बेसल हड्डीवाला प्रजातियों से प्राथमिक myogenic अग्रदूत सेल / Myoblast संस्कृति की तैयारी

Biology

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Summary

इन विट्रो संस्कृति में सिस्टम हड्डीवाला myogenesis के बारे में हमारी समझ के लिए अपरिहार्य साबित किया है. हालांकि, बहुत विशेष रूप से बेसल taxa में, nonmammalian कंकाल की मांसपेशी विकास और विकास के बारे में सीखा जाना बना रहता है. इस ऊतक, myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं (MPCs) के वयस्क स्टेम कोशिकाओं को अलग करने, और एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना में उनके आत्म नवीकरण, प्रसार, और भेदभाव को बनाए रखने के लिए एक कुशल और मजबूत प्रोटोकॉल भर में संरक्षित और विभिन्न नियामक तंत्र की पहचान के लिए अनुमति देता है हड्डीवाला प्रजातियों.

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Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

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Abstract

कारण विवो में myogenic कार्यक्रम का अध्ययन के साथ शामिल निहित कठिनाई और समय पर, कंकाल की मांसपेशी के निवासी वयस्क स्टेम सेल से प्राप्त प्राथमिक संस्कृति प्रणाली, myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं (MPCs), स्तनधारी कंकाल की मांसपेशी विकास की हमारी समझ के लिए अपरिहार्य साबित किया है और विकास. विशेष रूप से कशेरुकी के बेसल taxa के बीच, तथापि, डेटा आत्म नवीकरण, प्रसार, और MPCs के भेदभाव को नियंत्रित आणविक तंत्र का वर्णन सीमित हैं. ब्याज की विशेष उपांग नुकसान (यानी urodele उभयचर) निम्नलिखित काफी postlarval कंकाल myofiber hyperplasia (यानी teleost मछली) और पूर्ण उत्थान गुजरना करने के लिए बेसल रीढ़ की क्षमता कायम करना है कि संभावित तंत्र हैं. इसके अतिरिक्त, सुसंस्कृत myoblasts का उपयोग उत्थान और myogenic कार्यक्रम की संक्षिप्त और उन दोनों के बीच मतभेद की समझ में सहायता कर सकते हैं. तकयह अंत में, हम विस्तार में एक मजबूत और कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन (और विविधताओं उसमें) अधिक के साथ शुरुआत myogenic कार्यक्रम के विकास को समझने के लिए एक मंच के रूप में सेल संस्कृति में, MPCs और उनकी संतान, myoblasts और अपरिपक्व myotubes अलग और बनाए रखने के लिए बेसल रीढ़. Zebrafish (Danio rerio) के मॉडल जीव स्थिति पर Capitalizing, हम cyprinid क्लेड Danioninae की छोटी मछलियों को इस प्रोटोकॉल के आवेदन पर रिपोर्ट. मिलकर में, इस प्रोटोकॉल मैक्सिकन Axolotl (Ambystomamexicanum) और यहां तक कि प्रयोगशाला कृन्तकों से MPCs अलग से एक व्यापक तुलनात्मक दृष्टिकोण का एहसास करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल अब व्यापक रूप से रेनबो ट्राउट, सामन, और समुद्र ब्रीम 1-4 सहित कई मछली प्रजातियों में myogenesis का अध्ययन करने में प्रयोग किया जाता है.

Introduction

स्तनधारी myogenesis की काफी समझ C2C12 5, दोनों को प्राथमिक माउस (मुसलमानों मस्कुलस) myoblast संस्कृतियों और अच्छी तरह से वर्णित माउस व्युत्पन्न सेल लाइन में इस प्रक्रिया की आवृत्ति के माध्यम से प्राप्त किया गया है. 1950 के दशक 6 में शुरू, इन संस्कृतियों अन्य रीढ़ में विस्तार, myogenesis द्वारा, murinemyogenic कार्यक्रम की समझ में बहुत उन्नति करने के लिए नेतृत्व और है. इसके अतिरिक्त, एकल कोशिका myofiber explant तकनीक उपग्रह कोशिकाओं और आसपास के myofibers 7-9 के बीच बातचीत की समझ से बाहर की वृद्धि हुई है. सेल संस्कृतियों रहे myogenesis की जांच के लिए विशेष रूप से आकर्षक होने के कारण थोड़े समय के अग्रदूत से भेदभाव सेल 10, आरएनएआई के लिए अभिकर्मक के सापेक्ष कम करने के लिए 11-14, ट्रांसजेनिक 15,16 और overexpression पढ़ाई 14,17,18, इन विट्रो में vivo प्रत्यारोपण 18-20 द्वारा पीछा विस्तार, और यहां तक कि कंप्यूटर अनुप्रयोगtaxa 21,22 भर myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं और उनके विनियमन एजेंटों के Arison. कारण संस्कृति प्रणाली के कृत्रिम पर्यावरण के लिए मतभेद 5,23 वर्णित किया गया है, वहीं इन इन विट्रो प्रणालियों multinucleated के गठन गवर्निंग जटिल कार्यक्रम के बारे में हमारी विच्छेदन के लिए अपरिहार्य साबित किया है, टर्मिनली विभेदित myofibersfrom myosatellite के रूप में जाना proliferative पूर्वज कोशिकाओं mononucleated स्तनधारियों के बीच सेल (MSCs).

स्तनीयजन्तु वर्ग के बाहर, तथापि, myogenesis नियंत्रित तंत्र के संरक्षण और / या विचलन खराब काफी हद तक विभिन्न taxa से myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं (MPCs) और myoblasts संवर्धन करने में कठिनाई, समझ रहे हैं. दरअसल, प्राथमिक myoblast संस्कृतियों केवल तीन पक्षियों 24-26, एक साँप 27, कुछ उभयचर 28-30, और कुछ मछलियों 1,3,4,31-33 में वर्णित किया गया है. Ve से निरंतर myogenic सेल लाइनोंकृन्तकों 34-36 अलावा अन्य rtebrates जापानी बटेर (Cortunix बिही) से प्राप्त किया जा रहा है केवल गैर स्तनधारी myogenic सेल लाइन, QM7 37 के साथ, और भी अधिक दुर्लभ हैं. अमरता पर कई प्रयासों के बावजूद, एक teleost myogenic सेल लाइन मायावी बनी हुई है और इन कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के लिए एक प्रोटोकॉल केवल इस वर्ष 15 प्रकाशित किया गया था. इस प्रकार, रीढ़ की एक किस्म से प्राथमिक MPCs और myoblasts संवर्धन के लिए स्पष्ट और अच्छी तरह से अनुकूलित प्रोटोकॉल बहुत ज्यादा आगे myogenic कार्यक्रम के विकास के हमारे ज्ञान का विस्तार करने के लिए ही नहीं है, लेकिन क्षेत्र में सफलताओं बनाने के लिए तुलनात्मक फिजियोलॉजी की शक्ति को रोजगार की जरूरत है मानव कंकाल की मांसपेशियों की बीमारियों और विकारों के उपचार.

साहित्य एमपीसी / myoblast अलगाव 38-49 की कई रिपोर्टों होता है, यह लेखकों संक्षिप्त, अक्सर अधूरी, स्वरूपों में ऐसे isolations के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए आम है. इसके अलावा, सबसे शिक्षाप्रद प्रोटोकॉल रेपोrted चूहों 50-53 के लिए विकसित किया गया है, और इनमें से कुछ इन प्रोटोकॉल व्यर्थ या मांसपेशी जीव द्वारा उपयोग अव्यावहारिक अंतरतम गैर कृंतक प्रजातियों बनाने, एंटीबॉडी चयन 54,55 या प्रतिदीप्ति transgenes 56,57 पर भरोसा करते हैं. Audiovisual मार्गदर्शन के साथ और दूर से संबंधित प्रजातियों में प्रदर्शन दक्षता के साथ वर्णित मछली, उभयचर, और साँप myogenesis, एक विस्तृत और गहन प्रोटोकॉल, के बारे में छोटे से ज्ञात के साथ, क्षेत्र के लिए सबसे उपयोगी होगा.

पहली बार 1989 में 58 में पॉवेल और उनके सहयोगियों द्वारा वर्णित, निम्नलिखित प्रोटोकॉल शुरू में (अर्थात्, इंद्रधनुष, mykiss ओंकोरहिन्चस, और अटलांटिक सामन, Salmo सालार) salmonid मछलियों और कुछ बड़े cyprinids (यानी सुनहरी, Carassiusauratusauratus) से MPCs और myoblasts अलग करने के लिए विकसित किया गया था . 2000 में, Fauconneau और Paboeuf इंद्रधनुष 59 के लिए एक प्राथमिक myoblast संस्कृति अनुकूलित किया है, और minoroptimizations माDanioninae क्लेड (zebrafish, Danio rerio, और विशाल Danio, Devario aequipinnatus) के कारण zebrafish काम के लिए उपलब्ध कई आनुवंशिक उपकरणों के लिए 32 और इस प्रकार अपने करीबी रिश्तेदारों के कई छोटे minnows में इस्तेमाल कि प्रोटोकॉल डे. Teleost मछली की वजह से कम से कम (ज्यादातर प्रजातियों में) उनके मुक़्तलिफ़ विकास रणनीति के लिए अध्ययन के लिए आकर्षक जीव हैं. बड़े salmonids, सबसे मछलियों की तरह, यहां तक कि पुराने उम्र 60-62 में, परिपक्वता पर एक asymptote से निरंकुश विकास क्षमता के साथ, धुंधलेपन से बढ़ता है. Zebrafish के विपरीत, इस तरह के विशाल Danio 63 और teleost मछली के विशिष्ट moustached Danio प्रदर्शन विकास क्षमता, उनके प्रत्यक्ष मुक़ाबला एमपीसी सेल भाग्य चुनाव अतिवृद्धि बनाम कंकाल की मांसपेशी hyperplasia में एक भूमिका निभाता है समझने के लिए एक आदर्श मंच बनाने के रूप में बड़े danionins.

इसी तरह, हम अपेक्षाकृत उच्च सेल उपज और viab के साथ, इस प्रोटोकॉल चूहों और axolotls के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया हैility सूचकांकों. ऐसे मैक्सिकन Axolotl (Ambystomamexicanum) के रूप में Urodele सैलामैंडर, पूरे अंग और पूंछ 64-66 सहित ऊतकों को पुनर्जीवित करने के लिए उल्लेखनीय क्षमता के अधिकारी. यह विशेषता कंकाल की मांसपेशी बर्बाद और उम्र बढ़ने के इन उभयचर दिलचस्प मॉडल बनाता है. इस तरह के अध्ययन के लिए एक भी व्यापक तुलनात्मक संदर्भ प्रदान करने, कई मछली प्रजातियों में किया गया है के रूप में नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक समान दृष्टिकोण किया जा सकता है. कई के रूप में सही मायने में तुलनात्मक जीव डेटा (यहाँ, पूरे हड्डीवाला वंश) व्यापक स्पेक्ट्रम के भीतर विश्लेषण कर रहे हैं जब बुनियादी जीव विज्ञान और translational biomedicine में सबसे सार्थक प्रगति की जा सकती है, की सराहना करते हैं.

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Protocol

आचार विवरण: यहाँ बताया हड्डीवाला जानवरों को शामिल सभी प्रयोग बर्मिंघम में अलबामा के विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा पहले से अनुमोदित और प्रयोगशाला पशु कल्याण, अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के कार्यालय द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुरूप किया गया है स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग.

संस्कृति के लिए 1. तैयारी

  1. (, 2 एल प्रति 26.96 ग्राम 13.48 छ / एल) 9 मिमी NaHCO 3 (2 एल प्रति 1.51 ग्राम), DMEM में 20 मिमी HEPES (2 एल प्रति 9.53 छ) इस प्रकार है: आधार मध्यम तैयार.
    1. पीएच का निर्धारण करते हैं और एचसीएल या NaOH के साथ 7.40 को समायोजित करें.
    2. Osmolality का निर्धारण करते हैं और (यदि आवश्यक) NaCl के साथ ~ 300 mOsm को समायोजित करें.
    3. फिल्टर करने के लिए 2-3 महीने के लिए प्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस (2) 1 एल वैक्यूम नसबंदी प्रणाली और दुकान का उपयोग कर बाँझ.
      नोट: पूरा अभिकर्मक टेबल्स के लिए 1 और 2 देखें, उपकरण, consumables, और उपकरण जानकारी.
  2. Ultrapure बाँझ पानी के 50 एमएल में γ विकिरणित पाली एल lysine की 5 मिलीग्राम (> 3,00,000 मेगावाट) भंग करके पाली एल lysine इलाज प्लेटों की तैयारी. लाइसिन पॉलिमर के पूर्ण विघटन को सुनिश्चित करने, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए उलटा द्वारा धीरे मिलाएं.
  3. थाली प्रकार (तालिका 3) के अनुसार, प्रत्येक कुएं में पाली एल lysine समाधान के लिए आवश्यक राशि पिपेट. प्लेटों 5 मिनट के लिए लामिना का प्रवाह हुड में खड़ा करने की अनुमति दें.
  4. अगला, पाली एल lysine समाधान निकालने और बाँझ पानी के साथ दो बार धोने. 20 मिनट के लिए लामिना का प्रवाह हुड में शुष्क हवा की प्लेटों की अनुमति दें.
  5. Laminin की 1 मिलीग्राम (Engelbreth-होल्म-झुंड मूल) प्राप्त करें और 20 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के आधार माध्यम के 50 मिलीलीटर में भंग. / 2 सेमी 2 ग्राम पर पाली एल lysine इलाज सेल संस्कृति प्लेटों को laminin समाधान लागू करें. (अलग थाली आकार के लिए 3 टेबल देखें)
  6. धीरे फू सुनिश्चित करने के लिए समाधान ज़ुल्फ़कवरेज अच्छी तरह से करूँगा. 24 घंटे के लिए प्रयोगशाला टेप और इनक्यूबेटर में जगह के साथ प्लेटें सील. इनक्यूबेटर इस्तेमाल किया जा रहा प्रजातियों के लिए उपयुक्त तापमान (7 तालिका देखें) करने के लिए सेट किया जाना चाहिए, और कोई अतिरिक्त गैसों इनक्यूबेटर में जोड़ा जाना चाहिए.
    नोट: laminin कोशिकाओं बोने से पहले 24 घंटे के लिए प्लेटों का पालन करने की अनुमति दी जानी चाहिए. ऐसा न करने पर कोई सेल पालन करने के लिए गरीब का परिणाम देगा.
  7. तालिका 4 में वर्णित के रूप में मीडिया को तैयार है. पूरा मीडिया सबसे अच्छा उपयोग के दिन के लिए तैयार है.
  8. ऊतक अलगाव के लिए तैयार करने में, निम्न वस्तुओं और आटोक्लेव इकट्ठा: 300-500 मिलीलीटर बीकर (ओं); गिलास पेट्री डिश; स्केलपेल संभालती है; संदंश (ठीक है और मोटे); विच्छेदन कैंची; और पानी repellant आटोक्लेव कागज के कई पत्र.
    नोट: विच्छेदन की प्रक्रिया के साथ सहायता के लिए प्रत्येक व्यक्ति के लिए, (2) स्केलपेल संभालती है, (1) संदंश (प्रकार निजी पसंद पर निर्भर करता है), (1) विच्छेदन कैंची, और पानी repellant आटोक्लेव कागज की (5-10) शीट्स हैंपर्याप्त.
  9. ऊपर autoclaved मदों के अलावा, 70% इथेनॉल, एक वजन संतुलन, बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (संख्या संस्कृति के आकार पर निर्भर करता है), और बर्फ इकट्ठा.

2. ऊतक विच्छेदन

  1. शुरुआत से पहले, मछली की एक पर्याप्त स्टॉक उपलब्ध है यह सुनिश्चित.
    नोट: प्रयोग की जाने वाली मछली की उम्र के महत्व का है. दो अलग अलग प्रजातियों की मछली समान भार की हो सकती है, एक प्रजाति की एक छोटी मछली एक अन्य प्रजातियों के एक पुराने मछली की तुलना में अधिक MPCs के अधिकारी करेंगे. एक सामान्य नियम, salmonids के साथ काम कर रहा है, खासकर जब छोटी मछली, के रूप में, सबसे अच्छा कर रहे हैं. उम्र 4-6 महीने या छोटी (15 ग्राम) का salmonids इष्टतम हैं जबकि danionins के लिए, एक वर्ष के रूप में ही पुराना मछली, बेहतर उपयोग किया जा सकता है.
  2. एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अलगाव माध्यम की, विभाज्य 25 मिलीलीटर विच्छेदित किए जाने की ऊतक के प्रत्येक 5 ग्राम के लिए.
  3. , रिकॉर्ड जन, और संख्या ट्यूब (ओं) वजन. बर्फ पर ट्यूबों रखें.
  4. 2-3 मछली euthanize> 300 मिलीग्राम / एल सोडियम बाइकार्बोनेट बफर tricaine methanesulfonate में विसर्जन से एक समय में. > 5 मिनट के लिए संघर्ष और उसके बाद 30 सेकंड के लिए (बाँझ बीकर में निहित) 70% इथेनॉल में मछली पानी में डुबोना को opercular आंदोलन की अनुमति दें.
  5. 70% इथेनॉल से मछली निकालने और पानी repellant आटोक्लेव कागज पर जगह है. सीधे opercula के पीछे, एक सतही, उथले चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें. Aforementioned चीरा में त्वचा लोभी द्वारा तराजू और त्वचा निकालें और मछली की पूंछ की ओर खींचो.
  6. त्वचा को हटाने के बाद, अध्यक्षीय, दोनों पक्षों से मछली का तेजी से ग्लाइकोलाइटिक 'सफेद' मांसपेशी (पार्श्व रेखा के निकट स्थित धीमी गति से ऑक्सीडेटिव 'लाल' पेशी से बचने) और अलगाव मध्यम में जगह आबकारी. संस्था द्वारा आवश्यक के रूप में मछली के शेष त्यागें.
    नोट: अध्यक्षीय मीटर से अलग यह लाल पेशी से होने संस्कृति MPCs के लिए पूरी तरह से संभव है, teleost MPCs का उपयोग लगभग हर प्रकाशन उपयोग किया गया है कोशिकाओंyotome.
  7. पेशी के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त किया जाता है जब तक दोहराएँ 2.4-2.6 कदम. विच्छेदन के दौरान जमा मांसपेशियों के ऊतकों सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए बर्फ पर रहता है यह सुनिश्चित.

3. यांत्रिक हदबंदी

  1. एक गिलास पेट्री डिश में मांसपेशियों के ऊतकों की 25 मिलीलीटर / 5 ग्राम की एक ट्यूब डालो. दो स्केलपेल का उपयोग कर संलग्न # 10 स्केलपेल ब्लेड, एक घोल या प्यूरी स्थिरता के लिए कीमा ऊतक के साथ संभालती है. एक दूसरे के अतीत स्केलपेल ब्लेड खींच के एक "पीछे और आगे" गति सबसे अच्छा काम करता है.
    नोट: ऊतक homogenizers उचित लग सकता है समाप्त कर दिया है, अगर नहीं व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में नाटकीय रूप से, कम हो जाएगा.
  2. एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक और सीरम वैज्ञानिक pipettor का उपयोग, slurried ऊतकों को हटाने और मूल शंक्वाकार ट्यूब में जगह.
  3. सभी ट्यूबों में सभी ऊतक यंत्रवत् अलग कर दिया गया है जब तक दोहराएँ 3.1-3.2 कदम.
  4. 300 XG पर 5 मिनट और 10 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र ऊतक
  5. FollCentrifugation के कारण एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट, निर्वात चूषित्र, या सावधान decanting द्वारा साथ मीडिया पर तैरनेवाला के 25 एमएल त्यागें.
  6. प्रत्येक ट्यूब, resuspend ऊतकों को धोने के माध्यम के 25 एमएल जोड़ें, और ऊपर के रूप में recentrifuge.
  7. सतह पर तैरनेवाला हर बार हटाने, धोने के माध्यम से दो बार धोएं.

4. Enzymatic पृथक्करण

  1. 3.4 कदम के दौरान (0.11 g/0.22 मिलीलीटर या पर्याप्त मात्रा) टाइप चतुर्थ collagenase के 0.22 जी और आधार माध्यम के 44 मिलीलीटर के संयोजन से collagenase समाधान तैयार करते हैं.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए एक बीकर में हलचल फ़िल्टर एक 50 मिलीलीटर सिरिंज और एक 0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ बाँझ.
    नोट: एक से अधिक सिरिंज फिल्टर collagenase तैयारी पर निर्भर करता है, जरूरत हो सकती है. वर्थिंगटन बायोकेमिकल अलावा अन्य विक्रेताओं से प्राप्त collagenase छानने के दौरान अधिक कठिनाई बन गया है. Collagenase endomysium कि गठन मज्जा में पेप्टाइड बांड अलग कर देना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहपाचन myofibers की कि सुरक्षा अवरोध को दूर करेगा.
  3. मांसपेशियों के ऊतकों में से प्रत्येक जी के लिए, एक 0.2% collagenase समाधान में ऊतक resuspend. मांसपेशियों के ऊतकों के 5 ग्राम के लिए, collagenase समाधान के 10 एमएल और आधार माध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. Collagenase समाधान / आधार मध्यम (25 मिलीलीटर जैसे 250 μl) की मिलीलीटर प्रति पीएसएफ के 10 μl जोड़ें. इस enzymatic पाचन की क्षमता को प्रभावित करेगा के रूप में, ऊतक अच्छी तरह से निलंबित कर दिया है कि यह सुनिश्चित करें.
  5. कोमल कमाल के साथ 18 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए collagenase में मांसपेशियों के ऊतकों को सेते हैं. इस सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है, हालांकि यांत्रिक हदबंदी और प्रजातियों की डिग्री पर निर्भर करता है, collagenase पाचन, 90 मिनट के लिए बढ़ाया जा सकता है.
  6. 12 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर collagenase पाचन, अपकेंद्रित्र शंक्वाकार ट्यूबों के बाद धोने के माध्यम के 25 एमएल में सतह पर तैरनेवाला और resuspend ऊतक त्यागें.
  7. Recentrifuge 5 मिनट के लिए 300 x जी पर 12 पर6, सी. वॉशिंग माध्यम के साथ एक दूसरी बार दोहराएँ.
  8. वॉशिंग ऊतक दो बार, एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ धोने मध्यम और triturate के 25 एमएल में Resuspend मांसपेशियों के ऊतकों ऊतक / मध्यम homogenate रिश्तेदार आसानी से पिपेट के अंदर और बाहर गुजरता है जब तक करने के बाद. 5-10 triturations आमतौर पर पर्याप्त है.
    1. एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक और फिर एक सिरिंज से जुड़ी एक 16 गेज धातु प्रवेशनी से दोहराएँ.
  9. 12 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र शंक्वाकार ट्यूबों सतह पर तैरनेवाला छानना.
  10. ऊपर 5 मिनट centrifugation के दौरान, बेस माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ trypsin के 0.25 जी के संयोजन से trypsin पाचन समाधान तैयार करें.
  11. 10-15 मिनट और फिल्टर एक 20 मिलीलीटर सिरिंज और 0.45 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के साथ बाँझ के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हलचल.
  12. शंक्वाकार ट्यूबों निकालें और हर ट्यूब के लिए मांसपेशियों के ऊतकों के हर 1 ग्राम के लिए trypsin समाधान के 100 μl और पृथक्करण माध्यम की 4.9 मिलीलीटर जोड़ें. EXA के लिएmple, trypsin समाधान के 500 μl और मांसपेशियों के ऊतकों के 5 ग्राम के लिए हदबंदी मध्यम से 24.5 मिलीलीटर जोड़ें.
    नोट: Trypsin बेसल लामिना से myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं को अलग कर देगा कि एक सेरीन प्रोटीज है.
  13. Resuspend trypsin / हदबंदी में ऊतक मध्यम अच्छी तरह से. 18 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते
  14. 12 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 300 XG पर पहले trypsin ऊष्मायन, अपकेंद्रित्र शंक्वाकार ट्यूबों के बाद
  15. अलगाव मध्यम के 4 संस्करणों के लिए सतह पर तैरनेवाला के 1 मात्रा के एक एकाग्रता में अलगाव मध्यम साथ supernatants संयोजन से trypsin बेअसर. दूसरी trypsin पाचन के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  16. ऊतक के शेष गोली, दोहराने पहले trypsin पाचन से सतह पर तैरनेवाला / अलगाव माध्यम के साथ कदम 4.15 निम्न सतह पर तैरनेवाला के संयोजन, 4.12-4.15 कदम.
  17. वैकल्पिक रूप से: collagenase और trypsin digestions सेल पैदावार को अधिकतम करने के लिए जोड़ा जा सकता है. <राजभाषा>
  18. ऐसा करने के लिए, homogenate आसानी प्रवेशनी के माध्यम से गुजरता है जब तक collagenase एक 20 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक धातु (लंबाई में 6 और 16 गेज सबसे अच्छा काम करता है) प्रवेशनी का उपयोग पचाने triturate.
  19. Homogenate करने के लिए, (कदम 4.10 में तैयार) trypsin समाधान के 500 μl जोड़ने के लिए और 20 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  20. 12 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 300 XG पर ऊष्मायन, अपकेंद्रित्र शंक्वाकार ट्यूबों के बाद
  21. अलगाव मध्यम के 4 संस्करणों के लिए सतह पर तैरनेवाला के 1 मात्रा के एक एकाग्रता में अलगाव मध्यम साथ supernatants संयोजन से trypsin बेअसर.
  22. दूसरी trypsin पाचन के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  23. मानक प्रोटोकॉल के साथ के रूप में कदम 4.18 साथ आगे बढ़ें.
  • 300 XG पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में अंतिम सतह पर तैरनेवाला / अलगाव मध्यम मिश्रण बांटना 12 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए
  • निकालें सेल को परेशान करने की नहीं ख्याल रख रही supernatantsहिमपात. पिपेट प्रत्येक सेल गोली भंग प्रत्येक ट्यूब में पूरा मध्यम 2 मिलीलीटर,.
  • एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूरा मध्यम में निलंबित कोशिकाओं का मिश्रण.
  • पहले resuspended कोशिकाओं के पूल के साथ संयोजन, पूरा मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक ट्यूब कुल्ला.
  • एक धातु प्रवेशनी साथ Triturate और 5-10 बार सिरिंज.
  • पूरा मध्यम के साथ rinsing, एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन तक.
  • एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन तक.
  • 50 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त पूरा मध्यम जोड़ें और 15 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र
  • 5. गिनती, कमजोर पड़ने, और कोशिकाओं की सीडिंग

    1. कदम 4.25 में अंतिम centrifugation के बाद, सावधान decanting द्वारा या एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटायें. पूरा मध्यम के 5 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend.
    2. कोशिकाओं को पूरी तरह resuspended के साथ 20 μl हटाने; एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में सेल निलंबन और जगह की.
    3. Trypan नीले रंग के 5 μl जोड़ें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें. एक hemocytometer का उपयोग, व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं.
    4. दृढ़ संकल्प पर, जरूरत एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को कमजोर. Teleost MPCs सबसे अच्छा 2 सेमी प्रति 150,000-200,000 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त हैं. एक छह अच्छी तरह चढ़ाना रणनीति के लिए, 1.5 x 10 6 कोशिकाओं गिराए - मिलीलीटर प्रति 2.0 x 10 6 पर्याप्त प्रसार और भेदभाव का समर्थन करता है.
    5. पाली एल lysine का इलाज, laminin लेपित प्लेटें और बीज कोशिकाओं निकालते हैं. (थाली विशेष dilutions और चढ़ाना संस्करणों के लिए 5 तालिका देखें.) नोट: 6 तालिका विभिन्न teleost प्रजातियों से अलग मांसपेशियों के ऊतकों के ग्राम प्रति अलग कक्षों की औसत संख्या को दर्शाया गया है. रेनबो ट्राउट (ओ mykiss) कर zebrafish (डी. rerio) से मांसपेशियों के ऊतकों के ग्राम प्रति कम MPCs प्रदर्शन और इस तरह उचित बोने के लिए से अलग करने के लिए और अधिक मछली की आवश्यकता होगी.
    6. उचित तापमान पर द्रुतशीतन इनक्यूबेटर में प्रयोगशाला टेप और जगह के साथ प्लेटें सील. (चूहों के लिए बचाने के लिए) यहां सूचीबद्ध सभी प्रजातियों से MPCs कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) पूरकता के बिना सामान्य वायुमंडलीय परिस्थितियों में incubated किया जा सकता है. (7 तालिका देखें.)
    7. वैकल्पिक रूप से: कुछ प्रयोगशालाओं MPCs 40 मिनट के लिए संस्कृति substrata का पालन करने की अनुमति के लिए कहता है कि एक प्रोटोकॉल को अपनाया है.
      1. फिर किसी भी शिथिल संलग्न और गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के लिए धोने मीडिया के साथ प्लेटों कुल्ला. चेतावनी: इस कदम संस्कृति substrata के लिए अन्य कोशिकाओं के "गैर विशिष्ट" आसंजन (जैसे fibroblasts) से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है.
      2. इनक्यूबेटर में पूरा मीडिया और जगह कोशिकाओं जोड़ें और नीचे विस्तृत रूप के लिए परवाह है.

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    Representative Results

    चौबीस घंटे के बाद बोने, myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं (MPCs) (आंकड़े 1 ए और 1 डी देखें) laminin बुनियाद से जुड़ी दिखाई जानी चाहिए. बोने के बाद, कोशिकाओं (MPCs) इस सेल प्रकार का संकेत एक धुरी की तरह आकार, चित्रा (1) अपनाने और MyoD1 + (चित्रा 2) हैं. Danio प्रजातियों में, MPCs ओंकोरहिन्चस और Salmo प्रजातियों से MPCs कर की तुलना में छोटे द्विध्रुवी प्रक्रियाओं के साथ और अधिक कॉम्पैक्ट हो दिखाई देते हैं. हालांकि, संस्कृति के चार दिन, सभी की जांच की मछली प्रजातियों से MPCs समान morphologies अपनाने और myoblasts तरह साफ़ देखने (आंकड़े 1 बी और 1E). पूरा मीडिया हटाया जाना चाहिए, और MPCs धोने माध्यम के साथ दो बार धोया जाना चाहिए. Myofibroblasts myogenic संस्कृतियों को दूषित और (myoblast की धुरी आकार की तुलना में) उनके स्टार की तरह आकारिकी द्वारा MPCs / myoblasts से आसानी से अलग पहचाना जाता है सकते हैं. प्लेटों की धुलाई बहुत मैंऐसे fibroblasts को हटाने mproves.

    (7 तालिका देखें) यहाँ वर्णित प्रजातियों में, दैनिक मीडिया परिवर्तन सबसे अच्छा परिणाम. MPCs और संतान (myoblasts और नवजात myotubes) से पहले ताजा पूरा मीडिया के अलावा करने के लिए एक या दो बार धोया जाना चाहिए. कोशिकाओं निश्चित myoblast मंच (संस्कृति की लगभग 4 दिन) तक पहुँच चुके हैं के बाद वैकल्पिक रूप से, मीडिया परिवर्तन हर दूसरे दिन तक कम किया जा सकता है. Myotubes 2-3 दिनों के भीतर (आंकड़े -1 सी और 1F) फार्म और चित्रा (2) + myogenin हो, विशेष रूप से जब भेदभाव मध्यम में संवर्धित (नीचे देखें) चाहिए. महीने के लिए सप्ताह की अवधि के कई स्तनधारी प्रजातियों में सूचना दी गई है, वहीं मछली का MPCs और myoblasts ऐसे समय की अवधि बर्दाश्त नहीं दिखाई देते. कोशिकाओं संस्कृति के पहले छह दिनों दिन 7 और संस्कृति के 9-11 के बीच बाद में भेदभाव के साथ (चित्रा 3), के लिए पैदा करना. उसके बाद, कोशिकाओं senescence या एकpoptose.

    MPCs और उनकी संतान इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग की myogenic प्रकृति जीन अभिव्यक्ति पर आधारित 3,32,33 निर्धारित किया गया है. कोशिकाओं दिनों संस्कृति के 6-9 के दौरान अपरिपक्व myotubes फार्म के रूप में पहचान तेजी से वृद्धि के साथ, (प्राथमिक murine myoblasts या C2C12 उपयोग प्रणालियों की तुलना में) स्तनधारी संस्कृति प्रणालियों के विपरीत, MPCs और myoblast संतान के प्रसार संस्कृति के प्रारंभिक दिनों के दौरान अपेक्षाकृत कम है Danio प्रजातियों 32 में. इंद्रधनुष से रिपोर्ट (स्तनधारी myoblast संस्कृतियों में आम है, लेकिन मछली का सिस्टम में आवश्यक नहीं है) एक भेदभाव मध्यम से उपयोग और myotube गठन 33 के साथ के रूप में उम्मीद है कि प्रसार सूचकांक में कमी का संकेत मिलता है. सेलुलर senescence या apoptosis होने से पहले हमारे हाथ में, परिणामी myotubes अप करने के लिए 9-11 दिन (Danio प्रजाति) के लिए संस्कृति में रहते हैं और 11-13 दिनों (ओंकोरहिन्चस प्रजाति) कर सकते हैं.

    अभिकर्मक कंपनी (पसंदीदा वी. वैकल्पिक) सूची संख्या (पसंदीदा वी. वैकल्पिक) संस्कृति के प्रति मात्रा
    γ विकिरणित पाली एल lysine सिग्मा Aldrich (सांसद Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 मिलीग्राम
    DMEM (उच्च ग्लूकोज) सिग्मा Aldrich (cellgro) मीट्रिक टन-50-003-पीबी (D7777) 2 एल
    Laminin बी.डी. बायोसाइंसेज (सिग्मा Aldrich) सीबी-40232 (L2020) 1 मिलीग्राम
    सोडियम बाइकार्बोनेट (3 NaHCO) फिशर साइंटिफिक (सिग्मा Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 जी
    HEPES (सी 8 एच 18 एन 24 एस) फिशर साइंटिफिक (सिग्मा Aldrich) BP310 -1 (H6147) 9.53 जी
    एंटीबायोटिक / कवकनाशी थर्मो वैज्ञानिक (एसigma Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 मिलीलीटर
    Gentamicin सल्फेट Lonza (सिग्मा Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 मिलीलीटर
    दाता इक्वाइन सीरा थर्मो वैज्ञानिक (सिग्मा Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 मिलीलीटर
    भ्रूण गोजातीय सीरा थर्मो वैज्ञानिक (सिग्मा Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 मिलीलीटर
    Collagenase (प्रकार चतुर्थ) वर्थिंगटन (सिग्मा Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 जी
    Trypsin (अग्न्याशय से) सांसद Biomedicals (सिग्मा Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 ग्राम

    तालिका 1. पसंदीदा निर्माता और सूची संख्या के साथ विस्तृत अभिकर्मक सूची.

    उपभोज्य उपकरण उपकरण
    सेल संस्कृति प्लेटों संदंश (मोटे) सीरम विज्ञानी pipettor
    बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों संदंश (ठीक) पीएच मीटर
    प्रयोगशाला टेप स्केल्पल हैंडल द्रुतशीतन इनक्यूबेटर (Echotherm)
    0.2 माइक्रोन वैक्यूम नसबंदी सिस्टम स्केलपेल ब्लेड (# 10, # 11) लामिना का प्रवाह हुड
    पानी repellant आटोक्लेव कागज शल्य कैंची वैक्यूम कई गुना
    सीरम विज्ञानी Pipettes ग्लास पेट्री डिश Microosmolality मीटर
    Luer ताले के साथ 12-16 जी Cannulas

    सेल संस्कृति के लिए आवश्यक तालिका 2. उपभोज्य, उपकरण, और उपकरणों.

    प्लेट आकार खैर प्रति सेमी 2 पाली एल lysine * Laminin **
    6 अच्छी तरह से 9.5 1.6 मिलीलीटर 1
    24 अच्छी तरह से 1.9 0.32 0.2
    48 अच्छी तरह से 0.95 0.16 0.1
    96 0.32 0.06 0.03
    * 0.1 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता ** 0.020 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता

    तालिका 3. पाली एल lysine और laminin साथ सेल संस्कृति प्लेटों कोटिंग के लिए संस्करणों अनुकूलित.

    अभिकर्मक अलगाव धोना हदबंदी पूरा
    आधार मध्यम 419.25 मिलीलीटर 395.40 मिलीलीटर 297.00 मिलीलीटर 178.00 मिलीलीटर
    पीएसएफ * 5.00 मिलीलीटर 4.00 मिलीलीटर 3.00 मिलीलीटर 2.00 मिलीलीटर
    Gentamicin सल्फेट ** 0.75 मिलीलीटर 0.60 मिलीलीटर - -
    दाता घोड़े सीरम 75.00 मिलीलीटर - - -
    भ्रूण गोजातीय सीरम *** - - - 20.00 मिलीलीटर
    * पीएसएफ: पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / fungizone कॉकटेल (100x); ** / एमएल एकाग्रता 50 मिलीग्राम; *** होती है

    तालिका 4. Myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं (MPCs) के अलगाव और संस्कृति के लिए विभिन्न मीडिया तैयारी.

    <टीडी> 9.5
    प्लेट आकार खैर प्रति सेमी 2 घोला चढ़ाना वॉल्यूम
    6 अच्छी तरह से 1.5-2.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 1 मिलीलीटर
    24 अच्छी तरह से 1.9 1.5-2.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 250 μl
    48 अच्छी तरह से 0.95 1.5-2.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 150 μl
    96 0.32 1.5-2.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 50-100 μl

    सारणी 5. सेल संस्कृति प्लेट अच्छी तरह से आकार द्वारा अनुशंसित dilutions और चढ़ाना संस्करणों.

    जाति औसत # कोशिकाओं / छ ऊतक
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1783000
    Devario aequipinnatus 1797000
    ओंकोरहिन्चस mykiss 66,800

    . विभिन्न teleost प्रजातियों से मांसपेशियों के ऊतकों की 1 ग्राम से अलग myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं की 6 तालिका औसत संख्या: Danio rerio (zebrafish), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (विशाल Danio), और ओंकोरहिन्चस mykiss (रेनबो ट्राउट).

    जाति तापमान
    Danio / Devario एसपीपी. 26 - 28 डिग्री सेल्सियस
    ओंकोरहिन्चस / Salmo एसपीपी. 10 * - 18 डिग्री सेल्सियस
    Ambystoma mexicanum 18 डिग्री सेल्सियस
    * कम तापमान कम प्रसार दरों का समर्थन.

    मछली और उभयचर myogenic पी के लिए टेबल 7. सिफारिश ऊष्मायन तापमानरिकर्सर कोशिकाओं (MPCs).

    चित्रा 1
    चित्रा 1. MPCs (बाएँ तरफ) के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों, myoblasts (मध्य), और जल्दी myotubes (दाएँ) दो प्रजातियों, इंद्रधनुष (mykiss ओंकोरहिन्चस, ऊपर) और zebrafish (Danio rerio, नीचे) से.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. MPCs के प्रतिनिधि immunocytochemical धुंधला (ए, सी) और myotubes (बी, डी) अलग और विशाल Danio (Devario aequipinnatus, ऊपर) और रेनबो ट्राउट (ओंकोरहिन्चस mykiss, नीचे) से सुसंस्कृत. संस्कृति में, myoblasts MyoD1 + सकारात्मक (ए, सी) हैंव्यावसायिक रूप से उपलब्ध MyoD1 + एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना के रूप में (Danio: सी -20, सांताक्रूज जैव प्रौद्योगिकी, ट्राउट: NB100-80899, Novus बायोलॉजिकल). (:; ट्राउट एम 225: SC-567, सांताक्रूज जैव प्रौद्योगिकी से दोनों Danio) myoblasts के अंतर के रूप में इसके साथ ही, वे (बी, डी) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध myogenin एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना के रूप में myogenin व्यक्त करते हैं.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. संस्कृति में समय के साथ सेल प्रसार दर को मापने के BrdU का उपयोग प्रतिनिधि सेल प्रसार डेटा. विशाल Danio 67 से पृथक और सुसंस्कृत MPCs से प्राप्त आंकड़ों.

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    Discussion

    myogenic कार्यक्रम, जो भी जांच की प्रजातियों में, सबसे अधिक आसानी से एक में इन विट्रो प्रणाली के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है. दरअसल, अलगाव पर, myogenic अग्रदूत साबित कोशिकाओं (MPCs) मछली में या स्तनधारियों में myosatellite सेल (MSCs) आसानी प्रसार, सेल चक्र वापसी, और myoblasts के टर्मिनल भेदभाव और नवजात myotubes में उन myoblasts के विलय से जुड़े इस बेहद विनियमित प्रक्रिया दर्ज करें. (zebrafish 67 और इंद्रधनुष 69 के संभावित अपवाद के साथ) मछली प्रजातियों के ट्रांसजेनिक जीन संवाददाता उपभेदों की सामान्य कमी एमपीसी / एमएससी सक्रियण, प्रसार, और भेदभाव की विवो काम में है, तथा इस प्रकार यहां प्रस्तुत इन विट्रो प्रणाली में एक है मछली प्रजातियों में पढ़ाई के लिए आकर्षक मंच.

    एमपीसी / MSCs, कोई फर्क नहीं पड़ता प्रजातियों के सफल संस्कृति बाँझपन के लिए एक) कठोर ध्यान पर अत्यधिक निर्भर है; कंकाल की मांसपेशी टी बी) पूरी तरह से यांत्रिक हदबंदीमुद्दा; और ग) enzymatic पाचन के अनुकूलन. मांसपेशियों के ऊतकों अलगाव के प्रारंभिक चरणों के दौरान, बड़ी सावधानी के ऊतकों की आवश्यक मात्रा संदूषण के बिना excised है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. यह मछली (या किसी भी जानवरों उस बात के लिए उपयोग किया जा रहा) ठीक 70% इथेनॉल में और पर्याप्त समय के लिए कीटाणुरहित कर रहे हैं कि अत्यंत महत्व का है. हमारे हाथ में, 30 सेकंड सबसे अच्छा काम करता है; समय की छोटी अवधि के प्रदूषण और ऊतक अखंडता और सेल व्यवहार्यता की लंबी, हानि हो सकती है. इथेनॉल एक लगानेवाला के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, तो ध्यान विच्छेदन से पहले मछली निर्जलीकरण के लिए नहीं लिया जाना चाहिए. विच्छेदन एक लामिना का प्रवाह सेल संस्कृति हुड के बाहर किया जा सकता है; हालांकि, हम इस प्रक्रिया को किसी भी संभावित बैक्टीरियल या फंगल प्रदूषण को कम करने के लिए एक डाकू के भीतर किया जा सलाह देते हैं.

    ऊपर वर्णित यांत्रिक हदबंदी पहली बार में कच्चे तेल और / या कठिन लग सकता है, यह अलगाव की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है. दो बड़े स्केलपेल ब्लेड, खींचा अतीत(वीडियो प्रोटोकॉल में दिखाया गया है) एक रपट गति में एक दूसरे को, सबसे अच्छा परिणाम लाता है. समाप्त होने पर, homogenate की स्थिरता एक घोल या प्यूरी की है कि हो सकता है और आसानी से एक विस्तृत बोर सीरम वैज्ञानिक विंदुक (यानी 25 एमएल) के साथ एकत्र होना चाहिए. बस, बेहतर यांत्रिक हदबंदी, एमपीसी / एमएससी उपज और बेहतर परिणामस्वरूप संस्कृति अधिक है. गरीब हदबंदी enzymatic पाचन में बाधा और सेल उपज में कमी होगी. यह विचार करने के लिए आकर्षक हो सकता है, बिजली ऊतक homogenizers का उपयोग नाटकीय रूप से कम से कम मछली का MPCs साथ, इसके स्पष्ट सुविधा के बावजूद सेल व्यवहार्यता को कम करती है.

    सभी प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, ऊपर विस्तृत प्रक्रिया का अनुकूलन अक्सर आवश्यक है. यह कई danionin प्रजातियों के साथ हमारे काम में सच साबित कर दी है. हमारी प्रयोगशाला से परिणाम छोटे danionins (जैसे zebrafish) बड़ी प्रजाति करते हैं (जैसे सैनिक से कंकाल की मांसपेशी के ग्राम प्रति अधिक MPCs उपज संकेत मिलता है किचींटी या moustached Danio). Collagenase (0.3%) के एक उच्च एकाग्रता छोटी प्रजातियों से ऊतक के साथ प्रयोग किया जाता है लेकिन, यह केवल महसूस किया है. हमारे हाथ में, 0.2% की एकाग्रता (जैसे इंद्रधनुष, cutthroat ट्राउट [Oncorhynchusclarki], चिनूक सामन [Oncorhynchustschawytscha]) salmonid प्रजातियों के लिए उपयुक्त है, बड़ा danionins, Axolotl (Ambystomamexicanum) अंग और पूंछ, और यहां तक कि माउस कंकाल की मांसपेशी. इसी तरह, देखभाल उचित collagenase चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए. हमारे अनुभव में, प्रकार चतुर्थ collagenase ऐसी हड्डी और मांसपेशियों (यानी collagenase प्रकार द्वितीय) के रूप में 70 रेशेदार ऊतकों के लिए सिफारिश की collagenases की तुलना में कहीं बेहतर सेल व्यवहार्यता को बरकरार रखता है. पाचन एक कम समय अवधि में पूरा हो सकता है, कोशिका झिल्ली रिसेप्टर अखंडता की संभावना इन तैयारियों में वृद्धि हुई tryptic गतिविधि से समझौता किया है. Trypsin के लिए सम्मान के साथ, हमारी प्रयोगशाला हमेशा cruder trypsin तैयारी पुर उपयोग किया गया हैबल्कि उपलब्ध 'शुद्ध' की तैयारी के अलावा, सुअर का अग्न्याशय से ified. विभिन्न प्रजातियों के साथ हमारी संस्कृति की गतिविधियों में, हम अलग trypsin सांद्रता की छोटी लाभदायक प्रभाव देखा है.

    Trituration इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है. यह दोनों कंकाल की मांसपेशी की रेशेदार मैट्रिक्स dissociates और यह सब करते हुए मैन्युअल रूप myofibers के संरचनात्मक अखंडता में खलल न डालें tryptic पाचन के लिए सतह क्षेत्र बढ़ जाती है. Triturations प्रदर्शन, क्रमिक छोटे बोर pipettes और cannulas का उपयोग प्रवेशनी और सिरिंज सीधे का उपयोग करने से ज्यादा आसान है. एक प्रवेशनी और सिरिंज के साथ triturations को सीधे कार्यवाही खामियों को दूर cannulas और / या कोशिकाओं को लागू किया जा रहा है कि अत्यधिक दबाव में परिणाम कर सकते हैं. पर्याप्त विचूर्णन बिना tryptic पाचन लागू करने के लिए नाटकीय रूप से सेल पैदावार कम हो जाएगा.

    एक बार पृथक, संस्कृति प्रक्रिया काफी सरल है. आज तक का सबसे प्रकाशनों एक प्रोटोकॉल बुद्धि का उपयोग किया हैप्रसार और हमारे अपने सहित भेदभाव 33,71-75, दोनों के लिए एच वन मीडिया; हालांकि, कई फ्रांसीसी जांचकर्ताओं द्वारा लिखित और अधिक हाल के लेख अलग आधारित मीडिया और प्रसार और भेदभाव 33 के लिए सीरम सामग्री के साथ, एक दो मीडिया प्रोटोकॉल का वर्णन किया है. इस 'नए' प्रोटोकॉल और अधिक बारीकी से murine MSCs और myoblastsand की संस्कृति में इस्तेमाल उन लोगों के प्रारंभिक चरण myoblasts 33 के प्रसार को बढ़ाने के लिए प्रकट होता है और प्रसार और / या कोशिकाओं के भेदभाव को नियंत्रित करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है mimics. हालांकि, जीन अभिव्यक्ति का व्यापक लक्षण वर्णन के बिना, यह एक ऐसी 'प्रसार' मीडिया भी परंपरागत वन मीडिया पद्धति की तुलना में एक अधिक 'myoblast की तरह' राज्य का संरक्षण है कि क्या निष्कर्ष निकालना मुश्किल है. प्रतिलेख या प्रोटीन के स्तर पर, चाहे जीन अभिव्यक्ति का वर्णन पिछले प्रकाशनों, परंपरागत वन मीडिया प्रोटोकॉल 3 का उपयोग कर सूचना दी. वैकल्पिक रूप से, एक भी मीडिया (भेदभाव के प्रसार और 2% के लिए 10%: DMEM) के साथ साथ वर्णित भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के भिन्न सांद्रता के साथ पूरक हो सकता है.

    स्तनधारी सेल संस्कृति प्रणालियों को रोजगार जांचकर्ताओं इन कोशिकाओं की खेती के लिए कार्बन डाइऑक्साइड वातावरण का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक अलग दृष्टिकोण के लिए स्थलीय और जलीय गैस विनिमय कॉल के बीच आंतरिक मतभेद MPCs सहित, मछली या पानी सीमित urodele संवर्धन कोशिकाओं जब. और सोडियम बाइकार्बोनेट (3 NaHCO) -: यहाँ विस्तृत मीडिया एक piperazine व्युत्पन्न, zwitterionic कार्बनिक यौगिक [(2 Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic एसिड 4 HEPES] के साथ बफर रहे हैं. इस प्रकार, गैस इंजेक्शन के साथ एक मशीन की जरूरत है या इन कोशिकाओं की संस्कृति के लिए आवश्यक नहीं है. तापमान संस्कृति मछली की जरूरत है और urodele MPCs 18-26 डिग्री सेल्सियस के बीच सीमा के रूप में और अधिक महत्वपूर्ण बात, इस तरह के इन्क्यूबेटरों, बल्कि गर्मी से शांत करने की क्षमता के अधिकारी चाहिए इसके अलावा, salmonid MPCs सी हो सकता हैआगे एक ठंडा इनक्यूबेटर के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला, यदि आवश्यक हो तो कम तापमान पर ultured. (जैसा कि पहले भेजी अन्य जांचकर्ताओं है, के रूप में) इसके अतिरिक्त, हमने पाया है संस्कृति प्लेटों की कि सीलिंग सेलुलर व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए आवश्यक है. बस मानक प्रयोगशाला टेप के साथ संस्कृति ढक्कन और थाली के बीच इंटरफेस लपेटकर इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए पर्याप्त है.

    दोनों को प्राथमिक MPCs / MSCs / myoblasts के passaging स्तनधारी सेल संस्कृति में आम है, यह मछली कोशिकाओं के साथ, कम से कम (संस्कृति की सुबह लगभग 6) देर एमबी चरण से पहले संभव प्रतीत नहीं होता. इसलिए, प्रसार का समर्थन करने के लिए और प्रयोग के लक्ष्यों तक पहुंचने के लिए पर्याप्त कक्षों की उपयुक्त संख्या संस्कृति की दीक्षा पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए. कम से अधिक की उम्मीद सेल पैदावार प्राप्त कर रहे हैं इसके अलावा, अगर, यह कोशिकाओं का प्रचार करते हैं और बाद संतान replate करना संभव नहीं है. हम extracel पर निर्भरता बढ़ी तक इस विशेषता जिम्मेदार ठहराया हैमछली का एमपीसी / myoblasts के lular मैट्रिक्स (ईसीएम). वैकल्पिक रूप से, यह इस एक laminin सब्सट्रेट के विरूपण साक्ष्य और मछली का एमपीसी / MB प्रसार और भेदभाव न्यायसंगत लिए आवश्यक ईसीएम घटकों के इस प्रकार आगे अनुभवजन्य दृढ़ संकल्प है कि संभव है. हम अपने सहयोगियों के कई सफलतापूर्वक संस्कृति बुनियाद से देर चरण myoblasts (~ संस्कृति की सुबह 6) हटा दिया है और इन कोशिकाओं (जेएम Froehlich और पीआर Biga, व्यक्तिगत संचार) replated है कि ध्यान दें, लेकिन है.

    यह करने के लिए इसी तरह की इस प्रोटोकॉल या एक, आरटी पीसीआर 3,71-74,76-78, वेस्टर्न ब्लॉट 32,79-81, immunocytochemistry 32,33, प्रसार assays 32,33,59, जीन अभिकर्मक 15, morphometric से जुड़े प्रयोगों का प्रयोग विश्लेषण 78, विष विज्ञान स्क्रीनिंग 82, और chromatin immunoprecipitation (चिप, जेएम Froehlich और पीआर Biga, अप्रकाशित परिणाम) किया गया है. हालांकि, वी आई टी में अतिरिक्त के आगे वर्णनआरओ प्रोटोकॉल, Passaging और क्लोन प्रजनन शामिल अर्थात् उन, बहुत ज्यादा जरूरत है. दरअसल, रोजर्स प्रयोगशाला 15 इंद्रधनुष myoblasts के अभिकर्मक उत्प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलन द्वारा मछली का MPCs / myoblasts की संस्कृति में महत्वपूर्ण प्रगति की. इस पद्धति के आधार पर, आरएनएआई या कंकाल की मांसपेशी विशिष्ट लक्ष्यों की overexpression, teleost मछलियों की आजीवन विकास trajectories के साथ शामिल होने की माने विशेष रूप से उन लोगों को शामिल आगे की जांच संभव ही नहीं कर रहे हैं, लेकिन जल कृषि और जैव चिकित्सा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं विज्ञान की.

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    Disclosures

    खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

    Acknowledgments

    लेखकों डीआरएस को बहुत धन्यवाद देने की तरह होगा. छोटी मछलियों और उभयचर के लिए इस संस्कृति प्रोटोकॉल के विकास के आवेदन में अपने पेशेवर विशेषज्ञता के लिए जोसफ Planas और जुआन कैस्टिलो. धन्यवाद, कारण रहकर मैथ्यू, Delci क्रिस्टेनसेन, जाकारी बहेलिया, ब्रुक Franzen, नाथन Froehlich, Kira मार्शल चार्ज सहित कई मछली (प्रजातियों में और संख्या दोनों), से मांसपेशियों के ऊतकों के विच्छेदन और पृथक्करण के साथ सहायता प्रदान की है जो अनगिनत व्यक्तियों के लिए भी कर रहे हैं बेन मेयेर, एतान Remily, और Sinibaldo रोमेरो. इस काम के जीवविज्ञान शुरू हुआ धन के बर्मिंघम विभाग, protease अनुसंधान NIH अनुदान # 2P20 RR015566, एनआईएच NIAMS अनुदान # R03AR055350 के लिए केंद्र में अलबामा के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है, और PRB को NDSU अग्रिम आगे NSF अनुदान # एचआरडी-0811239 था. समर्थन भी UAB पोषण मोटापा अनुसंधान केंद्र पुरस्कार # P30DK056336, एनआईएच NIDDK द्वारा प्रदान की गई थी. इसकी सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और ऐसा जरूरी नहींएनआईएच की आधिकारिक दृश्य प्रतिनिधित्व करते हैं.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

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    References

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