Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Biology

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Summary

In-vitro-Kultur haben Systeme unerlässlich, um unser Verständnis von Wirbel myogenesis bewährt. Allerdings bleibt noch viel zu über Nicht-Säuger-Skelettmuskel-Entwicklung und das Wachstum gelernt werden, vor allem in den basalen Taxa. Eine effiziente und robuste Protokoll für die Isolierung der adulten Stammzellen aus diesem Gewebe, die myogene Vorläuferzellen (MPCs) und Erhaltung ihrer Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung in einer Primärkultur Einstellung ermöglicht die Identifizierung von konservierten und unterschiedliche Regulationsmechanismen ganzen die Wirbellinien.

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Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

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Abstract

Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten und Zeit mit dem Studium der myogenen Programm in vivo beteiligt, Primärkultursysteme von den ansässigen adulten Stammzellen der Skelettmuskulatur abgeleitet, die myogenen Vorläuferzellen (MPCs) sind unverzichtbar für unser Verständnis von Säugetierskelettmuskelentwicklung bewährt und Wachstum. Besonders bei den basalen Taxa der Wirbeltiere sind jedoch begrenzt, die molekularen Mechanismen, die die Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung von MPC Beschreibung von Daten. Von besonderem Interesse sind mögliche Mechanismen, die die Fähigkeit der basalen Wirbeltieren zu erheblichen postlarvalen Skelett myofiber Hyperplasie (dh Knochenfische) und die vollständige Regeneration nach Anhängsel Verlust (dh urodele Amphibien) zu unterziehen zugrunde liegen. Zusätzlich könnte die Verwendung von kultivierten Myoblasten im Verständnis der Regeneration und der Wiederholung des myogenen Programm und die Unterschiede zwischen ihnen zu unterstützen. ZuZu diesem Zweck beschreiben wir im Detail ein robustes und effizientes Protokoll (und Variationen) für die Isolierung und die Aufrechterhaltung MPCs und ihre Nachkommen, Myoblasten und Myotuben unreifen, in der Zellkultur als Plattform für das Verständnis der Evolution des myogenen Programm, beginnend mit dem mehr basalen Wirbeltieren. Aufbauend auf der Modellorganismus Status der Zebrafisch (Danio rerio) berichten wir über die Anwendung dieses Protokolls auf kleine Fische des Cyprinidengewässer Clade Danioninae. Parallel kann dieses Protokoll genutzt werden, um eine breitere vergleichenden Ansatz durch Isolierung MPCs aus dem mexikanischen Axolotl (Ambystomamexicanum) und sogar Labornagern zu verwirklichen. Dieses Protokoll wird heute weitgehend in Studium myogenesis in mehreren Fischarten, darunter die Regenbogenforelle, Lachs und Meerbrassen 4.1 verwendet.

Introduction

Erhebliche Verständnis von Säugetier myogenesis hat durch die Wiederholung dieses Prozesses sowohl in primären Maus (Mus musculus) Myoblasten-Kulturen und die gut beschriebene Maus-abgeleitete Zelllinie gewonnen wurden, C2C12 5. Beginnend in den 1950er Jahren 6, diese Kulturen haben viel Fortschritt im Verständnis der murinemyogenic Programm durch die Erweiterung, myogenesis in anderen Wirbeltieren führte, und. Zusätzlich einzelnen Zelle myofiber Explantat Techniken haben das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Satelliten Muskelfasern 7-9 für Untersuchungen myogenesis besonders attraktiv aufgrund der kurzen Zeit von Vorläuferzelle 10 zu unterscheiden, der relativen Leichtigkeit der Transfektion für RNAi erhöht. Zellkulturen 11-14, transgene 15,16 und Überexpression Studien 14,17,18, in-vitro-Expansion, gefolgt von In-vivo-Transplantation 18-20, und sogar Layoutarison myogener Vorläuferzellen und deren Regel Agenten in Taxa 21,22. Während die Unterschiede aufgrund der künstlichen Umgebung des Kultursystems beschrieben worden, 5,23, haben diese in vitro-Systemen nachgewiesen unverzichtbar für unser Dissektion der komplizierten Programm für die Bildung von vielkernigen sein, mononukleären terminal differenzierten myofibersfrom proliferative Vorläuferzellen bekannt myosatellite Zellen (MSC) unter den Säugetieren.

Außerhalb der Klasse Mammalia jedoch die Erhaltung und / oder Divergenz der Mechanismen, die myogenesis schlecht verstanden werden, vor allem wegen der Schwierigkeiten bei der Kultivierung von myogenen Vorläuferzellen (MPCs) und Myoblasten aus verschiedenen Taxa. Tatsächlich haben die Grund Myoblastenkulturen nur in drei Vögel 24-26, ein Reptil 27, ein paar Amphibien 28-30, und einige Fische 1,3,4,31-33 beschrieben. Kontinuierliche myogenen Zelllinien aus veandere als Nagetiere 34-36 rtebrates sind noch seltener, nur mit dem Nicht-Säuger myogenen Zelllinie, die aus der japanischen Wachtel (Cortunix japonica) abgeleitet, QM7 37. Trotz vieler Versuche der Verewigung, bleibt ein Knochenfisch myogenen Zelllinie schwer zu fassen und ein Protokoll für die effiziente Transfektion dieser Zellen wurde erst in diesem Jahr 15 veröffentlicht. So sind klar und gut optimierte Protokolle für die Kultivierung von primären Myoblasten MPCs und aus einer Vielzahl von Wirbeltieren sehr notwendig, um nicht nur weiter unser Wissen über die Evolution des myogenen Programm zu erweitern, aber die Macht der vergleichenden Physiologie beschäftigen, um Durchbrüche in machen die Behandlung von menschlichen Skelettmuskelerkrankungen und Störungen.

Während die Literatur enthält viele Berichte von MPC / Myoblasten Isolierung 38-49, ist es üblich, dass Autoren, die Protokolle für solche Trennungen in kurzen, oft unvollständig, Formate zu beschreiben. Ferner sind die lehrreichsten Protokolle RepoRTED haben für Mäuse von 50 bis 53 entwickelt, und einige von diesen setzen auf Antikörperselektion 54,55 oder Fluoreszenz Transgene 56,57, so dass diese Protokolle unbrauchbar oder unpraktisch durch Muskel Biologen genutzt innersten Nicht-Nagetieren. Mit wenig über piscine-, Amphibien-, Reptilien-und Myogenese eine detaillierte und gründliche Protokoll, mit audiovisuellen Führung und mit nachgewiesener Effizienz in entfernt verwandten Arten beschrieben, wäre sehr hilfreich, um das Feld ein.

Zuerst von Powell und Kollegen im Jahr 1989 58 beschrieben, wurde das folgende Protokoll ursprünglich entwickelt, um PLM und Myoblasten aus Salmonidfischen (nämlich, Regenbogenforelle, Oncorhynchus mykiss und Atlantischer Lachs, Salmo salar) und einigen größeren Karpfenfischen (dh Goldfisch, Carassiusauratusauratus) zu isolieren . Im Jahr 2000 Fauconneau Paboeuf und optimiert eine primäre Myoblastenkultur für Regenbogenforelle 59 und minoroptimizations made dieses Protokoll nutzbar in mehrere kleinere Elritzen der Danioninae Clade (Zebrafisch, Danio rerio, und riesige Danio, Devario aequipinnatus) 32 aufgrund der vielen genetischen Werkzeuge für die Zebrafisch-Arbeit zur Verfügung und damit seine nahen Verwandten. Knochenfische sind attraktiv für Organismen Studie aufgrund ihrer unterschiedlichen Wachstumsstrategie (zumindest in den meisten Arten). Große Salmoniden, wie die meisten Fische, unbestimmt wachsen, mit Wachstumspotenzial durch eine Asymptote bei Fälligkeit uneingeschränkten, auch im Alter 60-62. Anders als Zebrafisch, große danionins wie der riesige Danio 63 und Schnurrbart danio Display Wachstum typisch für Knochenfische Potenziale, die ihre direkten Gegenüberstellung zu einer idealen Plattform für das Verständnis, ob MPC Zellschicksal Wahl spielt eine Rolle im Skelettmuskel-Hypertrophie-Hyperplasie gegenüber.

Ebenso haben wir gezeigt, dass dieses Protokoll mit Mäusen und axolotls verwendet werden, wobei relativ hohe Zellausbeute und VIABility Indizes. Urodele Salamander, wie der mexikanische Axolotl (Ambystomamexicanum), besitzen die bemerkenswerte Fähigkeit, Gewebe zu regenerieren, einschließlich ganzer Gliedmaßen und Schwänze 64-66. Diese Eigenschaft macht diese Amphibien interessante Modelle der Skelettmuskelabbau und Alterung. Mit dem unten beschriebenen Protokoll kann ein ähnlicher Ansatz durchgeführt werden, wie es in vielen Fischarten durchgeführt worden, die eine noch breitere Vergleichs Rahmen für solche Studien. Wie viele wirklich Vergleichs Biologen schätzen, die am sinnvollsten Fortschritte in der Grundlagen der Biologie und translationale Biomedizin ist möglich, wenn Daten innerhalb der breitesten Spektrum analysiert (hier der gesamte Wirbel Linie) werden.

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Protocol

Ethikerklärung: Alle hier beschriebenen Experimenten mit Wirbeltieren wurde vorab von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Alabama in Birmingham zugelassen und steht im Einklang mit den Richtlinien des Amtes für Labortierschutz, National Institutes of Health der USA gegründet Department of Health and Human Services.

1. Vorbereitung für Kultur

  1. Bereiten Sie das Basismedium wie folgt: 9 mM NaHCO 3 (1,51 g pro 2 l), 20 mM HEPES (9,53 g pro 2 l) in DMEM (13,48 g / L; 26.96 g pro 2 l).
    1. Bestimmen Sie, pH-Wert und anpassen, um 7.40 mit HCl oder NaOH.
    2. Bestimmen Sie Osmolalität und passen auf ~ 300 mOsm mit NaCl (falls erforderlich).
    3. Filter mit sterilisieren (2) 1 L Vakuum-Sterilisationssysteme und bei 4 ° C vor Licht für bis zu 2-3 Monate geschützt.
      HINWEIS: In den Tabellen 1 und 2, für vollständige Reagenz, Werkzeuge, Verbrauchsrungen, und Geräteinformationen.
  2. Vorbereitung Poly-L-Lysin-behandelten Platten durch Auflösen von 5 mg γ-bestrahlt Poly-L-Lysin (> 300.000 MW) in 50 ml ultrareinem Wasser steril. Vorsichtig mischen durch Umdrehen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, die Gewährleistung der vollen Auflösung von Lysin Polymere.
  3. Pipettieren Sie die notwendige Menge an Poly-L-Lysin-Lösung in jede Vertiefung, nach Plattentyp (Tabelle 3). Lassen Platten in Laminarströmungshaube 5 Minuten stehen.
  4. Dann entfernen Poly-L-Lysin-Lösung und zweimal mit sterilem Wasser. Lassen Platten an der Luft trocknen in Laminarströmungshaube für 20 Minuten.
  5. Erhalten 1 mg Laminin (Engelbreth-Holm-Swarm-Ursprung) und lösen in 50 ml Basismedium in einer Endkonzentration von 20 ug / ml. Gelten Laminin Lösung von Poly-L-Lysin-behandelten Zellkulturplatten mit 2 &mgr; g / cm 2. (Siehe Tabelle 3 für verschiedene Plattengrößen)
  6. Schwenken Sie die Lösung zu sorgen full und Berichterstattung. Dichtungsplatten mit Labor Band und in Brutschrank für 24 Stunden. Der Inkubator sollte auf geeignete Temperatur für verwendeten Arten (siehe Tabelle 7) eingestellt werden und keine zusätzlichen Gase müssen mit Inkubator aufgenommen werden.
    HINWEIS: Laminin erlaubt sein muss, um Platten für 24 Stunden vor der Aussaat Zellen anhaften werden. Nichtbeachtung führt zu schlechter bis gar keine Zellhaftung führen.
  7. Bereiten Medien, wie in Tabelle 4 beschrieben. Komplette Medien wird am besten vorbereitet den Tag der Nutzung.
  8. In Vorbereitung für die Gewebe-Isolation, montieren Sie die folgenden Punkte und Autoklaven: 300-500 ml-Becherglas (s); Glaspetrischalen; Skalpell handhabt; Pinzette (fein und grob); Dissektion Schere; und mehrere Blatt wasserabweisend Autoklaven Papier.
    HINWEIS: Für jede Person, die Unterstützung bei der Dissektion Prozess, (2) Skalpellgriffe, (1) Zange (Typ je nach persönlicher Vorliebe), (1) Sektion Schere, und (5-10) Blatt wasserabweisend Autoklaven Papier sindausreichend.
  9. Zusätzlich zu den obigen Artikel autoklaviert, zusammen 70% Ethanol, eine Gewichtsbilanz, sterile 50 ml konische Röhrchen (Anzahl ist abhängig von der Größe der Kultur) und Eis.

2. Gewebedissektion

  1. Bevor Sie beginnen, zu gewährleisten, dass eine ausreichende Fischbestand vorhanden ist.
    HINWEIS: Das Alter der Fische verwendet werden, ist von entscheidender Bedeutung. Während Fisch von zwei verschiedenen Arten können mit vergleichbaren Gewichts zu sein, wird ein jüngerer Fische einer Art mehr als eine ältere MPC Fische einer anderen Art zu besitzen. Als allgemeine Regel gilt, jünger Fisch, vor allem bei der Arbeit mit Salmoniden, sind am besten. Für danionins, können die Fische so alt wie 1 Jahr optimal genutzt werden, während Salmoniden Alter von 4-6 Monaten oder jünger (bis 15 g) sind optimal.
  2. Für jede 5 g Gewebe seziert werden aliquote 25 ml Isolationsmedium in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen.
  3. Wiegen, Plattenmasse und Anzahl der Röhre (n). Zeigen Röhrchen auf Eis.
  4. Euthanize 2-3 Fischzu einer Zeit, durch Eintauchen in> 300 mg / l Natriumbicarbonat gepufferte Tricainmethansulfonat. Lassen Kiemendeckel Bewegung für> 5 minuten aufhören und dann tauchen Fische in 70% Ethanol (in den sterilen Becher enthalten) für 30 Sekunden.
  5. Fisch entfernen aus 70% Ethanol und setzen auf wasserabweisend Autoklaven Papier. Direkt hinter dem Kiemendeckel, mit einem Skalpell, um einen oberflächlichen, flachen Schnitt zu machen. Entfernen die Schuppen und die Haut durch Ergreifen der Haut an der oben genannten Einschnitt und ziehen in Richtung Schwanz des Fisches.
  6. Nach Hautentfernung, die Verbrauchsteuern epaxialen, schnell glykolytische "weißen" Muskel der Fisch von beiden Seiten (die langsame oxidativen 'rot' Muskel in der Nähe der Seitenlinie befindet vermeiden) und in Isolationsmedium. Entsorgen Sie den Rest der Fische durch Institution erforderlich.
    HINWEIS: Während es durchaus zu Kultur MPCs aus rotem Muskel Ursprung ist möglich, fast jede Publikation mit Knochenfisch Mittelmeer-Partnerländern eingesetzt hat Zellen aus der epaxialen m isoliertyotome.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,6, bis eine ausreichende Menge des Muskels erhalten. Während der Präparation, sicherzustellen, dass gepoolte Muskelgewebe bleibt auf Eis, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

3. Mechanische Dissoziation

  1. Gießen einer Röhre von 25 ml / 5 g Muskelgewebe in eine Glaspetrischale. Mit zwei Skalpellgriffe in Kombination mit Aufbau # 10 Skalpellklingen, zerkleinern Gewebe zu einem Brei oder Püree Konsistenz. Ein "Hin-und-her"-Bewegung ziehen die Skalpellklingen aneinander vorbei am besten funktioniert.
    HINWEIS: Während Gewebe Homogenisatoren kann angemessen erscheinen, wird die Anzahl der lebensfähigen Zellen drastisch reduziert werden, wenn nicht abgeschafft.
  2. Mit einer 25 ml serologische Pipette und serologische Pipette, entfernen Sie die aufgeschlämmt Gewebe und in der Original konischen Rohr ersetzen.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.2, bis alle Gewebe in alle Röhrchen wurde mechanisch dissoziiert.
  4. Zentrifuge Gewebe für 5 Minuten bei 300 × g und 10 ° C.
  5. Folldurch Zentrifugation, entsorgen Sie die 25 ml Medium Überstand mit einer Pipette 25 ml serologische, Vakuumsauger, oder durch sorgfältige Dekantieren.
  6. 25 ml Waschmedium in jedes Röhrchen, resuspendieren Gewebe und wie oben zentrifugieren.
  7. Zweimal waschen mit Waschmedium, das Entfernen der Überstand jeder Zeit.

4. Enzymatische Dissoziation

  1. Während Schritt 3.4, bereiten Collagenase-Lösung durch die Kombination von 0,22 g Typ IV Kollagenase und 44 ml Basismedium (oder ausreichender Menge mit 0,11 g/0.22 ml).
  2. Rühren in einem Becherglas für 10-15 Minuten bei 4 ° C. Filter sterilisieren mit einer 50 ml-Spritze und ein 0,45 &mgr; m-Spritzenfilter.
    HINWEIS: Mehr als ein Spritzenfilter erforderlich sein, abhängig von der Kollagenase-Zubereitung. Collagenase aus anderen als Worthington Biochemical Anbieter wurden, stellt heute mehr Schwierigkeiten bei der Filtration. Collagenase wird verwendet, um Peptidbindungen in Collagen, die das Endomysium bilden distanzieren. DiesVerdauung wird diese Schutzbarriere der Muskelfasern zu entfernen.
  3. Für jedes g Muskelgewebe, resuspendieren Gewebe in einem 0,2% Collagenase-Lösung. Für 5 g Muskelgewebe, 10 ml Kollagenase-Lösung und 15 ml Basismedium.
  4. In 10 ul PSF pro ml Collagenase-Lösung / Basismedium (zB 250 ul bis 25 ml). Sicherzustellen, dass die Gewebe gut suspendiert, da dies die Effizienz der enzymatischen Verdauung beeinflussen.
  5. Inkubieren Muskelgewebe in Kollagenase für 60 Minuten bei 18 ° C unter leichtem Schütteln. Je nach dem Grad der mechanischen Dissoziation und Arten kann Collagenaseverdau bis 90 Minuten verlängert werden, obwohl dies die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinflussen.
  6. Nach Collagenaseverdau, Zentrifuge konische Röhrchen bei 300 xg für 5 Minuten bei 12 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren Gewebe in 25 ml Waschmedium.
  7. Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min bei 126; C Wiederholen Sie mit Waschmedium ein zweites Mal.
  8. Gewebe nach dem Waschen zweimal resuspendieren Muskelgewebe in 25 ml Waschmedium und Verreiben mit 10 ml serologische Pipette bis das Gewebe / Homogenisat Medium gelangt in die und aus der Pipette mit relativer Leichtigkeit. 10.05 Triturationen ist in der Regel ausreichend.
    1. Wiederholen Sie mit einer 5 ml Pipette serologischen und dann einer 16-Gauge-Metallkanüle mit einer Spritze befestigt.
  9. Zentrifuge konische Röhrchen bei 300 xg für 5 Minuten bei 12 ° C. Überstand dekantieren.
  10. Während der über 5-minütige Zentrifugation, bereiten Sie die Trypsinverdau Lösung durch die Kombination von 0,25 g Trypsin mit 5 ml Basismedium.
  11. Rühren bei 4 º C für 10-15 Minuten und Filter sterilisieren mit einer 20 ml-Spritze und 0,45 &mgr; m-Spritzenfilter.
  12. Abrufen konische Röhrchen und 100 ul Trypsin-Lösung und 4,9 ml der Dissoziation Medium für jeden 1 g Muskelgewebe zu jedem Rohr. Für example, 500 &mgr; l Trypsin-Lösung und 24,5 ml Dissoziation Medium 5 g von Muskelgewebe.
    HINWEIS: Trypsin ist eine Serinprotease, die myogene Vorläuferzellen aus der Basalmembran getrennt werden.
  13. Resuspendieren Gewebe in der Trypsin / Dissoziation Medium auch. Inkubation für 20 Minuten bei 18 ° C.
  14. Nach der ersten Inkubation Trypsin, Zentrifuge konische Röhrchen bei 300 x g für 1 min bei 12 ° C.
  15. Trypsin zu neutralisieren, indem die Überstände mit Trennmedium in einer Konzentration von 1 Volumen Überstand in 4 Volumina Isolationsmedium. Lagerung bei 4 ° C in der zweiten Trypsin Verdauung.
  16. Um die verbleibende Pellet von Gewebe, wiederholen Sie die Schritte von 4,12 bis 4,15, die Kombination der Überstand nach Schritt 4.15 mit dem Überstand / Isolationsmedium von der ersten Trypsin Verdauung.
  17. Alternativ: Die Collagenase und Trypsin-Verdaus kann kombiniert werden, um die Zellausbeute zu maximieren. <ol>
  18. Um dies zu tun, verreiben die Kollagenase verdaut unter Verwendung einer Metallkanüle (6 in der Länge und 16 Gauge am besten) bis zu einer 20 ml-Spritze, bis das Homogenat leicht durch die Kanüle hindurchgeht.
  19. Zu dem Homogenat, 500 &mgr; l Trypsin-Lösung (hergestellt in Schritt 4.10) und Inkubation bei 18 ° C für 20 Minuten.
  20. Nach der Inkubation Zentrifuge konische Röhrchen bei 300 × g für 1 Minute bei 12 ° C.
  21. Trypsin zu neutralisieren, indem die Überstände mit Trennmedium in einer Konzentration von 1 Volumen Überstand in 4 Volumina Isolationsmedium.
  22. Lagerung bei 4 ° C in der zweiten Trypsin Verdauung.
  23. Fahren Sie mit Schritt 4.18 als mit dem Standard-Protokoll.
  • Dispense die endgültige Überstand / Isolationsmedium Mischung in 50 ml konische Röhrchen und bei 300 g zentrifugiert für 10 Minuten bei 12 ° C.
  • Entfernen Sie die Überstände kümmert sich die Zelle nicht zu störenPellets. Pipette 2 ml Vollmedium in jedes Röhrchen, Lösen jeder Zellpellet.
  • Kombinieren Sie Zellen in Vollmedium in einem 50 ml konischen Röhrchen suspendiert.
  • Spülen jedes Röhrchen mit 1 ml vollständigem Medium, kombiniert mit dem Pool von Zellen, die zuvor resuspendiert.
  • Man reibt mit einem Metall-Kanüle und Spritze 5-10 mal.
  • Filter Zellsuspension durch einen 100 um Zellsieb, Spülen mit Vollmedium.
  • Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb.
  • Ausreichend Vollmedium auf 50 ml und zentrifugiert bei 300 g für 10 Minuten bei 15 ° C.
  • 5. Zählen, Verdünnung und Seeding der Zellen

    1. Nach der letzten Zentrifugation in Schritt 4,25, entfernen Überstand durch vorsichtiges Dekantieren oder mit einer serologischen Pipette. Zellpellet in 5 ml Vollmedium.
    2. Mit Zellen vollständig suspendiert, entfernen 20 ul; Der Zellsuspension und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    3. In 5 ul Trypanblau-Farbstoff und 5 Minuten warten. Verwendung eines Hämocytometer, bestimmen die Anzahl der lebensfähigen Zellen.
    4. Bei Bestimmung, verdünnten Zellen auf die benötigte Konzentration. Teleost MPCs werden am besten bei 150.000-200.000 Zellen pro cm 2 ausgesät. Für einen Sechs-Well-Plattieren Strategie Verdünnen Zellen auf 1,5 x 10 6 bis 2,0 x 10 6 pro ml ausreichend unterstützt Proliferation und Differenzierung.
    5. Abrufen von Poly-L-Lysin-Behandlung, Laminin-beschichteten Platten und Samenzellen. (Siehe Tabelle 5 für die Plattenspezifischen Verdünnungen und Überzug Bände.) HINWEIS: Tabelle 6 zeigt durchschnittliche Anzahl der Zellen isoliert pro Gramm Muskelgewebe aus verschiedenen Knochenfischarten isoliert. Regenbogenforelle (O. mykiss) weisen weniger MPCs pro Gramm Muskelgewebe als tun Zebrafisch (D. rerio) und wird dadurch benötigen mehr Fisch aus für die richtige Aussaat isolieren.
    6. Dichtungsplatten mit Labor Band und in Kühlbrutschrank bei der entsprechenden Temperatur. Mittelmeer-Partnerländern von allen hier aufgeführten (außer Mäuse) Spezies unter normalen atmosphärischen Bedingungen ohne Kohlendioxid (CO 2)-Supplementierung inkubiert werden. (Siehe Tabelle 7).
    7. Alternative: Einige Laboratorien haben ein Protokoll, das für die Mittelmeer-Partnerländern, um so an die Kultur Substrate für 40 Minuten halten ruft angenommen.
      1. Dann spülen Platten mit Waschmedien, alle lose befestigt und nicht-adhärenten Zellen zu entfernen. Warnung: Dieser Schritt ist sehr wichtig, um "nicht-spezifische" Haftung von anderen Zellen (z. B. Fibroblasten) zu dem Kultursubstrate zu vermeiden.
      2. Fügen komplette Medien-und Ortszellen im Brutschrank und pflegen, wie unten beschrieben.

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    Representative Results

    Vierundzwanzig Stunden nach der Aussaat, myogenen Vorläuferzellen (MPCs) sollte sichtbar für das Laminin Substrat befestigt werden (siehe Abbildungen 1a und 1d). Nach der Aussaat, Zellen (MPCs) trifft eine spindelartige Form, bezeichnend für diesen Zelltyp (Abbildung 1) und sind MyoD1 + (Abbildung 2). In Danio Arten, erscheinen MPCs kompakter mit kleineren bipolaren Prozesse als tun MPCs von Oncorhynchus und Salmo-Arten. Doch im Laufe der vier Tage Kultur, Mittelmeer-Partnerländern von allen Arten piscine prüften Vorschlag ähnliche Morphologien und sehen deutlich, wie Myoblasten (1b und 1e). Komplette Medien sollten entfernt werden, und MPL sollte zweimal mit Waschmedium gewaschen werden. Myofibroblasten können myogene Kulturen kontaminieren und sind leicht von PLM / Myoblasten durch ihre sternförmige Morphologie (gegenüber der Spindel Form der Myoblasten). Waschen der Platten stark improves die Entfernung solcher Fibroblasten.

    In den hier beschriebenen (siehe Tabelle 7) Arten, täglich produzieren Medienwechsel die besten Ergebnisse. MPC und Nachkommen (Myoblasten und Myotuben entstehenden) sollte ein-oder zweimal vor der Zugabe von frischem komplette Medien gewaschen werden. Alternativ können Medienwechsel zu jedem anderen Tag reduziert, nachdem die Zellen die endgültige Myoblasten-Stufe (ca. Tag 4 der Kultur) erreicht werden. Myotuben sollte innerhalb von 2-3 Tagen zu bilden (Abb. 1c und 1f) und Myogenin + (Abbildung 2), insbesondere wenn in Differenzierungsmedium kultiviert (siehe unten). Während Zeiträume von Wochen bis zu Monaten wurden in verschiedenen Säugetierarten berichtet, haben piscine MPCs und Myoblasten nicht angezeigt, solche Zeiträume zu tolerieren. Zellen vermehren sich in den ersten sechs Tagen Kultur (Fig. 3), mit anschließender Differenzierung zwischen den Tagen 7 und 9-11 der Kultur. Danach Zellen Seneszenz oder einpoptose.

    Die myogene Natur der Mittelmeerpartnerländer und ihre Nachkommen isoliert mit diesem Protokoll wurde festgestellt, 3,32,33 basierend auf Genexpression. (Im Vergleich zu Systemen, die primären murinen Myoblasten oder C2C12), mit einem raschen Anstieg festgestellt, wie sich die Zellen während der Tage 6-9 der Kultur bilden unreifen Myotuben Gegensatz zu Säugerkultursystemen, ist die Proliferation von Myoblasten MPCs und Nachkommen in den ersten Tagen der Kultur relativ niedrig Danio in 32 Arten. Berichte von Regenbogenforellen haben eine Differenzierungsmedium genutzt (common in Säuger Myoblastenkulturen, aber nicht in piscine Systeme erforderlich) und zeigen, dass die Proliferation Indizes verringern, wie mit myotube Bildung 33 erwartet. In unseren Händen können die resultierenden Myotuben in Kultur für bis zu 9-11 Tage (Danio Arten) verbleiben und 11-13 Tage (Oncorhynchus-Arten), bevor zellulären Seneszenz oder Apoptose auftritt.

    Reagens Company (Preferred v. Alternative) Katalognummer (Preferred v. Alternative) Menge pro Kultur
    γ-bestrahlt, Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (High Glucose) Sigma-Aldrich (CellGro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Natriumbikarbonat (NaHCO 3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1,51 g
    HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9,53 g
    Antibiotika / Antimykotika Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 ml
    Gentamicin-Sulfat Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 ml
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 ml
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 ml
    Collagenase (Typ IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0,44 g
    Trypsin (aus Pankreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g

    Tabelle 1. Detaillierte Reagenzienliste mit den bevorzugten Hersteller und Katalognummer.

    Verbrauchsgut Werkzeuge Ausrüstung
    Zellkulturplatten Zange (Coarse) Serologische Pipetten
    Sterile 50 ml konische Röhrchen Zange (Fein) pH-Meter
    Labor-Tape Skalpellgriffe Chilling Incubator (EchoTherm)
    0,2 um Vakuum-Sterilisationssysteme Skalpellklingen (# 10, # 11) Laminar Flow Hood
    Wasserabweisende Autoklav Papier Chirurgische Schere Vakuum-Manifold
    Serologische Pipetten Glaspetrischalen Microosmolality Meter
    12-16 G Kanülen mit Luer-Locks

    Tabelle 2. Verbrauchsmaterialien, Werkzeuge und Geräte für die Zellkultur benötigt.

    Plattengröße cm 2 pro Well Poly-L-Lysin * Laminin **
    6 gut 9.5 1,6 ml 1
    24 gut 1.9 0,32 0,2
    48 gut 0,95 0,16 0,1
    96-Well- 0,32 0,06 0,03
    * 0,1 mg / ml Konzentration ** 0,020 mg / ml-Konzentration

    Tabelle 3. Optimierte Mengen zum Beschichten von Zellkulturplatten mit Poly-L-Lysin und Laminin.

    Reagens Isolation Wash Dissoziation Vollständig
    Basismedium 419,25 ml 395,40 ml 297.00 ml 178.00 ml
    PSF * 5,00 ml 4.00 ml 3,00 ml 2,00 ml
    Gentamicin-Sulfat ** 0,75 ml 0,60 ml - -
    Spenderpferdeserum 75.00 ml - - -
    Fetal Bovine Serum *** - - - 20.00 ml
    * PSF: Penicillin / Streptomycin / Fungizon-Cocktail (100x); ** 50 mg / ml Konzentration; Gekennzeichnet ***

    Tabelle 4. Unterschiedliche Medien Vorbereitungen für die Isolierung und Kultivierung von myogenen Vorläuferzellen (MPCs).

    <td> 9,5
    Plattengröße cm 2 pro Well Verdünnung Plating Volume
    6 gut 1,5 - 2,0 x 10 6 Zellen / ml 1 ml
    24 gut 1.9 1,5 - 2,0 x 10 6 Zellen / ml 250 ul
    48 gut 0,95 1,5 - 2,0 x 10 6 Zellen / ml 150 ul
    96-Well- 0,32 1,5 - 2,0 x 10 6 Zellen / ml 50-100 ul

    Tabelle 5. Empfohlene Verdünnungen und Volumina Beschichtung von Zellkulturplatte und Größe.

    Spezies Durchschnittliche # Zellen / g Gewebe
    Danio rerio 6400000
    Danio dangila 1783000
    Devario aequipinnatus 1797000
    Oncorhynchus mykiss 66.800

    . Tabelle 6 Durchschnittliche Anzahl der myogenen Vorläuferzellen aus 1 Gramm Muskelgewebe aus verschiedenen Knochenfischarten isoliert: Danio rerio (Zebrafisch), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (riesige Danio) und Oncorhynchus mykiss (Regenbogenforelle).

    Spezies Temperatur
    Danio / Devario spp. 26 bis 28 ° C
    Oncorhynchus / Salmo spp. * 10 - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum 18 ° C
    * Niedrigere Temperaturen niedriger Proliferationsraten unterstützt.

    Tabelle 7. Inkubation Empfohlene Temperaturen für piscine und Amphibien myogenic precursor Zellen (MPC).

    Figur 1
    Abbildung 1. Vertreter Hellfeld-Bilder der Mittelmeerpartnerländer (ganz links), Myoblasten (Mitte), und frühen Myotuben (ganz rechts) von zwei Arten, Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss, oben) und Zebrafisch (Danio rerio, unten).

    Figur 2
    Abbildung 2. Vertreter immunzytochemische Färbung von MPC (a, c) und Myotuben (b, d) isoliert und von riesigen Danio (Devario aequipinnatus, oben) und Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss, unten) kultiviert. In der Kultur sind Myoblasten MyoD1 + positiv (a, c)als mit kommerziell erhältlichen Antikörpern sichtbar MyoD1 + (Danio: C-20, Santa Cruz Biotechnology; Forelle: NB100-80899, Novus Biologicals). Darüber, wie Myoblasten zu differenzieren, drücken sie Myogenin (b, d) visualisiert mit kommerziell erhältlichen Myogenin-Antikörper (Danio: M-225; Forelle: SC-567, beide von Santa Cruz Biotechnology).

    Fig. 3
    Abbildung 3. Vertreter Zellproliferation Daten mit BrdU Zellproliferationsraten im Laufe der Zeit in Kultur zu messen. Daten aus PLM isoliert und kultiviert von riesigen Danio 67 erhalten.

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    Discussion

    Myogenen Programms in welcher suchten Spezies, kann am einfachsten durch eine in-vitro-System untersucht werden. In der Tat, nach der Isolierung, myogenen Vorläuferzellen (MPCs) in Fisch oder myosatellite Zellen (MSC) in Säugetieren geben Sie einfach dieses stark regulierten Prozess, der die Proliferation, Zellzyklus-Entzug, und die terminale Differenzierung von Myoblasten und die Fusion von Myoblasten in diesen entstehenden Myotuben. Der allgemeine Mangel an transgenen Reportergens Stämme piscine Arten (mit der möglichen Ausnahme des Zebrafisches 67 und Regenbogenforelle 69) zwingt in vivo Werk MPC / MSC-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung, und somit die in vitro hier vorgestellte System ist attraktive Plattform für Studien in Fischarten.

    Erfolgreiche Kultur der MPC / MSC, keine Angelegenheit der Arten, ist stark abhängig von a) strenge Aufmerksamkeit auf Sterilität; b) gründliche mechanische Dissoziation der Skelettmuskulatur tThema; und c) die Optimierung der enzymatischen Verdauung. Während der Anfangsschritte des Muskelgewebes Isolierung muss darauf geachtet werden, dass die erforderliche Menge an Gewebe ohne Verunreinigung ausgeschnitten. Es ist von größter Bedeutung, dass die Fische (oder genutzt keine Tiere, für diese Angelegenheit) ordnungsgemäß in 70% Ethanol und für eine ausreichende Zeit desinfiziert. In unseren Händen, funktioniert am besten 30 Sekunden; kürzere Zeiträume können Verunreinigungen und mehr, Verlust der Gewebeintegrität und Lebensfähigkeit der Zellen führen. Ethanol kann als Fixiermittel verwendet werden, so muss darauf geachtet werden, den Fisch vor Dissektion zu dehydratisieren. Präparation außerhalb einer laminaren Strömung Zellkulturhaube durchgeführt werden; empfehlen wir jedoch, dass dieser Prozess innerhalb einer Haube getan, um mögliche Bakterien-oder Pilzbefall zu minimieren.

    Während die oben beschriebenen mechanischen Dissoziation mag zunächst grob und / oder mühsam ist es kritisch für die Isolierungsverfahren. Zwei große Skalpellklingen, zog vorbeimiteinander in einer gleitenden Bewegung (wie in der Videoprotokoll gezeigt), die besten Ergebnisse. Einmal abgeschlossen, sollte die Konsistenz des Homogenats der einer Aufschlämmung oder Püree sein und leicht mit einem großen Innendurchmesser serologischen Pipette (dh 25 ml) gesammelt. Einfach, desto besser die mechanische Dissoziation, desto höher die MPC / MSC Ausbeute und desto besser die resultierenden Kultur. Schlechte Dissoziation enzymatische Verdauung behindern und verringern Zellausbeute. Zwar mag es verlockend zu berücksichtigen, die Verwendung von elektrischen Gewebe Homogenisatoren drastisch senkt die Lebensfähigkeit der Zellen trotz seiner offensichtlichen Komfort, zumindest bei piscine MPCs.

    Wie bei allen Protokollen, ist eine Optimierung des Verfahrens oben beschrieben häufig notwendig. Dies ist wahr in unserer Arbeit mit mehreren danionin Arten bewährt. Ergebnisse aus unserem Labor zeigen, dass kleinere danionins (zB der Zebrafisch) zu erhalten mehr MPCs pro Gramm Skelettmuskel als größere Arten (zB giAmeise oder moustached danio). Dies wird jedoch nur erreicht werden, wenn eine höhere Konzentration von Kollagenase (0,3%) mit kleineren Arten von Gewebe verwendet. In unseren Händen, eine Konzentration von 0,2% ist für Salmoniden geeigneten (zB Regenbogenforelle, Forelle Halsabschneider [Oncorhynchusclarki], Chinook Lachs [Oncorhynchustschawytscha]), die größeren danionins, Axolotl (Ambystomamexicanum) Gliedmaßen und Schwanz, und sogar Maus Skelettmuskulatur. Ebenso muss darauf geachtet werden, um die entsprechende Kollagenase aus. Nach unserer Erfahrung bewahrt Typ IV-Kollagenase Lebensfähigkeit der Zellen weit besser als Collagenasen für faserige Gewebe wie Knochen und Muskeln (dh Collagenase Typ II) 70 empfohlen. , Zellmembranrezeptor-Integrität wird wahrscheinlich durch eine erhöhte Trypsin-Aktivität in diesen Zubereitungen beeinträchtigt, während der Verdauung kann vollständiger sein in einem kürzeren Zeitraum. In Bezug auf Trypsin, hat unser Labor immer die gröberen Trypsin Vorbereitung pur verwendetified aus Schweinepankreas, anstatt die "reinere" Zubereitungen zur Verfügung. In unserer Kultur Aktivitäten mit verschiedenen Arten, haben wir wenig positive Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen Trypsin bemerkt.

    Verreiben ist für dieses Protokoll. Es sowohl dissoziiert die Fasermatrix des Skelettmuskels und erhöht die Fläche für tryptische Verdauung alle während die strukturelle Integrität der Muskelfasern manuell zu stören. Bei der Durchführung der Triturationen nacheinander mit kleineren Bohrung Pipetten und Kanülen ist viel einfacher als mit der Kanüle und Spritze auf Anhieb. Ausgehend direkt an Verreibungen mit einer Kanüle und Spritze angeschlossen Kanülen und / oder übermäßiger Druck, der auf Zellen führen. Anwenden Trypsinverdauung ohne ausreichende Verreiben wird drastisch reduzieren Zellausbeuten.

    Einmal isoliert, ist die Kultur-Prozess ganz einfach. Die meisten Publikationen bis heute ein Protokoll Witz genutzth ein Medien sowohl für die Proliferation und Differenzierung 33,71-75, einschließlich unserer eigenen; jedoch haben neuere Artikel von mehreren Französisch geschrieben Ermittler einen zwei Medien Protokoll beschrieben, mit separaten basierte Medien und Serumgehalt für die Proliferation und Differenzierung 33. Diese "neueren" Protokoll stärker imitiert die in der Kultur von Maus-MSCs und myoblastsand verwendet wird, um die Proliferation von frühen Stadium Myoblasten 33 zu verbessern und besser geeignet, um die Proliferation und / oder Differenzierung von Zellen kontrollieren. , Ohne umfassende Charakterisierung der Genexpression, ist es schwer zu erkennen, ob eine solche "Proliferation" Medien schont auch eine "Myoblasten-like 'Zustand als der traditionellen Medien-Methodik. Frühere Publikationen Genexpression beschreiben, sei es auf dem Transkript-oder Proteinebene, berichtete nach der traditionellen Medien ein Protokoll 3. Alternativ kann eine einzelne Medien (10% für die Proliferation und Differenzierung von 2%: hier beschriebenen DMEM) mit unterschiedlichen Konzentrationen von fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt werden.

    Während die Ermittler beschäftigt Säugerzellkultursysteme können mit Kohlendioxid Atmosphären für die Kultivierung dieser Zellen akklimatisiert werden, die immanenten Unterschiede zwischen Land-und Wassergasaustausch Anruf für einen anderen Ansatz bei der Kultivierung piscine oder wasser beschränkt urodele Zellen, einschließlich der Mittelmeerpartnerländer. Und Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3) -: Medien hier beschrieben sind, mit einem Piperazin abgeleitete, zwitterionischen organischen Verbindung [(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure 4 HEPES] gepuffert. Somit wird ein Inkubator mit Gaseinspritzung nicht erforderlich oder für die Kultur dieser Zellen erforderlich. Noch wichtiger ist, sollten solche Gründerzentren die Möglichkeit, anstatt Wärme kühlen besitzen, da die Temperaturen zu Kultur piscine benötigt und urodele MPC liegen zwischen 18-26 ° C. Ferner kann Salmoniden MPCs c seinbei niedrigeren Temperaturen, wenn nötig ultured, ferner die die Notwendigkeit für eine Kühlbrutschrank. Zusätzlich haben wir gefunden, (wie andere Forscher, wie zuvor übermittelt), daß der Dichtkulturplatten ist erforderlich, um die zelluläre Lebensfähigkeit beizubehalten. Wickeln einfach die Schnittstelle zwischen dem Deckel und Kulturplatte mit Standardlabor Band ausreichend ist, um dieses Ziel zu erreichen.

    Während Passagieren beider primären MPC / MSC / Myoblasten ist üblich in Säugetierzellkultur, erscheint es nicht mit piscine Zellen, zumindest vor dem Ende Mb Stufe (rund 6. Tag der Kultur) möglich sein. Daher muß die entsprechende Anzahl von Zellen ausreicht, um die Proliferation zu unterstützen und die Ziele des Experiments erreicht bei der Initiierung der Kultur beimpft werden. Ferner wird, wenn weniger als erwartet Zellausbeuten erhalten werden, ist es nicht möglich, Zellen ausbreiten und dann Ausstrich die Nachkommen später. Wir haben diese Eigenschaft der erhöhten Abhängigkeit von der extrazugeschriebenzellulären Matrix (ECM) von piscine MPC / Myoblasten. Alternativ ist es möglich, dass dies ein Artefakt der Laminin-Substrat und damit weitere empirische Bestimmung von ECM-Komponenten für piscine MPC / Mb Proliferation und Differenzierung gerechtfertigt ist erforderlich. Wir beachten Sie jedoch, dass einige unserer Mitarbeiter haben erfolgreich Spätstadium Myoblasten (~ 6. Tag der Kultur) aus dem Kultursubstrat entfernt und replattiert diese Zellen (JM Froehlich und PR Biga, persönliche Mitteilung).

    Über dieses Protokoll oder ein ähnlich es, Experimente mit RT-PCR 3,71-74,76-78, Western Blot 32,79-81, Immunzytochemie 32,33, Proliferationsassays 32,33,59, Gen-Transfektion 15, morphometrische Analyse 78, Toxikologie-Screening 82 und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP; JM Froehlich und PR Biga, unveröffentlichte Ergebnisse) durchgeführt wurde. Allerdings sind weitere Beschreibungen von zusätzlichen in vitro-Protokolle, nämlich solche, die Passagieren und klonalen Vermehrung, sind dringend erforderlich. Tatsächlich ist die Rodgers Labor 15 erhebliche Fortschritte in der Kultur der Mittelmeerpartnerländer piscine / Myoblasten durch die Optimierung eines Protokolls zur Induktion Transfektion von Regenbogenforellen Myoblasten. Basierend auf dieser Methode, sind weitere Untersuchungen mit RNAi oder Überexpression der Skelettmuskulatur spezifische Ziele, besonders die postuliert, dass mit den lebenslangen Wachstumskurven von Knochenfischen beteiligt werden, nicht nur möglich, sondern kann zu erheblichen Fortschritten in der Aquakultur und der biomedizinischen Bereichen führen der Wissenschaft.

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    Disclosures

    Es gibt nichts zu offenbaren.

    Acknowledgments

    Die Autoren bedanken sich bei vielen Dank an Dr. verlängern. Josep Planas und Juan Castillo für ihre berufliche Expertise in der Entwicklung und Anwendung dieser Kultur-Protokoll, um kleine Fische und Amphibien. Dank gebührt auch den zahllosen Menschen, die unermüdlich mit der Dissektion und Dissoziation von Muskelgewebe von vielen Fischen (sowohl in Art und Zahl), darunter Matthew Lade, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall unterstützt haben, Ben Meyer, Ethan Remily und Sinibaldo Romero. Diese Arbeit wurde von der University of Alabama in Birmingham Fachbereich Biologie Start-up-Fonds, Zentrum für Protease Forschung NIH # 2P20 RR015566, NIH Grants NIAMS # R03AR055350 NDSU Advance-FORWARD NSF Zuschuss # HRD-0811239 zu PRB unterstützt und. Unterstützung wurde auch von der UAB Nutrition Obesity Research Center Auszeichnung # P30DK056336, NIH NIDDK vorgesehen. Sein Inhalt sind allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingtdie offizielle Meinung des NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

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