Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG
1Department of Neurology, University of Münster, 2Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF), Münster, 3Institute of Physiology – Neuropathophysiology, University of Münster

Immunology and Infection
 

Summary

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla. C57BL / 6 topi sono immunizzati con mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), con un conseguente paralisi flaccida ascendente causata da cellule immunitarie autoreattive nel sistema nervoso centrale. Saranno discussi protocolli per l'induzione della malattia e monitoraggio.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J. Vis. Exp. (86), e51275, doi:10.3791/51275 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La sclerosi multipla è una malattia cronica neuroinfiammatorie demielinizzante del sistema nervoso centrale con una forte componente neurodegenerativa. Mentre l'esatta eziologia della malattia è ancora chiaro, linfociti T autoreattivi sono pensati per svolgere un ruolo centrale nella fisiopatologia. La terapia MS è solo parzialmente efficace finora e gli sforzi di ricerca continuano ad ampliare le nostre conoscenze sulla fisiopatologia della malattia e di sviluppare nuove strategie di trattamento. Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il modello animale più comune per MS condividere molte caratteristiche cliniche e fisiopatologiche. C'è una vasta diversità di modelli di EAE, che riflettono diversi aspetti clinici, immunologici ed istologici della SM umani. EAE Attivamente-indotta nei topi è il più semplice modello inducibile con risultati solidi e replicabili. E 'particolarmente adatto per lo studio degli effetti dei farmaci o di particolari geni, utilizzando topi transgenici contestati dalla Neuroi autoimmunenflammation. Pertanto, i topi sono immunizzati con omogenati SNC o peptidi di proteine ​​della mielina. A causa del basso potenziale immunogenico di questi peptidi, sono utilizzati coadiuvanti forti. EAE suscettibilità e fenotipo dipende l'antigene scelto e ceppo roditore. Topi C57BL / 6 sono il ceppo comunemente utilizzato per la costruzione di topo transgenico e rispondono tra gli altri alla mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG). L'epitopo immunogenico MOG 35-55 è sospeso in adiuvante completo di Freund (CFA) prima dell'immunizzazione e la tossina della pertosse si applica al giorno di immunizzazione e due giorni dopo. Topi sviluppano un "classico" EAE monofasico auto-limitata con crescente paralisi flaccida entro 9-14 giorni dalla vaccinazione. I topi vengono valutati quotidianamente utilizzando un sistema di punteggio clinico per 25-50 giorni. Considerazioni speciali per la cura prelievo di animali con EAE così come applicazioni potenziali e limiti di questo modello sono discussi.

Introduction

La sclerosi multipla (SM) è una malattia demielinizzante infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale in cui la distruzione di oligodendrociti e neuroni provoca sintomi clinici eterogenei e accumulando. MS è considerato come un disturbo autoimmune prototipo del sistema nervoso centrale (CNS) e modelli animali sono stati sviluppati per far luce sulla sua complessa patogenesi. Inoltre, le terapie attuali sono solo parzialmente efficaci e mira principalmente la fase infiammatoria della malattia, mentre la componente neurodegenerativa è probabilmente la grande sfida per il futuro approcci terapeutici 1,2.

Mentre l'esatta eziologia della malattia è ancora chiaro, una reazione autoimmune contro epitopi sulla guaina mielinica degli assoni del SNC è assunto per provocare l'insorgenza della malattia. Disregolazione del sistema immunitario, la vulnerabilità genetica e fattori ambientali (ad esempio infezioni, vitamina D) si ritieneinfluenza aspetti centrali dei meccanismi fisiopatologici della SM.

Tre diversi tipi di modelli animali sono attualmente stabiliti per l'esplorazione di modelli patologici della SM: modelli virali come il virus encefalomielite murino di Theiler (TMEV), modelli indotte da agenti tossici come cuprizone, e, infine, diverse varianti di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) 3, 4. Anche se tutti imitano le caratteristiche della SM, essi differiscono enormemente per caratteristiche patologiche sottostanti, come il coinvolgimento del sistema immunitario adattativo. EAE è il modello animale più comune in quanto è particolarmente utile per studiare percorsi neuroinfiammatorie e spesso serve da modello "prova di principio" per l'efficacia di strategie terapeutiche innovative 5,6. EAE può essere indotta in molti animali diversi (ad esempio topi, ratti, miniswine, cavie, polli o primati). Tuttavia, i topi sono diventati la specie più diffusa di utilizzare, che è almeno in parte dovutoad ampliare il repertorio di sofisticate transgenici o topi knockout 7.

La fisiopatologia della EAE è basato sulla reazione del sistema immunitario contro antigeni specifici cerebrali. Questa reazione provoca l'infiammazione e la distruzione delle strutture portanti antigene, con conseguente caratteristiche neurologiche e patologiche comparabili a quelli osservati nei pazienti con SM. Tre approcci diversi possono distinguere: attivamente indotta EAE (aEAE; immunizzazione attiva), trasferiti passivamente EAE (pEAE, il trasferimento di cellule encefalitogeniche da un animale immunizzato), e modelli più recentemente spontanei del mouse EAE (SEAE), che consentono lo studio di autoimmune meccanismi senza alcuna manipolazione esogena. Il modello più semplice è inducibile aEAE nei topi che producono in risultati rapidi e solidi. Questo modello è considerato come il "gold standard" di modelli animali neuroimmunologici da molti ricercatori nel campo 8.

Per l'induzione aEAE, l'animaleè immunizzato con una iniezione sottocutanea di un'emulsione composta dell'antigene scelto e completare adjuvans di Freund (CFA) accompagnati da una iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse nel giorno di immunizzazione e due giorni dopo. Di conseguenza, i linfociti T specifici mielina sono attivati ​​in periferia e migrano nel sistema nervoso centrale attraverso il sangue-cervello-barriera. Al momento dell'ingresso nel sistema nervoso centrale, le cellule T sono riattivati ​​dalle cellule presentanti l'antigene locali e infiltranti conseguente successiva cascata infiammatoria, il coinvolgimento di altre cellule come monociti o macrofagi e, infine, a demielinizzazione e morte cellulare assonale 9. A seconda del protocollo di immunizzazione e combinazione di ceppo mouse (per esempio C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) e l'antigene (ad es mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG), proteina basica della mielina (MBP), mielina proteina proteolipid (PLP)), la malattia Naturalmente può prendere una, il decorso della malattia remittente recidivante progressiva o cronica acuta.

35-55 peptide 10 che si traduce in un EAE monofasica con primi sintomi dopo 9-14 giorni, massimo malattia circa 3-5 giorni dopo l'insorgenza della malattia e recupero sintomo lenta e parziale nel corso dei prossimi 10-20 giorni. Poiché il potenziale immunogenico di MOG 35-55 peptide da sola non è sufficiente per indurre la malattia, adiuvanti come CFA sono necessarie. Si presume che i componenti di CFA attivano fagociti mononucleari inducono la fagocitosi di queste molecole e la secrezione di citochine. Ciò comporta il prolungamento della presenza di antigeni e un trasporto più efficiente di questi per il sistema linfatico. Induzione EAE è facilitata dalla applicazione di tossina della pertosse (PT) che è tra l'altro stato suggerito per modularela barriera emato-encefalica e la reattività immunologica sé 11. Dopo l'induzione della malattia, particolare cura deve essere presa per la valutazione giornaliera di topi per i sintomi della malattia.

Protocol

1. Osservazioni generali per esperimenti del mouse

  1. Tutti gli esperimenti con i topi devono essere effettuate in conformità con le linee guida del rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l'uso.
  2. Mantenere i topi in condizioni esenti da organismi patogeni e di consentire loro di avere accesso a cibo e acqua ad libitum. Nota: E 'importante usare età e topi appaiati per sesso in gruppi sperimentali, perché la suscettibilità alla malattia può variare a seconda dell'età e del sesso.
  3. A seconda delle condizioni sperimentali adottate, un gruppo di controllo sham immunizzato può essere considerato in cui MOG 35-55 peptide viene sostituito dal PBS senza antigene o un peptide nonencephalitogenic.
  4. Si prega di considerare aspetti metodologici precedenti esperimenti di partenza (vedi anche sotto). Si consiglia di coinvolgere uno o due osservatori in cieco per EAE punteggio.

2. Preparazione di MOG 35-55 Emulsione

  1. 200 ml di un rapporto 1:1 di MOG 35-55 soluzione peptide e CFA deve essere iniettato per ciascun topo. Vi è una certa perdita dell'emulsione viscoso durante la preparazione e l'iniezione. Pertanto, preparare 1,5-2x della quantità necessaria. Calcolare il volume totale dell'emulsione e dividere per 2 per gli importi richiesti sia soluzione MOG 35-55 peptide e CFA.
  2. Diluire MOG liofilizzato 35-55 in DDH 2 O a una concentrazione finale di 2 mg / ml. Usiamo solitamente 200 mg MOG 35-55 peptide per mouse. Tale importo è contenuta in 100 ml di soluzione di riserva. La soluzione peptide deve essere conservata a -20 ° C.
  3. Posizionare il contenuto di 1 fiala di essiccata H37Ra Mycobacterium tuberculosis (100 mg) in un mortaio.
    1. Terra con mortaio e pestello per ottenere una polvere sottile.
    2. Aggiungere 10 ml di coadiuvanti incompleto di Freund per ottenere una soluzione madre 10 mg / ml CFA che può essere conservato a 4 ° C.
    3. Prima di immunizzazione, diluire CFA soluzione stock with IFA ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Mescolare accuratamente prima dell'uso per risospenderne materiale particolato e prendere in considerazione una certa perdita di volume della soluzione viscosa durante i preparativi sperimentali.
    4. Mescolare 1:1 con MOG 35-55 soluzione peptide fino / ml viene raggiunta la concentrazione finale di 1 mg.
      ATTENZIONE:-ucciso calore Mycobacterium tuberculosis stimola la risposta immunitaria innata. Evitare l'inalazione, ingestione e contatto con la pelle e gli occhi.
  4. Preraffreddare soluzioni su ghiaccio.
    1. Elaborare 1 ml di 2 mg / ml CFA e 1 ml di 2 mg / ml soluzione MOG 35-55 in due siringhe da 2 ml. Calcolare il numero di siringhe necessarie in base al numero di animali immunizzati.
      ATTENZIONE: evitare assolutamente cucitura durante la preparazione di adiuvante in quanto può causare granulomi o indurre reazioni autoimmuni.
    2. Utilizzare un G cannula 27 per il 35-55 soluzione MOG e G cannula 20 per il CFA. Evitare bolle d'aria e collegare entrambe le siringhe con ahree-way-valvola.
    3. Inviare l'emulsione da una siringa all'altra e miscelare accuratamente per almeno 10 min come una buona emulsificazione è un passaggio critico. Vicino chiudere la tre vie valvola a sostenere emulsione. La soluzione deve essere bianco, rigido e viscoso senza separazione di fasi.
    4. Emulsione può essere conservato per diversi giorni prima dell'immunizzazione. Attendere almeno 30 minuti dopo la preparazione delle emulsioni per osservare se sono stabili. Prima dell'immunizzazione, disegnare la soluzione in una delle due siringhe e collegare un G cannula 27.

3. Preparazione tossina della pertosse

  1. Diverse quantità di tossina della pertosse possono essere trovati in letteratura che dipende anche dalla via di somministrazione (ad esempio per via endovenosa o intraperitoneale). Il nostro laboratorio utilizza 400 ng di tossina della pertosse in 200 ml di PBS per via intraperitoneale nel giorno della vaccinazione e due giorni dopo. ATTENZIONE: pertosse tossina ha molti effetti biologici. Evitare l'inalazione, ingestione e contatto con la pelle e gli occhi.
  2. Ricostituire 50 mg di tossina della pertosse in 500 microlitri DDH 2 O per una soluzione stock di 100 pg / ml. Conservare a 4 ° C.
  3. Diluire 1:50 con PBS. 200 ml contengono ora 400 ng di PBS. Preparare la quantità necessaria di siringhe e di prendere in considerazione un eccesso di volume aggiuntivo di ~ 100 microlitri per ogni hub ago.

4. Immunizzazione degli animali

  1. Si prega di fare riferimento alla cura degli animali e l'uso comitato istituzionale per criteri specifici per la richiesta di eutanasia a breve termine. Il nostro laboratorio utilizza breve narcotizzazione con isoflurano, mentre altri protocolli come l'iniezione di ketamina / xylazina o halothan può anche essere possibile. Attendere anestesia e utilizzare un pizzico piede convergenza anteriore per valutare il livello di anestesia.
  2. Assicurarsi che la vaccinazione viene eseguita da una persona esperta di ridurre al minimo lo stress per gli animali e per garantire l'immunizzazione ottimale.
  3. Iniettare 100 ml di lottagen / CFA emulsione per via sottocutanea in due siti differenti su ogni fianco posteriore. Assicurarsi che una bulbose forma di massa sotto la pelle che dovrebbero persistere per tutta l'esperimento.
  4. Iniettare 200 ml di tossina della pertosse intraperitonelly.
  5. Assicurarsi che i singoli topi possono essere facilmente identificati per la valutazione quotidiana, ad esempio segni di colore sulla base della coda.
  6. Somministrare una seconda dose di tossina della pertosse secondo giorno dopo l'immunizzazione.

5. Monitoraggio EAE

  1. Peso e score clinico devono essere valutati giornalmente. L'insorgenza di EAE generalmente correlato a perdita di peso, che può essere utilizzato come indicatore di attività della malattia. Si prega di fare riferimento alla cura degli animali istituzionale e utilizzare comitato di predefinire criteri quando i singoli topi devono essere presi fuori degli esperimenti. Questo dovrebbe essere considerato quando la perdita di peso supera il 20% del peso corporeo iniziale oppure quando gravi segni clinici (EAE punteggio 7 o peggio) si verificano. Si prega di fare riferimento al reorientamenti prospettici del rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l'uso per i punteggi massimi consentiti.
  2. Quando i topi hanno sintomi clinici di EAE, è importante garantire che la bottiglia d'acqua è ancora raggiungibile e che il cibo è posto sul pavimento della gabbia.
  3. Diversi sintomi di punteggio possono essere usati. Nel nostro laboratorio è stabilita una scala 0-10.
Grado Segno clinico Commento
0 Nessun segno clinico Andatura normale, coda si muove e può essere sollevata, la coda si avvolge intorno ad un oggetto rotondo se il mouse si tiene alla base della coda
1 Coda Parzialmente limp Andatura normale, punta della coda si strugge
2 Coda Paralizzato Andatura normale, la coda si strugge
3 Hind paresi degli arti, il movimento scoordinato Andatura scoordinata, coda arranca, arti posteriori rispondono a pizzicare
4 Uno degli arti posteriori paralizzati Andatura non coordinata con quella degli arti posteriori trascinamento, coda arranca, un arto posteriore non risponde a pizzicare
5 Entrambi gli arti posteriori paralizzati Andatura non coordinata con entrambi gli arti posteriori trascinamento, coda arranca, entrambi gli arti posteriori non rispondono a pizzicare
6 Arti posteriori paralizzati, debolezza arti anteriori Andatura non coordinata con le zampe anteriori lottano per tirare corpo, arti anteriori riflesso dopo la presa, la coda arranca
7 Arti posteriori paralizzati, una zampa anteriore paralizzato Il mouse non può muoversi, una zampa anteriore risponde a pizzico punta, coda arranca
8 Arti posteriori paralizzati, entrambe le zampe anteriori paralizzate Il mouse non può muoversi, entrambi arti anteriori non rispondono a pizzico punta, coda arranca
9 Moribondo Nessun movimento, respirazione alterata
10 Morte

Tabella 1. Sistema di punteggio clinico.

Representative Results

Dopo l'immunizzazione, i topi devono essere valutati quotidianamente per la variazione di peso e sintomi clinici. Insorgenza della malattia è tipicamente correlata con una riduzione di peso che potrebbe iniziare 1-2 giorni prima che i sintomi di EAE sono visibili. I segni clinici di EAE solito iniziano tra il giorno 9 e 14 post-vaccinazione. Poiché le lesioni sono prevalentemente localizzate al midollo spinale in MOG-EAE in C57BL / 6 topi, che in genere sviluppano sintomi prevalentemente motorie in un caudale per modello rostrale. Un quadro esemplare di un topo immunizzato con sintomi di EAE (punteggio 6) è mostrata in Figura 1A. Alcuni sintomi EAE atipici potrebbero verificarsi anche come rotolare in modo assiale rotante, l'aspetto curvo o ipersensibilità che non trovano riscontro nella EAE classica score illustrati nella tabella 1. Poiché i sintomi motori sono la caratteristica principale di questo modello, questo punteggio ci dà una buona indicazione della gravità della malattia. Diversi sistemi di monitoraggio (ad esempio segnare 0 -5 o 0-6) e più punteggi compositi complessi valutando diverse disavanzi sono stati pubblicati. Si prega di notare che i topi con sintomi gravi devono essere portati fuori dal dell'esperimento in base al rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l'uso. Topi mostrano recupero generalmente parziale dei sintomi nei prossimi 10-20 giorni. Un decorso della malattia rappresentativo è rappresentato in Figura 1B. Ci sono diversi momenti nel corso della EAE che sono di interesse per valutare parametri di risultati. Alcuni saggi tipici che si trovano spesso vengono descritti molto brevemente. Al massimo malattia, i topi possono essere valutati per la produzione di citochine e la proliferazione dopo ristimolazione di isolate cellule immunitarie con MOG 35-55 peptide in vitro (test di richiamo MOG). Le cellule immunitarie possono anche essere isolati dal cervello e midollo spinale di topi con sintomi di EAE e ulteriormente elaborati, ad esempio mediante citometria a flusso. L'analisi istologica delle sezioni del midollo spinale può essere effettuata in malattie massima per il carico lesionale e demielinizzazione, mentre al momento i punti marcatori per la neurodegenerazione e morte delle cellule neuronali potrebbe essere di interesse.

Figura 1
Figura 1. Risultati rappresentativa EAE. A. immagine rappresentativa di un immunizzato C57BL / 6 mouse con sintomi EAE (EAE punteggio 6). Decorso della malattia B. rappresentativa dopo l'immunizzazione oltre i 30 giorni. I dati sono mostrati come media ed errore standard della media (n = 5). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

Una moltitudine di differenti modelli di EAE con i protocolli di immunizzazione attiva è stata descritta nel corso degli ultimi decenni. Mentre i modelli di ratto sono stati ampiamente utilizzati fino a poco tempo fa, i topi sono oggi il più popolare organismo modello per la ricerca EAE. Questo sviluppo è tra l'altro a causa del repertorio ampio e sempre crescente di disponibili topi transgenici. Immunizzazione di topi C57BL / 6 con MOG 35-55 peptide è uno dei modelli più diffusi EAE e può essere considerato come un modello affidabile, riproducibile e ben impiego animale. In molti laboratori neuroimmunologici, MOG 35-55 EAE indotta è affermata come il modello di scelta, mentre altri modelli EAE sono utilizzati per più specifiche domande sperimentali.

Un punto critico da considerare è la pianificazione delle impostazioni sperimentali per assicurare che gli esperimenti EAE vengono eseguiti metodologicamente corretto. Per la validità interna, segnando accecato dei sintomi della malattia è altamente raccomandato. Compegruppi imental devono essere di età, peso e sesso-abbinato e topi dovrebbero essere assegnati in modo casuale a gruppi di trattamento. Gli esperimenti devono essere sempre eseguiti in conformità con le normative sul benessere degli animali. Gli studi EAE sono spesso sottodimensionato e non tengono in considerazione gli errori statistici di tipo II. Pertanto, prima di esperimenti, calcoli dimensione del campione devono essere eseguite. Gruppi di dimensioni necessarie dipendono dalla dimensione prevista effetto. La consultazione di un esperto per l'analisi statistica potrebbe essere considerato prima di iniziare gli esperimenti EAE.

Alcune limitazioni del protocollo devono essere tenuti a mente. Ancora più importante, l'interpretazione dei dati aEAE è compromessa dalla modalità di immunizzazione con l'uso di adiuvante e tossina della pertosse che hanno influenza sia aggiunto a reazione immunologica. Va inoltre considerato che il modello MOG 35-55 EAE mostra principalmente una cellula CD4 + T guidato risposta immunologica. Cellule T CD8 + e cellule B giocanoun ruolo meno importante e protocolli alternativi devono essere considerati quando si affrontano questi tipi di cellule. Il decorso della malattia previsto è acuta, monofasico e auto-limitata. In alternativa, un decorso recidivante-remittente può essere raggiunto anche in modelli EAE alternativi. Un ulteriore importante limitazione del protocollo è una certa tendenza verso la componente immunologica della fisiopatologia MS. Nel corso degli ultimi anni, è diventato sempre più chiaro che la SM ha una forte componente neurodegenerativa. La morte degli oligodendrociti e neuroni risultati in un progressivo accumulo di deficit neurologici. Si deve tener conto che il modello EAE non può essere completamente adatto per affrontare questioni esperimenti relativi alle modalità neurodegenerative di infiammazione autoimmune. Modelli animali alternativi con un focus sul sistema nervoso centrale patologia potrebbero essere considerati - ad esempio, il modello cuprizone che compromette demielinizzazione tossica senza il coinvolgimento del sistema immunitario periferico.

Il protocollo descritto da considerarsi come un modello di base neuroimmunologica sperimentale e può essere modificato per altre applicazioni. La procedura sperimentale sopra descritto può essere facilmente applicato ad altri protocolli EAE da diversi ceppi di topi o il tipo e la quantità di proteine ​​(ad esempio, utilizzare PLP 139-151 peptide e topi SJL per un corso della malattia EAE recidivante-remittente che è particolarmente adatto per la valutazione terapeutica effetti sulla recidive). Il protocollo descritto può anche essere usato per esperimenti di trasferimento adottivo (EAE passivo). In questo modello, C57BL / 6 topi sono immunizzati con MOG 35-55 peptide e CFA come descritto sopra. Al contrario, la tossina della pertosse non è necessaria. Dopo 7-15 giorni, milza o linfonodi sono isolate e le cellule immunitarie sono restimolati in vitro con MOG 35-55 peptide e varie citochine prima del trasferimento in un nuovo gruppo di topi C57BL/6se. Questi topi riceventi sviluppano EAE un paio di giorni di anticipo rispetto al momento clasimmunizzazione sico. Nelle condizioni in vitro possono essere variati per domande specifiche immunologici (ad es polarizzazione in T H 1 o T H 17 celle).

A volte, bassa incidenza di malattia o sintomi di debolezza potrebbe essere una sfida sperimentale. Alcuni consigli per la risoluzione dei problemi sono:

- La gravità della malattia può essere variato con diverse quantità di peptide / mouse.

- Concentrazione ottimale CFA può variare da 1-5 mg / ml. Si consideri una titolazione di CFA nello stabilire gli esperimenti. Si prega di fare riferimento alle rispettive linee guida del rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l'uso di concentrazioni di CFA accettati come molti regolamenti vietano concentrazioni CFA superiori a 2 mg / ml.

- Diversi metodi sono descritti per preparare l'emulsione. Metodi alternativi come il vortex per 1 ora o ultrasuoni possono essere considerate se il povero emulsione è considerato come possibfonte di errore le.

- Età, sesso, stagione dell'anno e delle condizioni ambientali all'interno della struttura degli animali sono fattori importanti che influenzano la suscettibilità EAE. Occorre garantire che le condizioni siano comparabili tra esperimenti indipendenti.

Come descritto sopra, il protocollo menzionato può essere utilizzato come punto di partenza per esperimenti EAE adottive. Questo modello è particolarmente adatto per la separazione effetti periferici e SNC di un fenotipo genetico (ad esempio trasferire cellule knockout encefalitogenici tipo selvatico in topi riceventi) e per specifiche domande immunologica del fenotipo delle cellule trasferiti si caratterizza accuratamente. L'ultimo sviluppo nel campo della ricerca EAE nel corso degli ultimi anni sono T recettore delle cellule topi transgenici. Questi topi sviluppano sintomi EAE spontaneamente senza influenze esterne aggirando il problema della adiuvante inoculazione. Tuttavia, questo modello richiede grandi quantità di animali per breeding per garantire gruppi di dimensioni sufficienti. Valutazione dei topi knockout richiede incrocio prima di esperimenti EAE in contrasto aEAE. Come ogni topo sviluppa i sintomi della malattia in un giorno diverso, la valutazione di nuove sostanze può essere piuttosto complicato. Pertanto, il valore della classica aEAE per neuroimmunologica rimane incontrastato.

Disclosures

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) e.g. Pepceuticals Ltd Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Sigma-Aldrich Co. F5506 Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle  e.g. Becton Dickinson & Co. 309625
Syringes, 2 ml e.g. B. Braun 7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in  e.g. Becton Dickinson & Co., 305122, 305106
Three way valve e.g. B. Braun 16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer Enzo Life Sciences Inc. BML-G100 Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA BD Difco 231141 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Wiendl, H. Neuroinflammation: the world is not enough. Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).
  3. vander Star, B. J., et al. In vitro and in vivo models of multiple sclerosis. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).
  4. Pachner, A. R. Experimental models of multiple sclerosis. Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).
  5. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).
  6. Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis. Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).
  7. Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. EAE: an immunologist's magic eye. Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).
  8. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).
  9. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).
  10. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).
  11. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J. Immunol. 169, 117-125 (2002).

Comments

5 Comments

  1. Dear Authors - you describe various conditions that contribute to a less than adequate disease response. But, do you have experience with conditions that create an exaggerated response in C57/Blk6 Jax, that result in animals dieing due to severe neurologic signs, rather than stabilizing and recovering as your discussion describes? For the past year, we have been struggling with a model that "used to work" at Harvard, but since moving to the National Cancer Institute, the model fails in that the previously resistant Tbet-/- (Tbx21) mice now develop EAE and both they and the Blk6 proceed to death. We have ruled out/excluded pathogens/commensals (segmented filamentous bacteria, Helicobacter, and norovirus), we have tried to emulate the same husbandry conditions as Harvard (using sterile micro-isolator caging, acidified water, even switching to a different diet)- but to no avail. Do you have any suggestions?

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 24, 2016 - 12:32 PM
  2. Dear Melody,
    these are rather strange experiences and my guess would be that there is a General Problem which renders your mice so over-succeptible to EAE. These changes are not so uncommon and can be rather tricky to solve. My advice would be to:
    - Try a delivery of your mice to another animal Provider (in europe we would for example choose Harlan or Janvier instead)
    - Try another animal housing facility at your University if available - the specific Environment can result in tremendous differences (even if there are no pathogens), People Report that regularly. The microbiome is suspected to be responsible for that while there are no specific tests for that.
    - Of course reduce amount of MOG (100 µg or lower)
    Hope that helps and good luck!
    Best, Stefan

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 25, 2016 - 9:16 AM
  3. Stefan- Thank you for your response. The investigator was using 100ug MOG and dropped it to 50ug, but this has not changed the profiles. We have done replicate studies in different facilities - same problem. Yesterday I found the following intriguing comments on the commercial Hooke EAE CRO site - they stated that you must titrate the pertussis dose for each lab, and if EAE is too severe, lower the dose (see below). Have you ever heard of this before? Does this sound reasonable? If you could give me your email, I can send you some of our mean clinical score graphs and you will see our problem. Here is their web site.
    http://www.hookelabs.com/protocols/eaeAI_C57BL6.html
    "Titration for optimal dosage of pertussis toxin. We strongly recommend that new customers establish the optimal PTX dose by inducing EAE in 10 mice in their own lab. The optimal PTX dose needed to obtain good EAE is typically 100 to 250 ng/mouse for each of the two PTX administrations. Larger doses of PTX are needed if mice experience higher levels of stress. The dose required decreases with mouse age. Even with identical mice and reagents, the PTX dose required varies from lab to lab. Finally, PTX potency varies from lot to lot; this affects the required dose. Hooke tests each lot of PTX in mice; the dilutions recommended in this protocol are the result of our testing.
    To determine the best PTX dose for the lab conditions, adjust PTX concentration to 4 µg/mL; this gives 400 ng PTX in each 0.1 mL dose (6000/1.5*0.1). Immunize 10 mice. Score mice daily starting 7 days after immunization, continuing until 28 days after immunization. (See Appendix A - EAE scoring guide.)

    If EAE is too severe, reduce PTX concentration to ~2.8 – 3.4 µg/mL (280 to 340 ng PTX/dose).
    If EAE is too mild, a higher dose of PTX is required;

    Reply
    Posted by: Melody R.
    May 25, 2016 - 12:03 PM
  4. My email is stefan.bittner@unimedizin-Mainz.de, you can reply directly there.
    I know Hooke kits and to our experience there is no obvious Change compared to self-made Solutions (for some People they work a bit better, for others not) - the main reason why we are not working with them routinously are Price + no flexibility in MOG/CFA composition.
    Pertussis: We never had Problems there and are not doing the testing (perhaps we are just lucky that our ptx is quite stable from Batch to Batch), but i know that other labs are doing the Titration as described by you and it might be a good Point for Trouble-Shooting!

    Reply
    Posted by: Stefan B.
    May 27, 2016 - 6:20 AM
  5. Dear Stefan,

    I am trying to induce EAE in a B6/129 mixed background strain of mice. I wonder would the same protocol work?
    Thanks,

    Donghai

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 1, 2016 - 6:41 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics