Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

Biology

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Summary

A cultura in vitro sistemas provaram indispensável para a nossa compreensão de myogenesis vertebrados. No entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre o desenvolvimento do músculo esquelético não Mamífero e crescimento, particularmente na taxa basal. De uma forma eficiente e robusta para isolar as células estaminais de adultos deste tecido, as células precursoras miogénicos (PPM), e manter a sua auto-renovação, a proliferação e diferenciação de uma configuração de cultura primária permite a identificação de mecanismos reguladores conservadas e divergentes ao longo as linhagens de vertebrados.

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Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

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Abstract

Devido à dificuldade e tempo inerente envolvido com o estudo do programa miogênica in vivo, sistemas de cultura primários derivados das células-tronco adultas residentes do músculo esquelético, as células precursoras miogênicas (PPM), têm se mostrado indispensável para a nossa compreensão do desenvolvimento do músculo esquelético de mamíferos e crescimento. Particularmente entre a taxa basal de vertebrados, no entanto, os dados são limitados descrevendo os mecanismos moleculares que controlam a auto-renovação, a proliferação e diferenciação de PPM. De particular interesse são potenciais mecanismos que estão na base da capacidade de vertebrados basais a sofrer considerável postlarval esquelético myofiber hiperplasia (ou seja, peixes teleósteos) e regeneração completa após perda apêndice (ou seja Urodelos anfíbios). Além disso, o uso de mioblastos em cultura pode ajudar na compreensão da regeneração e da recapitulação do programa miogénica e as diferenças entre eles. Paraeste fim, que descrevem em pormenor um protocolo robusto e eficiente (e variações neles) para isolar e manter PPM e sua descendência, mioblastos e de miotubos imaturas, em cultura celular, como uma plataforma para a compreensão da evolução do programa miogénica, começando com o mais vertebrados basais. Capitalizando sobre o status organismo modelo do peixe-zebra (Danio rerio), relatamos a aplicação deste protocolo a pequenos peixes do clado ciprinídeo Danioninae. Em paralelo, este protocolo pode ser utilizado para realizar uma abordagem comparativa mais ampla, isolando PPM do axolotl mexicano (Ambystomamexicanum) e até mesmo roedores de laboratório. Este protocolo é agora amplamente utilizados no estudo myogenesis em várias espécies de peixes, incluindo a truta arco-íris, salmão e besugo 1-4.

Introduction

Compreensão considerável de myogenesis mamíferos foi obtida através da recapitulação do processo em ambos os rato primária (Mus musculus) culturas de mioblastos ea linha celular derivada de rato bem descrita, C2C12 5. Começando nos anos 1950, 6, estas culturas conduziram a muito avanço na compreensão do programa murinemyogenic e, por extensão, miogenese em outros vertebrados. Além disso, uma única célula técnicas myofiber explantes têm aumentado a compreensão das interações entre células satélites e fibras musculares em torno 7-9. Culturas celulares são particularmente atraentes para as investigações de miogênese, devido ao curto espaço de tempo a partir de precursor de célula diferenciada 10, relativa facilidade de transfecção de RNAi 11-14, transgênico 15,16 e superexpressão estudos 14,17,18, a expansão in vitro seguida de transplante in vivo 18-20, e até mesmo uma miniaturaarison de células precursoras miogênicas e seus agentes reguladores em todo taxa 21,22. Embora as diferenças devidas ao meio artificial do sistema de cultura têm sido descritos 5,23, estes sistemas in vitro têm provado ser indispensável para a dissecção do programa que regula a formação de complexo de multinucleadas, myofibersfrom terminalmente diferenciada mononucleated células progenitoras proliferativas conhecidos como myosatellite células (MSCs) entre os mamíferos.

Fora da classe Mammalia, no entanto, a conservação e / ou divergência de mecanismos que controlam myogenesis são mal compreendidos, em grande parte devido à dificuldade em cultura de células precursoras miogênicas (PPM) e mioblastos de vários táxons. De facto, as culturas de mioblastos primários apenas tenham sido descritas em três aves 24-26, um réptil 27, algumas anfíbios 28-30, e alguns peixes 1,3,4,31-33. Linhagens de células miogênicas contínuos de vediferentes roedores 34-36 rtebrates são ainda mais raros, com a única linha de não-mamíferos miogênica célula sendo derivado de codornas japonesas (Cortunix japonica), QM7 37. Apesar de muitas tentativas de imortalização, uma linha celular miogênica teleósteos permanece indefinida e um protocolo para a transfecção eficiente dessas células só foi publicado este ano 15. Assim, os protocolos claros e bem otimizadas para cultivar PPM primárias e mioblastos de uma variedade de vertebrados são muito necessárias, não só para expandir ainda mais o nosso conhecimento sobre a evolução do programa miogênica, mas para empregar o poder da fisiologia comparativa para fazer descobertas em o tratamento de doenças do músculo esquelético e distúrbios humanos.

Enquanto a literatura contém muitos relatos de isolamento MPC / mioblastos 38-49, é comum que os autores descrevem os protocolos para esses isolamentos em breve, muitas vezes incompletos, formatos. Além disso, os protocolos mais instrutivas reported foram desenvolvidos para ratos 50-53, e algumas delas contam com seleção anticorpo 54,55 ou transgenes fluorescência 56,57, tornando estes protocolos inutilizável ou íntimos espécie não roedora impraticáveis ​​utilizadas por biólogos musculares. Com pouco sabe sobre piscine, anfíbio, réptil e miogênese, um protocolo detalhado e completo, descrito com orientação audiovisual e com eficiência demonstrada em espécies distantemente relacionadas, seria mais útil para o campo.

Descrita pela primeira vez por Powell e seus colegas em 1989 58, o seguinte protocolo foi inicialmente desenvolvido para isolar PPM e mioblastos de peixes salmonídeos (ou seja, a truta arco-íris, Oncorhynchus mykiss, e salmão do Atlântico, Salmo salar) e alguns ciprinídeos maiores (ou seja, peixinho, Carassiusauratusauratus) . Em 2000, Fauconneau e Paboeuf otimizado uma cultura de mioblastos primário para truta arco-íris 59, e minoroptimizations made que o protocolo utilizável em vários peixinhos menores do clade Danioninae (peixe-zebra, Danio rerio, e Danio gigante, Devario aequipinnatus) 32, devido às muitas ferramentas genéticas disponíveis para o trabalho do peixe-zebra e, portanto, seus parentes próximos. Peixes teleósteos são organismos atrativos para estudo devido à sua estratégia de crescimento divergentes (pelo menos na maioria das espécies). Grandes salmonídeos, como a maioria dos peixes, crescer indeterminadamente, com potencial de crescimento desenfreado por uma assíntota na maturidade, mesmo em idade avançada 60-62. Ao contrário de peixe-zebra, grandes danionins como o Danio gigante 63 e potenciais de crescimento exibição Danio moustached típicos de peixes teleósteos, tornando a sua justaposição direta uma plataforma ideal para a compreensão se escolha o destino da célula MPC desempenha um papel na hiperplasia do músculo esquelético contra hipertrofia.

Da mesma forma, temos demonstrado que este protocolo pode ser utilizado com ratos e axolotls, com rendimento relativamente alto celular e VIABíndices ILIDADE. Salamandras Urodelos, como a axolotl mexicano (Ambystomamexicanum), possuem a notável capacidade de regenerar tecidos, incluindo membros e caudas 64-66 inteiras. Esta característica faz com que esses anfíbios modelos interessantes de perda de massa muscular esquelética e envelhecimento. Usando o protocolo descrito abaixo, uma abordagem similar pode ser efectuada, como foi feito em muitas espécies de peixes, fornecendo um contexto comparativo ainda maior de tais estudos. Como muitos biólogos verdadeiramente apreciam comparativos, os avanços mais significativos em biologia básica e translacional biomedicina pode ser feita quando os dados são analisados ​​dentro do mais amplo espectro (aqui, toda a linhagem dos vertebrados).

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Protocol

Declaração de Ética: Todos experimentação envolvendo animais vertebrados descritos aqui foi previamente aprovado pelo Comitê da Universidade de Alabama em Birmingham Institutional Animal Care e Use e é consistente com as diretrizes estabelecidas pela Secretaria de Laboratório Animal Welfare, National Institutes of Health de os EUA Departamento de Saúde e Serviços Humanos.

1. Preparação para a Cultura

  1. Preparar o meio de base da seguinte forma: 9 mM de NaHCO3 (1,51 g por 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g por 2 L), em DMEM (13,48 g / L; 26,96 g por 2 L).
    1. Determinar o pH e ajustar a 7,40 com HCl ou NaOH.
    2. Determinar e ajustar a osmolalidade ~ 300 mOsm com NaCl (se necessário).
    3. Filtro esterilizar utilizando (2) sistemas de esterilização de 1 L de vácuo e armazenar a 4 ° C protegidos da luz durante até 2-3 meses.
      NOTA: Ver Tabelas 1 e 2 para o reagente completo, ferramentas, consumveis, e informações sobre o equipamento.
  2. Prepara-L-lisina-tratados poli placas por dissolução de 5 mg de irradiadas-γ poli-L-lisina (> 300.000 mw) em 50 ml de água ultrapura esterilizada. Misturar suavemente por inversão durante 10 minutos à temperatura ambiente, assegurar a dissolução completa dos polímeros de lisina.
  3. Pipetar a quantidade necessária de poli-L-lisina solução em cada poço, de acordo com o tipo de placa (Tabela 3). Permitir que as placas de suporte em fluxo laminar capuz durante 5 minutos.
  4. Em seguida, remova-poli-L-lisina solução e lavar duas vezes com água estéril. Permitir placas para o ar seco em fluxo laminar capô por 20 minutos.
  5. Obter 1 mg de laminina (origem Engelbreth-Holm-Swarm) e dissolver em 50 ml de meio de base para uma concentração final de 20 ug / ml. Aplicar a solução de laminina para placas de cultura celular de poli-L-lisina-tratados em 2 mg / cm 2. (Ver Tabela 3 para diferentes tamanhos de placas)
  6. Agite suavemente a solução para garantir full bem cobertura. Selar as placas com fita laboratório e colocar em incubadora por 24 horas. A incubadora deve ser definido como a temperatura apropriada para a espécie a ser utilizadas (ver Tabela 7), e sem gases adicionais necessitam de ser adicionados à incubadora.
    NOTA: A laminina devem ser autorizados a aderir às placas por 24 horas antes de semear células. Não fazer isso irá resultar em pobre para não adesão celular.
  7. Prepare mídia, como descrito na Tabela 4. Mídia completa é melhor preparada no dia de uso.
  8. Em preparação para o isolamento de tecido, montar os seguintes itens e autoclave: 300-500 ml copo (s); pratos de vidro de Petri; bisturi alças; fórceps (fina e grossa); tesoura de dissecção; e várias folhas de papel autoclave repelente de água.
    NOTA: Para cada pessoa ajudar com o processo de dissecação, (2) alças de bisturi, (1) pinças (tipo dependendo da preferência pessoal), (1) tesoura de dissecção, e (5-10) folhas de papel autoclave repelente de água sãosuficiente.
  9. Além dos artigos acima autoclavados, montar etanol a 70%, um equilíbrio do peso, 50 ml de tubos cónicos estéreis (número depende do tamanho da cultura), e gelo.

2. Dissecção de tecido

  1. Antes de começar, certifique-se de que um estoque suficiente de peixes.
    NOTA: A idade do peixe a ser utilizado é de importância crítica. Enquanto os peixes de duas espécies diferentes podem ser de pesos semelhantes, um peixe mais jovem de uma espécie irá possuir mais do que um peixe PPM mais velho de outra espécie. Como regra geral, os peixes mais novos, especialmente quando se trabalha com salmonídeos, são as melhores. Para danionins, peixe tão antiga como um ano pode ser utilizada de forma otimizada, enquanto salmonídeos de idade 4-6 meses ou mais jovens (até 15 g) são ideais.
  2. Para cada 5 g de tecido a ser dissecado, alíquota de 25 ml do meio de isolamento para um estéril tubo de 50 ml.
  3. Pesar, massa registro e número do tubo (s). Colocar os tubos em gelo.
  4. Eutanásia 2-3 peixede cada vez, por imersão em> 300 mg / L de sódio tamponada com bicarbonato de tricaina metanossulfonato. Permitir o movimento do opérculo cessar durante> 5 minutos e, em seguida, mergulhe peixe em etanol a 70% (contida nos copos estéreis) durante 30 segundos.
  5. Retire o peixe a partir de etanol 70% e colocar em autoclave papel repelente de água. Diretamente atrás do opérculo, usar um bisturi para fazer uma incisão superficial, superficial. Remover as escamas da pele e agarrando a pele através da incisão acima mencionado e puxar para cauda de peixe.
  6. Após a remoção da pele, extirpar o epaxial, fast-glicolítico muscular 'branco' do peixe de ambos os lados (evitando o músculo 'vermelho' slow-oxidativo localizado perto da linha lateral) e coloque no meio de isolamento. Descartar o restante dos peixes tal como exigido pela instituição.
    Células Embora seja perfeitamente possível PPM cultura provenientes de músculo vermelho, quase todas as publicações usando teleósteos PPM tem utilizado isolados do epaxial m: NOTAyotome.
  7. Repita os passos 2,4-2,6 até uma quantidade suficiente de músculo é obtido. Durante a dissecção, garantir que o tecido do músculo permanece reunido em gelo para manter a viabilidade celular.

3. Dissociação mecânica

  1. Despeje um tubo de 25 ml / 5 g de tecido muscular em uma placa de Petri de vidro. Usando dois bisturi lida com anexados # 10 lâminas de bisturi, tecido picada até obter uma consistência de chorume ou purê. Um movimento "vai-e-vem" de puxar as lâminas de bisturi após se funciona melhor.
    Nota: Enquanto homogeneizadores tecido pode parecer adequado, o número de células viáveis ​​serão drasticamente reduzidos, se não abolido.
  2. Usando uma pipeta de 25 ml sorológica e pipeta sorológica, remover o tecido empapado e substituir no tubo cônico de origem.
  3. Repita os passos 3,1-3,2 até todos os tecidos em todos os tubos foi dissociado mecanicamente.
  4. Tecido Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg e 10 ° C.
  5. Folldevido a centrifugação, descartar os 25 ml de sobrenadante de mídia com uma pipeta 25 ml sorológico, aspirador a vácuo, ou por decantação cuidadosa.
  6. Adicionar 25 ml de meio de lavagem a cada tubo de tecido, ressuspender e recentrifuge como acima.
  7. Lavar duas vezes com meio de lavagem, remoção do sobrenadante de cada vez.

4. Dissociação enzimática

  1. Durante o passo 3.4, preparar uma solução de colagenase por combinação de 0,22 g de colagenase do tipo IV e de 44 ml de meio de base (ou quantidade suficiente para g/0.22 0,11 ml).
  2. Misture um copo por 10-15 minutos a 4 ° C. Filtro esterilizar com uma seringa de 50 ml e um filtro de seringa de 0,45 um.
    NOTA: Mais do que um filtro de seringa pode ser necessário, dependendo da preparação da colagenase. Colagenase obtidos a partir de diferentes Worthington Biochemical fornecedores representa mais dificuldade durante a filtração. A colagenase é utilizado para dissociar ligações peptídicas em colagénio que constituem o endomísio. Estedigestão vai remover essa barreira protetora das fibras musculares.
  3. Por cada grama de tecido muscular, ressuspender o tecido numa solução de colagenase a 0,2%. Para se 5 g de tecido muscular, adicionar 10 ml de solução de colagenase e de 15 ml de meio de base.
  4. Adicionar 10 ul de PSF por ml de solução / meio base de colagenase (por exemplo, 250 ul para 25 ml). Certifique-se de que o tecido é bem suspenso, pois isso irá afetar a eficiência da digestão enzimática.
  5. Incubar o tecido muscular em colagenase durante 60 minutos a 18 ° C com oscilação suave. Dependendo do grau de dissociação mecânica e espécies, a digestão de colagenase pode ser prolongado até 90 minutos, embora isto possa afectar a viabilidade celular.
  6. Seguindo os tubos de digestão com colagenase, cónicos de centrifugação a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o tecido em 25 ml de meio de lavagem.
  7. Recentrifuge a 300 x g durante 5 minutos a 126; C. Repita com o meio de lavagem uma segunda vez.
  8. Depois de lavar duas vezes o tecido, o tecido do músculo ressuspender em 25 ml de meio de lavagem e tritura-se com uma pipeta 10 ml serológico até o tecido / homogenato médio passa dentro e para fora da pipeta com relativa facilidade. 5-10 triturações é geralmente suficiente.
    1. Repetir com uma pipeta de 5 mL e, em seguida, serológico cânula de metal de 16 gauge ligada a uma seringa.
  9. Tubos de centrífuga cónicos a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Decantar o sobrenadante.
  10. Durante a centrifugação acima de 5 minutos, a preparação da solução de digestão de tripsina por combinação de 0,25 g de tripsina com 5 ml de meio de base.
  11. Agita-se a 4 ° C durante 10-15 minutos e filtra-se esterilizar com uma seringa de 20 ml e de 0,45 um filtro de seringa.
  12. Recuperar tubos cónicos e adicionar 100 ul de solução de tripsina e 4,9 ml de meio de dissociação para cada 1 g de tecido muscular de cada tubo. Para example, adicionar 500 mL de solução de tripsina e de 24,5 ml de meio de dissociação de 5 g de tecido muscular.
    NOTA: A tripsina é uma serina-protease que irá separar as células precursoras a partir de miogénicas a lâmina basal.
  13. Tecido Ressuspender no tripsina / dissociação médio. Incubar durante 20 minutos a 18 ° C.
  14. Após a primeira incubação com tripsina, tubos cónicos de centrifugação a 300 xg durante 1 min a 12 ° C.
  15. Neutraliza-se a tripsina pela combinação dos sobrenadantes com meio de isolamento, a uma concentração de 1 volume de sobrenadante para 4 volumes de meio de isolamento. Armazenar a 4 ° C durante a segunda digestão com tripsina.
  16. Para o sedimento restante do tecido, repetir os passos 4,12-4,15, combinando o sobrenadante seguinte passo 4.15 com o meio sobrenadante / isolamento a partir da primeira digestão de tripsina.
  17. ALTERNATIVAMENTE: Os colagenase e tripsina digestões podem ser combinadas para optimizar os rendimentos de células. <ol>
  18. Para fazer isto, tritura-se o digerir com colagenase usando uma cânula de metal (6 de comprimento e calibre 16 funciona melhor) ligada a uma seringa de 20 ml, até o homogeneizado passa facilmente através da cânula.
  19. Para o homogeneizado, adicionar 500 mL de solução de tripsina (preparado no passo 4.10) e incubar a 18 ° C durante 20 minutos.
  20. Seguindo os tubos de incubação, cónicos de centrifugação a 300 xg durante 1 minuto, a 12 ° C.
  21. Neutraliza-se a tripsina pela combinação dos sobrenadantes com meio de isolamento, a uma concentração de 1 volume de sobrenadante para 4 volumes de meio de isolamento.
  22. Armazenar a 4 ° C durante a segunda digestão com tripsina.
  23. Prossiga com o passo 4.18 como com o protocolo padrão.
  • Dispensar a final sobrenadante / isolamento mistura meio em tubos de 50 ml cônico e centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 12 ° C.
  • Remover o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o celularpelotas. Pipeta de 2 ml de meio completo a cada tubo, dissolvendo cada sedimento celular.
  • Combinar as células suspensas em meio completo em um tubo de 50 ml.
  • Lavar cada tubo com 1 mL de meio completo, que combina com o conjunto de células ressuspensas anteriormente.
  • Tritura-se com uma cânula de metal e uma seringa de 5-10 vezes.
  • Filtrar a suspensão de células através de um coador de células de 100 mM, lavagem com meio completo.
  • Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 40 ^ m.
  • Adicionar meio completo suficiente para 50 ml e centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 15 ° C.
  • 5. Contar, diluição e Sementeira de Células

    1. Após a centrifugação final no passo 4.25, remover o sobrenadante por decantação cuidado ou com uma pipeta sorológica. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio completo.
    2. Com células totalmente ressuspenso, remover 20 ul, De suspensão de células e colocar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    3. Adicionar 5 mL de corante azul de Tripan e aguarde 5 minutos. Usando um hemocitómetro, determinar o número de células viáveis.
    4. Após a determinação, diluir as células com a concentração necessária. Teleósteos PPM são mais cultivadas a 150.000-200.000 células por cm 2. Para uma estratégia de seis cavidades, chapeamento, diluir as células a 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 por ml suporta a proliferação e diferenciação suficiente.
    5. Recuperar-L-lisina-tratados poli, placas revestidas de laminina e células de sementes. (Veja a Tabela 5 para as diluições específica de placa e os volumes de chapeamento.) NOTA: A Tabela 6 descreve o número médio de células isoladas por grama de tecido de músculo isolado a partir de várias espécies de teleósteos. Truta arco-íris (O. mykiss) apresentam menos PPM por grama de tecido muscular do que peixe-zebra (D. rerio) e, assim, exigem mais peixe para isolar a partir de semeadura adequada.
    6. Selar as placas com fita de laboratório e em lugar incubadora de refrigeração, à temperatura adequada. PPM de todas as espécies listadas aqui (exceto para os ratos) pode ser incubados sob condições atmosféricas normais, sem a suplementação de dióxido de carbono (CO 2). (Ver Tabela 7).
    7. Em alternativa: Alguns laboratórios têm adotado um protocolo que exige permitindo PPM a aderir ao substrato de cultura para 40 minutos.
      1. Em seguida, lave as placas com os meios de lavagem para remover as células frouxamente unidas e não aderentes. Aviso: Esta etapa é muito importante para evitar a adesão "não específica" de outras células (por exemplo, os fibroblastos) para os substratos cultura.
      2. Adicionar mídia completas e células lugar na incubadora e cuidar como detalhado abaixo.

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    Representative Results

    Vinte e quatro horas após a sementeira, as células precursoras miogénicos (PPM) deve ser visível ligado ao substrato de laminina (ver as figuras 1a e 1d). Após a sementeira, as células (PPM) adoptar uma forma fusiforme, indicativo desse tipo de células (Figura 1) e são MyoD1 + (Figura 2). Na espécie Danio, PPM parecem ser mais compacto, com processos bipolares menores do que os PPM de espécie Oncorhynchus e Salmo. No entanto, ao longo de quatro dias de cultura, PPM de todas as espécies examinadas piscine adotar morfologias semelhantes e olhar distintamente como mioblastos (Figuras 1b e 1e). Meio completo deve ser removido, e PPM deve ser lavada duas vezes com meio de lavagem. Miofibroblastos podem contaminar culturas miogênicos e são facilmente distinguíveis de PPM / mioblastos pela sua morfologia star-like (versus a forma do eixo da mioblastos). A lavagem das placas grandemente improves a remoção desses fibroblastos.

    Entre as espécies descritas aqui (ver Tabela 7), mudanças de meio por dia produz os melhores resultados. PPM e descendência (mioblastos e de miotubos nascentes) deve ser lavada uma ou duas vezes antes da adição de meio completo fresco. Alternativamente, mudanças de meio pode ser reduzido a cada dois dias, depois as células tenham atingido a fase de mioblastos definitivo (aproximadamente 4 dias de cultura). Miotubos deve formar-se dentro de 2-3 dias (Figura 1c e 1f) e ser Miogenina + (Figura 2), especialmente quando cultivados em meio de diferenciação (ver abaixo). Enquanto períodos de semanas a meses têm sido relatados em várias espécies de mamíferos, PPM piscine e mioblastos não parecem tolerar tais períodos de tempo. As células proliferam nos primeiros seis dias de cultivo (Figura 3), com a diferenciação posterior entre os dias 7 e 9-11 de cultura. Depois disso, as células de um ou senescênciapoptose.

    A natureza miogénica PPM e a sua progenitura isolado usando este protocolo foi determinada 3,32,33 com base na expressão do gene. Ao contrário dos sistemas de cultura de mamíferos, a proliferação de PPM e mioblastos progênie é relativamente baixo durante os dias iniciais da cultura (quando comparado a sistemas que utilizam mioblastos murinos primários ou C2C12), com aumentos rápidos detectados como as células formam miotubos imaturas durante os dias 6-9 de cultura em espécie Danio 32. Relatórios de truta arco-íris têm utilizado um meio de diferenciação (comum em culturas de mioblastos de mamíferos, mas não é obrigatório em sistemas de piscine) e indicam que os índices de proliferação diminuir como esperado com miotubo formação 33. Em nossas mãos, os miotubos resultantes podem permanecer em cultura por até 9-11 dias (espécie Danio) e 11-13 dias (espécie Oncorhynchus) antes de senescência celular ou apoptose ocorre.

    Reagente Company (preferencial v Suplente) Número de catálogo (Preferencial v Suplente) Quantidade por Cultura
    γ irradiados poli-L-lisina Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (glucose elevada) Sigma-Aldrich (Cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    A laminina BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1,51 g
    HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9,53 g
    Antibiótico / antimicótica Thermo Scientific (SIGMA-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 ml
    Sulfato de Gentamicina Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 ml
    Doadores Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 ml
    O soro fetal bovino Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 ml
    A colagenase (Tipo IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0,44 g
    Tripsina (de pâncreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g

    Tabela 1. Lista de reagentes detalhada com o fabricante preferido e número de catálogo.

    Consumíveis Ferramentas Equipamento
    As placas de cultura celular Fórceps (Grosso) Pipeta sorológica
    Estéreis de 50 ml tubos cônicos Fórceps (Fina) Medidor de pH
    Tape Laboratório Alças bisturi Chilling Incubator (Echotherm)
    0,2 mM de vácuo sistemas de esterilização Lâminas de bisturi (# 10, # 11) Capela de fluxo laminar
    Repelente de água Papel Autoclave Tesoura Cirúrgica Vacuum Manifold
    Pipettes sorológicos Pratos de vidro de Petri Microosmolality Medidor
    12-16 G cânulas com Luer Locks

    Tabela 2. Consumíveis, ferramentas e equipamentos necessários para a cultura de células.

    Tamanho da placa cm 2 por Bem Poli-L-lisina * A laminina **
    6 bem 9,5 1,6 ml 1
    24 bem 1.9 0,32 0,2
    48 bem 0.95 0,16 0,1
    96 bem 0,32 0.06 0,03
    * Concentração de 0,1 mg / ml ** Concentração de 0,020 mg / mL

    Tabela 3. Volumes optimizada para o revestimento de placas de cultura de células com poli-L-lisina e laminina.

    Reagente Isolamento Lavagem Dissociação Completo
    Base de Dados de Médio 419,25 ml 395,40 ml 297,00 ml 178,00 ml
    PSF * 5,00 ml 4,00 ml 3,00 ml 2,00 ml
    Sulfato de Gentamicina ** 0,75 ml 0,60 ml - -
    Doadores Equine Serum 75,00 ml - - -
    Soro fetal bovino *** - - - 20,00 ml
    * PSF: penicilina / estreptomicina / fungizona cocktail (100x); ** 50 mg / ml de concentração; Caracterizada ***

    Tabela 4. Diferentes preparações de mídia para isolamento e cultura de células precursoras miogênicas (PPM).

    <td> 9,5
    Tamanho da placa cm 2 por Bem Diluição Volume chapeamento
    6 bem 1,5 - 2,0 x 10 6 células / ml 1 ml
    24 bem 1.9 1,5 - 2,0 x 10 6 células / ml 250 ul
    48 bem 0.95 1,5 - 2,0 x 10 6 células / ml 150 ul
    96 bem 0,32 1,5 - 2,0 x 10 6 células / ml 50-100 mL

    Tabela 5. Diluições recomendados e volumes de galvanização por placa de cultura de células bem tamanho.

    Espécies # Células / g de tecido Média
    Danio rerio 6400000
    Danio dangila 1783000
    Devario aequipinnatus 1797000
    Oncorhynchus mykiss 66.800

    . Tabela 6 Número de células precursoras miogênicas isoladas de 1 grama de tecido muscular de várias espécies de teleósteos: Danio rerio (zebrafish), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (Danio gigante) e Oncorhynchus mykiss (truta arco-íris).

    Espécies Temperatura
    Danio / Devario spp. 26 - 28 ° C
    Oncorhynchus / Salmo spp. * 10 - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum 18 ° C
    * Temperaturas mais baixas suportam taxas de proliferação inferiores.

    Tabela 7. Recomendados temperaturas de incubação para piscine e anfíbio miogênica pcélulas recursor (PPM).

    Figura 1
    Figura 1. Representante imagens brilhantes de campo do PPM (mais à esquerda), mioblastos (meio), e no início dos miotubos (mais à direita) de duas espécies, truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss, em cima) e peixe-zebra (Danio rerio, em baixo).

    Figura 2
    Figura 2. Coloração imunocitoquímica Representante do PPM (a, c) e miotubos (b, d) isolado e cultivado a partir Danio gigante (Devario aequipinnatus, em cima) e truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss, em baixo). Na cultura, mioblastos são MyoD1 + positivo (a, c)como visualizado utilizando anticorpos MyoD1 + comercialmente disponíveis (Danio: C-20, Santa Cruz Biotechnology, truta: NB100-80899, Novus Biologicals). Além disso, como os mioblastos diferenciação, eles expressam miogenina (b, d) conforme visualizado utilizando anticorpos comercialmente disponíveis miogenina (Danio: M-225; truta: SC-567, ambos a partir de Santa Cruz Biotechnology).

    Figura 3
    Figura 3. Dados de proliferação celular BrdU representativa, utilizando para medir as taxas de proliferação celular ao longo do tempo em cultura. Os dados obtidos a partir de PPM isoladas e cultivadas a partir de Danio gigante 67.

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    Discussion

    O programa miogénica, em qualquer espécies examinadas, pode ser mais facilmente estudado por meio de um sistema in vitro. Com efeito, após o isolamento, as células precursoras miogénicos (PPM) em peixes ou células myosatellite (MSCs) em mamíferos facilmente entrar neste processo altamente regulado que envolve a proliferação, a retirada do ciclo celular, e a diferenciação terminal de mioblastos e a fusão dos mioblastos em miotubos nascentes. A falta generalizada de linhagens transgênicas repórter gene de espécies piscine (com a possível exceção do peixe-zebra 67 e truta arco-íris 69) constrange no trabalho vivo de ativação MPC / MSC, proliferação e diferenciação, e, portanto, o sistema in vitro aqui apresentada é um plataforma atraente para estudos em espécies de peixes.

    Cultura bem sucedida do MPC / MSCs, não importa a espécie, é altamente dependente a) atenção rigorosa à esterilidade; b) dissociação mecânica completa do músculo esquelético temissão; e c) a otimização da digestão enzimática. Durante as etapas iniciais de isolamento do tecido muscular, deve ser tomado muito cuidado para assegurar que a quantidade necessária de tecido é retirado, sem contaminação. É de extrema importância que os peixes (ou qualquer animal que está sendo utilizado, para que o assunto) estão devidamente desinfectados em etanol 70% e durante o tempo necessário. Em nossas mãos e 30 segundos funciona melhor; períodos de tempo mais curtos pode resultar em contaminação e já não, a perda de integridade do tecido e a viabilidade celular. O etanol pode ser usado como um fixador, de modo que deve ser tomado cuidado para não desidratar o peixe antes da dissecação. Dissecção pode ser feito no exterior de uma cultura de células de fluxo laminar capuz; no entanto, recomenda-se que este processo seja feito dentro de um capuz para minimizar qualquer potencial de contaminação bacteriana ou fúngica.

    Enquanto a dissociação mecânica descrito acima pode parecer em bruto e / ou tedioso em primeiro lugar, é crítico para o processo de isolamento. Dois grandes lâminas de bisturi, passando puxadoo outro num movimento de deslizamento (como mostrado no protocolo de vídeo), produz os melhores resultados. Uma vez terminado, a consistência do homogeneizado deve ser a de uma pasta ou purê, e facilmente coletadas com uma pipeta sorológica wide-bore (ou seja, 25 ml). Simplesmente, o melhor a dissociação mecânica, maior o MPC / rendimento MSC e o melhor da cultura resultante. Pobre dissociação irá dificultar a digestão enzimática e diminuir rendimento das células. Embora possa ser tentador considerar o uso de homogeneizadores tecido elétricos reduz drasticamente a viabilidade celular, apesar de sua óbvia conveniência, pelo menos com PPM piscine.

    Tal como acontece com todos os protocolos, a optimização do processo descrito acima, é muitas vezes necessário. Isto tem provado verdadeira em nosso trabalho com várias espécies danionin. Os resultados de nosso laboratório indicam que danionins menores (por exemplo, o peixe-zebra) render mais PPM por grama de músculo esquelético do que fazer espécies maiores (por exemplo, giDanio formiga ou de bigode). No entanto, isto só é realizado se uma maior concentração de colagenase (0,3%) é utilizado com o tecido a partir de espécies mais pequenas. Em nossas mãos, uma concentração de 0,2% é apropriado para espécies de salmonídeos (por exemplo, truta arco-íris; trutas [Oncorhynchusclarki], salmão Chinook [Oncorhynchustschawytscha]), os danionins maiores, axolotl (Ambystomamexicanum) membros e cauda, ​​e até mesmo do mouse músculo esquelético. Da mesma forma, deve-se tomar cuidado para selecionar a colagenase apropriado. Em nossa experiência, colagenase tipo IV preserva a viabilidade celular muito melhor do que colagenases recomendados para tecidos fibrosos, como ossos e músculos (ou seja, colagenase tipo II) 70. Enquanto a digestão pode ser mais completa num período de tempo mais curto, a integridade do receptor de membrana da célula é provável comprometida pelo aumento da actividade triptica nestas preparações. Com relação a tripsina, nosso laboratório sempre utilizou a mais crua tripsina preparação purcação do pâncreas de suínos, em vez de os preparativos dos mais puros 'disponíveis. Em nossas atividades de cultura com várias espécies, temos notado um pequeno efeito benéfico de concentrações variadas de tripsina.

    A trituração é fundamental para esse protocolo. É tanto dissocia a matriz fibrosa do músculo esquelético e aumenta a área de superfície para a digestão tríptica durante todo o tempo interromper manualmente a integridade estrutural das miofibras. Ao realizar as triturações, usando sucessivamente menores pipetas furo e cânulas é muito mais fácil do que usar a cânula e seringa imediatamente. Procedendo directamente para triturações com uma cânula de seringa e pode resultar em cânulas ligados e / ou uma pressão excessiva ser aplicada às células. Aplicando digestão tríptica sem trituração adequada irá reduzir drasticamente os rendimentos celulares.

    Uma vez isolado, o processo de cultura é bastante simples. A maioria das publicações até à data têm utilizado uma sagacidade protocoloh uma mídia tanto para proliferação e diferenciação 33,71-75, incluindo a nossa própria; Todavia, os artigos mais recentes escritos por vários investigadores franceses descreveram um protocolo de dois meios de comunicação, com a mídia e conteúdo baseados em separado do soro para a proliferação e diferenciação 33. Este protocolo 'mais recente de mais de perto imita as utilizadas na cultura de MSCs de murino e myoblastsand aparece para aumentar a proliferação de mioblastos em fase inicial 33 e pode ser mais apropriado para controlar a proliferação e / ou diferenciação de células. No entanto, sem uma ampla caracterização da expressão do gene, é difícil concluir se a mídia, "proliferação" também conserva um 'mioblastos-like' estado mais do que a metodologia de uma mídia tradicional. Publicações anteriores que descrevem a expressão do gene, seja em nível de proteína da transcrição ou, informou através do protocolo uma mídia tradicional 3. Em alternativa, um único meio (DMEM descrito aqui) pode ser suplementado com diferentes concentrações de soro fetal bovino (FBS): 10% de proliferação e de 2% para a diferenciação.

    Enquanto os pesquisadores que empregam sistemas de cultura de células de mamíferos podem ser aclimatados ao uso de ambientes de dióxido de carbono para o cultivo dessas células, as diferenças intrínsecas entre chamada troca gasosa terrestre e aquática para uma abordagem diferente quando cultura piscine ou células Urodelos confinado em água, incluindo PPM. Meios detalhados aqui são tamponadas com um derivado de piperazina, zwitteriónicos compostos orgânicos [HEPES: ácido 4 - (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico] e bicarbonato de sódio (NaHCO3). Assim, numa incubadora com uma injecção de gás não é necessária, ou necessária para a cultura dessas células. Mais importante, esses incubadoras devem possuir a capacidade de arrefecer, em vez de calor, como as temperaturas necessárias para a cultura e piscine Urodelos PPM variam entre 18-26 ° C. Além disso, PPM salmonídeos pode ser cultured a temperaturas mais baixas, se necessário, destacando ainda mais a necessidade de uma incubadora de arrefecimento. Além disso, temos encontrado (assim como outros investigadores, como comunicado anteriormente) que vedação de placas de cultura é necessária para preservar a viabilidade celular. Simplesmente envolvendo a interface entre a tampa e a placa de cultura com a fita de laboratório padrão é suficiente para atingir este objectivo.

    Enquanto passaging dos dois principais PPM / CTM / mioblastos é comum na cultura de células de mamíferos, não parece ser possível com células piscine, pelo menos antes da fase final Mb (por volta do dia 6 de cultura). Portanto, o número apropriado de células suficientes para suportar a proliferação e para alcançar os objectivos da experiência deve ser semeadas no início da cultura. Além disso, se for menos do que o esperado rendimentos celulares são obtidos, não é possível propagar células e, em seguida, replate progenitura posterior. Atribuímos essa característica para o aumento da confiança no extracelularmatriz intracelular (ECM) de piscine MPC / mioblastos. Alternativamente, é possível que este é um artefato do substrato de laminina e, portanto, mais empírica determinação dos componentes da MEC necessárias para a proliferação piscine MPC / Mb e diferenciação se justifica. Fazemos notar, entretanto, que vários de nossos colaboradores têm removido com sucesso mioblastos em estágio final (~ dia 6 de cultura) do substrato da cultura e replated essas células (JM Froehlich e PR Biga, comunicação pessoal).

    Usando este protocolo ou um semelhante a ele, a experimentação envolvendo RT-PCR 3,71-74,76-78, Western blot 32,79-81, imunocitoquímica 32,33, ensaios de proliferação 32,33,59, transfecção gene 15, morfométricas análise 78, toxicologia rastreio 82, e cromatina imunoprecipitação (CHIP; JM Froehlich e PR Biga, resultados não publicados) foi feito. No entanto, mais descrições de adicional em vitprotocolos ro, ou seja, aqueles que envolvem passaging e propagação clonal, são muito necessárias. Na verdade, o laboratório Rodgers 15 fez avanços significativos na cultura de piscine PPM / mioblastos, otimizando um protocolo para a indução de transfecção de mioblastos de truta arco-íris. Com base nesta metodologia, outras investigações envolvendo RNAi ou superexpressão de metas específicas do músculo esquelético, especialmente os postulados de estar envolvido com as trajetórias de crescimento ao longo da vida de peixes teleósteos, não só são possíveis, mas pode levar a avanços significativos na aquicultura e campos biomédicos da ciência.

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    Disclosures

    Não há nada a divulgar.

    Acknowledgments

    Os autores gostariam de estender muitos agradecimentos aos Drs.. Josep Planas e Juan Castillo por sua experiência profissional no desenvolvimento e aplicação do presente protocolo cultura para pequenos peixes e anfíbios. Agradecimentos também são devidos aos inúmeros indivíduos que incansavelmente assistida com a dissecção e dissociação do tecido muscular de muitos peixes (tanto em espécies e número), incluindo Matthew carregamento, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily e Sinibaldo Romero. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Alabama em Birmingham Departamento de Biologia fundos de arranque, Center for Research Protease NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 e NDSU avançar NSF Grant # HRD-0811239 para PRB. O suporte também foi fornecido pela UAB Nutrição Obesidade Centro de Pesquisa prêmio # P30DK056336, NIH NIDDK. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não necessariamenterepresenta a visão oficial do NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

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