debilidad en las extremidades anteriores Andar descoordinado con extremidades anteriores luchan para sacar el cuerpo, las extremidades anteriores reflejo después de pellizcar, cola cojea
7 Las patas traseras paralizadas, una extremidad anterior paralizó El ratón no se puede mover, un miembro anterior responde a pizca dedo del pie, cola cojea
8 Las patas traseras paralizadas, ambos miembros anteriores paralizados El ratón no se puede mover, ambos miembros anteriores no responden a la pizca dedo del pie, cola cojea
9 Moribundo No hay movimiento, la respiración alterada
10 Muerte

Tabla 1. Sistema de puntuación clínica.

Representative Results

Después de la inmunización, los ratones tienen que ser evaluados diariamente para cambios en el peso y los síntomas clínicos. Inicio de la enfermedad se correlaciona típicamente con una reducción de peso que podría comenzar 1-2 días antes de los síntomas de EAE son visibles. Los signos clínicos de la EAE suelen comenzar entre los días 9 y 14 después de la inmunización. Como las lesiones se localizan predominantemente en la médula espinal en MOG-EAE en ratones C57BL / 6, por lo general se desarrollan síntomas predominantemente motoras en un caudal a rostral patrón. Una imagen de ejemplo de un ratón inmunizado con síntomas de la EAE (calificación 6) se representa en la figura 1A. Algunos de los síntomas de EAE atípicos también pueden producirse como rodar en forma axial rotativo, aspecto encorvado o hipersensibilidad, no reflejadas en el EAE Clásico Partitura representan en la Tabla 1. Como los síntomas motores son la característica principal de este modelo, este resultado nos da una buena indicación de la gravedad de la enfermedad. Diferentes sistemas de monitoreo (por ejemplo, marcó el 0 -5 o 0-6) y más puntajes compuestos complejos que evalúan diferentes déficits también se han publicado. Tenga en cuenta que los ratones con síntomas severos tienen que ser sacado de la experiencia de acuerdo con el comité de cuidado de los animales institucional y uso respectivo. Los ratones muestran recuperación general parcial de los síntomas en los próximos 10 a 20 días. Un curso de la enfermedad representante se representa en la Figura 1B. Hay diferentes puntos de tiempo durante EAE que son de interés para la evaluación de parámetros de resultado. Algunos ensayos típicos que a menudo se pueden encontrar se describen muy brevemente. En el máximo de la enfermedad, los ratones pueden ser evaluados para la producción de citoquinas o la proliferación después de la reestimulación de las células inmunes aisladas con MOG 35-55 péptido in vitro (ensayo de recordatorio MOG). Las células inmunes también se pueden aislar desde el cerebro y la médula espinal de los ratones con síntomas de la EAE y se procesan adicionalmente, por ejemplo mediante citometría de flujo. El análisis histológico de secciones de médula espinal se puede realizar en la enfermedad mAximum para la carga de la lesión y la desmielinización, mientras que al tiempo después puntos marcadores de neurodegeneración y la muerte de las células neuronales puede ser de interés.

Figura 1
Figura 1. Resultados de Representante de EAE. A. imagen representativa de una inmunizados ratón C57BL / 6 con síntomas de la EAE (EAE anotar 6). Curso de la enfermedad B. Representante después de la inmunización de más de 30 días. Los datos se muestran como media y error estándar de la media (n = 5). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Discussion

Una multitud de diferentes modelos de EAE con protocolos de inmunización activa se ha descrito en las últimas décadas. Mientras que los modelos de rata han sido ampliamente utilizados hasta hace poco, los ratones son ahora el organismo modelo más popular para la investigación de EAE. Este desarrollo es, entre otros, debido a la amplia y creciente repertorio de ratones transgénicos disponibles. La inmunización de ratones C57BL / 6 con MOG 35-55 péptido es uno de los modelos más ampliamente distribuida de EAE y puede ser considerado como un modelo fiable, reproducible y animal-así de usar. En muchos laboratorios neuroinmunológicas, MOG 35-55 EAE inducida se ha establecido como el modelo de elección mientras se utilizan otros modelos de EAE para las preguntas experimentales más específicos.

Un punto crítico a considerar es la planificación de los parámetros experimentales para asegurar que los experimentos de EAE se realizan metodológicamente correcta. Por la validez interna, se recomienda anotar cegada de síntomas de la enfermedad. Expergrupos imental debe ser la edad, el peso y el sexo con ajuste y los ratones deben ser asignados al azar a grupos de tratamiento. Los experimentos siempre se debe realizar en cumplimiento de las normas de bienestar animal. Estudios de EAE son a menudo de poca potencia y no toman en cuenta los errores estadísticos de tipo II. Por lo tanto, antes de los experimentos, se deben realizar los cálculos del tamaño de la muestra. Tamaño de los grupos necesarios dependen de la magnitud del efecto esperado. Consulta a un experto para el análisis estadístico podría considerarse antes de iniciar los experimentos de EAE.

Algunas limitaciones del protocolo deben mantenerse en mente. Lo más importante, la interpretación de los datos de EAEa se ve comprometida por el modo de inmunización con el uso de adyuvante y la tos ferina toxina que tiene tanto una influencia adicional en la reacción inmunológica. También se debe considerar que el modelo MOG 35-55 EAE muestra principalmente una célula T CD4 + impulsado respuesta inmunológica. Células T CD8 + y las células B jueganun papel menos prominente y protocolos alternativos deben ser considerados al tratar estos tipos de células. El curso de la enfermedad esperada es aguda, monofásica y autolimitada. Alternativamente, un curso de la enfermedad de recaída-remisión se puede conseguir también en los modelos de EAE alternativos. Una limitación importante adicional del protocolo es un cierto sesgo hacia el componente inmunológico de la fisiopatología de MS. Durante los últimos años, se ha vuelto cada vez más claro que la EM tiene un fuerte componente neurodegenerativo. La muerte de los oligodendrocitos y neuronas resultados en una acumulación progresiva de déficits neurológicos. Hay que tener en cuenta que el modelo de EAE puede no estar totalmente adecuado para abordar las cuestiones relativas a los mecanismos neurodegenerativos experimento de la inflamación autoinmune. Modelos animales alternativos con un enfoque en la patología del SNC pueden ser considerados - por ejemplo, el modelo cuprizone que compromete desmielinización tóxicos sin la participación del sistema inmune periférico.

El protocolo descrito puede considerar como un modelo experimental neuroinmunológicas básica y puede ser modificado para otras aplicaciones. El procedimiento experimental descrito anteriormente puede aplicarse fácilmente a otros protocolos de EAE por diferentes cepas de ratones o el tipo y la cantidad de proteína (por ejemplo, usar PLP139b151 péptido y ratones SJL para un curso de la enfermedad EAE recurrente-remitente, que es especialmente adecuado para la evaluación terapéutica efectos sobre las recaídas). El protocolo descrito también puede utilizarse para experimentos de transferencia adoptiva (pasiva EAE). En este modelo, ratones C57BL / 6 se inmunizan ratones con MOG 35-55 péptido y CFA como se describió anteriormente. Por el contrario, no se requiere la toxina pertussis. Después de 7-15 días, los bazos o ganglios linfáticos se aislaron y las células inmunes se volvieron a estimular in vitro con péptido MOG 35-55 y diversas citocinas antes de la transferencia a un nuevo grupo de ratones C57BL/6se. Estos ratones receptores desarrollan EAE unos pocos días antes que en clasinmunización SICAL. condiciones in vitro se pueden variar para las cuestiones inmunológicas específicas (por ejemplo, la polarización en T H 1 o células TH17).

A veces, la incidencia de la enfermedad baja o síntomas débiles podrían ser un desafío experimental. Algunas recomendaciones para la resolución de problemas son:

- Gravedad de la enfermedad se puede variar con diferentes cantidades de péptido / ratón.

- La concentración óptima CFA puede variar de 1-5 mg / ml. Considere la posibilidad de una titulación de CFA al establecer los experimentos. Por favor, consulte las directrices respectivas del cuidado de los animales institucional y el empleo Comisión respectiva para concentraciones CFA permitido tantas regulaciones prohíben las concentraciones exceden CFA 2 mg / ml.

- Diferentes métodos se describen para la preparación de la emulsión. Los métodos alternativos tales como vórtex durante 1 hora o ultrasonidos podrían considerarse si el pobre emulsificación se considera como posibfuente de error le.

- La edad, el género, la estación del año y de las condiciones ambientales dentro de las instalaciones de animales son factores importantes que influyen en la susceptibilidad EAE. Asimismo, debe asegurarse de que las condiciones son comparables entre experimentos independientes.

Como se describió anteriormente, el protocolo mencionado se puede utilizar como punto de partida para los experimentos de EAE adoptivos. Este modelo es especialmente adecuado para la separación de efectos periféricos y del sistema nervioso central de un fenotipo genético (por ejemplo, mediante la transferencia de células knockout encefalitogénicas en ratones receptores de tipo salvaje) y para preguntas inmunológicos específicos como el fenotipo de las células transferidas se puede caracterizar completamente. El último avance en la investigación de EAE en los últimos años son receptores de las células T de ratones transgénicos. Estos ratones desarrollan síntomas de la EAE de forma espontánea y sin influencia externa eludir el problema de la inoculación adyuvante. Sin embargo, este modelo requiere grandes cantidades de animales para breeding para asegurar tamaños de los grupos suficientes. Evaluación de ratones knockout requiere cruzamiento antes de los experimentos de EAE en contraste con EAEa. Como cada ratón desarrolla síntomas de la enfermedad en un día diferente, la evaluación de nuevas sustancias puede ser bastante complicado. Por lo tanto, el valor de EAEa clásica para neuroinmunológicas permanece sin respuesta.

Disclosures

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) Münster (SEED 03.12, SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

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References

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Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

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