Préparation du primaire Myogenic précurseurs cellulaires / cultures de myoblastes de basales vertébrés lignées

Biology

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Summary

La culture in vitro systèmes ont prouvé indispensable à notre compréhension de la myogenèse des vertébrés. Cependant, il reste beaucoup à apprendre sur le développement du muscle squelettique non-mammifère et la croissance, en particulier dans les taxons de base. Un protocole efficace et robuste pour isoler les cellules souches adultes de ce tissu, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), et de maintenir leur auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation dans un contexte de culture primaire permet d'identifier des mécanismes de régulation conservés et divergentes tout au long de les lignées de vertébrés.

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Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

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Abstract

En raison de la difficulté et le temps inhérente d'étudier le programme myogénique in vivo, les systèmes de culture primaire dérivées des cellules souches adultes résidents du muscle squelettique, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), se sont révélés indispensables à notre compréhension du développement du muscle squelettique de mammifère et croissance. En particulier chez les taxons de base de vertébrés, cependant, les données sont limitées décrivant les mécanismes moléculaires qui contrôlent l'auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation des PPM. D'intérêt particulier sont les mécanismes potentiels qui sous-tendent la capacité des vertébrés basales de subir postlarvaire hyperplasie des fibres musculaires squelettiques considérable (c. téléostéens de poisson) et la régénération complète suite à la perte appendice (c. urodèles des amphibiens). En outre, l'utilisation de myoblastes en culture pourrait aider à la compréhension de la régénération et la réexposition du programme myogénique et les différences entre eux. Àcette fin, nous décrivons en détail un protocole robuste et efficace (et leurs variations) pour isoler et maintenir PPM et leur progéniture, les myoblastes et les myotubes immatures, en culture cellulaire comme une plate-forme pour la compréhension de l'évolution du programme myogénique, en commençant par le plus vertébrés basales. Capitalisant sur ​​le modèle du statu organisme du poisson zèbre (Danio rerio), nous présentons l'application de ce protocole aux petits poissons de la cyprinidés clade Danioninae. Parallèlement, ce protocole peut être utilisé pour réaliser une approche comparative plus large en isolant PPM de l'axolotl mexicain (Ambystomamexicanum) et même les rongeurs de laboratoire. Ce protocole est maintenant largement utilisée dans l'étude de la myogenèse dans plusieurs espèces de poissons, y compris la truite arc, le saumon et la dorade 1-4.

Introduction

Une bonne compréhension de la myogenèse mammifère a été obtenue par la récapitulation de ce processus dans les deux souris primaire (Mus musculus) cultures de myoblastes et la lignée cellulaire dérivée de la souris bien décrit, C2C12 5. Début dans les années 1950 6, ces cultures ont conduit à beaucoup de progrès dans la compréhension du programme murinemyogenic et, par extension, la myogenèse chez les autres vertébrés. En outre, les techniques myofiber d'explants cellulaires unique ont augmenté sur la compréhension des interactions entre les cellules satellites et les fibres musculaires entourant 7-9. Cultures de cellules sont particulièrement attrayants pour les enquêtes de la myogenèse en raison de la courte période de précurseur de cellule différenciée 10, relative facilité de transfection pour ARNi 11-14, 15,16 transgénique et surexpression études 14,17,18, l'expansion in vitro suivie d'une greffe in vivo 18-20, et même échantillonarison de cellules précurseurs myogéniques et leurs agents de régulation entre des taxons 21,22. Bien que les différences dues à l'environnement artificiel du système de culture ont été décrits 5,23, ces systèmes in vitro se sont révélés être indispensable à notre dissection du programme complexe qui régit la formation des multinucléées, myofibersfrom mononucléées différenciation terminale des cellules progénitrices prolifératives appelées myosatellite cellules (CSM) chez les mammifères.

En dehors de la classe des mammifères, cependant, la conservation et / ou la divergence des mécanismes contrôlant la myogenèse sont mal comprises, en grande partie en raison de la difficulté de culture de cellules précurseurs myogéniques (PPM) et les myoblastes de divers taxons. En effet, les cultures de myoblastes primaires n'ont été décrit dans trois oiseaux 24-26, un reptile 27, quelques amphibiens 28-30, et quelques poissons 1,3,4,31-33. Continue lignées cellulaires myogéniques de vertebrates autres que les rongeurs 34-36 sont encore plus rares, avec la seule ligne non mammifère myogénique cellule étant dérivé de la caille japonaise (Cortunix japonica), QM7 37. Malgré de nombreuses tentatives de immortalisation, une lignée de cellules myogéniques téléostéens reste insaisissable et un protocole pour la transfection efficace de ces cellules n'a été publié cette année 15. Ainsi, des protocoles clairs et bien optimisés pour la culture PPM primaires et les myoblastes d'une variété de vertébrés sont très nécessaires non seulement pour étendre notre connaissance de l'évolution du programme myogénique, mais d'utiliser la puissance de la physiologie comparée de faire des percées dans le traitement des maladies musculo-squelettiques et des troubles humains.

Alors que la littérature contient de nombreux rapports de MPC / myoblastes isolement 38-49, il est fréquent que les auteurs décrivent les protocoles de ces isolements en bref, souvent incomplètes, les formats. En outre, les protocoles les plus instructifs pensINDIQ U EES ont été développés pour les souris 50-53, et certains d'entre eux compter sur la sélection d'anticorps 54,55 ou 56,57 transgènes de fluorescence, ce qui rend ces protocoles inutilisable ou espèces non-rongeurs intimes impraticables utilisés par les biologistes musculaires. Avec peu connu sur piscine, amphibiens et reptiles myogenèse, un protocole détaillé et complet, décrit avec l'aide de l'audiovisuel et à l'efficacité démontrée dans les espèces apparentées de loin, serait plus utile sur le terrain.

D'abord décrite par Powell et ses collègues en 1989 58, le protocole suivant a été initialement développé pour isoler les PPM et les myoblastes de salmonidés (à savoir, la truite arc, Oncorhynchus mykiss, et le saumon de l'Atlantique, Salmo salar) et des cyprinidés plus grands (c.-à-poisson rouge, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau et Paboeuf optimisés une culture primaire de myoblastes pour la truite arc 59, et ma minoroptimizationsde ce protocole utilisable dans plusieurs petits ménés du clade Danioninae (de poisson zèbre, Danio rerio, et danio géant, Devario aequipinnatus) 32 en raison des nombreux outils génétiques disponibles pour travailler le poisson zèbre et donc ses proches parents. poissons téléostéens sont des organismes intéressants pour l'étude en raison de leur stratégie de croissance divergent (au moins dans la plupart des espèces). Grands salmonidés, comme la plupart des poissons, poussent pour une durée indéterminée, avec un potentiel de croissance sans entrave par une asymptote à l'échéance, même dans les vieux 60-62 ans. Contrairement poisson zèbre, les grandes danionins comme le danio géant 63 et moustachus potentiels typiques de poissons téléostéens de croissance d'affichage de danio, rendant leur juxtaposition directe une plate-forme idéale pour comprendre si le choix du destin cellulaire MPC joue un rôle dans l'hyperplasie du muscle squelettique par rapport à l'hypertrophie.

De même, nous avons montré que ce protocole peut être utilisé avec la souris et l'axolotl, avec un rendement de cellule relativement élevé et Viabindices ilité. Salamandres urodèles, comme l'axolotl mexicain (Ambystomamexicanum), possèdent la capacité remarquable à régénérer les tissus, y compris les membres et la queue 64-66 entières. Cette caractéristique rend ces modèles amphibies intéressants de l'atrophie du muscle squelettique et du vieillissement. Selon le protocole décrit ci-dessous, une approche similaire peut être effectuée comme cela a été fait dans de nombreuses espèces de poissons, fournissant un contexte comparatif encore plus large pour de telles études. Comme de nombreux biologistes vraiment apprécier comparatifs, les avancées les plus significatives en biologie fondamentale et translationnelle biomédecine peuvent être faites lorsque les données sont analysées dans le spectre le plus large (ici, l'ensemble de la lignée des vertébrés).

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Protocol

Déclaration éthique: Tout l'expérimentation sur les animaux vertébrés décrites ici a été approuvée à l'avance par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Alabama à Birmingham et est conforme aux lignes directrices établies par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire, National Institutes of Health des États-Unis ministère de la Santé et des Services sociaux.

1. Préparation de la Culture

  1. Préparer le support de base comme suit: 9 mM NaHCO 3 (1,51 g par 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g par 2 L) dans du DMEM (13,48 g / L; 26,96 g pour 2 litres).
    1. Déterminer le pH et ajuster à 7,40 avec HCl ou NaOH.
    2. Déterminer l'osmolalité et s'adapter à ~ 300 mOsm avec NaCl (si nécessaire).
    3. Stériliser par filtration à l'aide (2) systèmes de stérilisation 1 L de vide et conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière jusqu'à 2-3 mois.
      REMARQUE: Voir les tableaux 1 et 2 pour le réactif complet, les outils, la consomables, et matériel informatique.
  2. Préparer-L-lysine-traitée poly plaques en dissolvant 5 mg de γ-irradiation de poly-L-lysine (> 300 000 mw) dans 50 ml d'eau ultrapure stérile. Mélanger doucement par inversion pendant 10 min à température ambiante, assurer la dissolution complète de polymères de lysine.
  3. Introduire à la pipette la quantité nécessaire de la poly-L-lysine solution dans chaque puits, en fonction du type de plaque (tableau 3). Laisser les plaques se tenir dans hotte à flux laminaire pendant 5 minutes.
  4. Ensuite, retirez la poly-L-lysine solution et laver deux fois avec de l'eau stérile. Laisser sécher à l'air plaques en hotte à flux laminaire pendant 20 minutes.
  5. Obtenir 1 mg de laminine (origine de Engelbreth-Holm-Swarm) et les dissoudre dans 50 ml de milieu de base à une concentration finale de 20 pg / ml. Appliquer la solution de laminine à des plaques de culture de cellules de poly-L-lysine-traitée à 2 ug / cm 2. (Voir le tableau 3 pour différentes tailles de plaques)
  6. Mélanger doucement la solution pour assurer full bien la couverture. Sceller les plaques avec du ruban de laboratoire et le placer dans l'incubateur pendant 24 heures. L'incubateur doit être réglé à la température appropriée pour les espèces utilisées (voir tableau 7), et pas de gaz supplémentaires doivent être ajoutés à l'incubateur.
    REMARQUE: laminine doit être autorisé à adhérer à plaques pendant 24 heures avant l'ensemencement des cellules. Ne pas le faire risque d'amoindrir à aucune adhérence cellulaire.
  7. Préparez le support tel que décrit dans le tableau 4. Milieu complet est meilleur préparé la journée d'utilisation.
  8. En préparation pour l'isolement du tissu, et assembler les éléments suivants autoclave: 300 à 500 ml gobelet (s); plats de Pétri en verre; gère scalpel; forceps (fin et grossier); ciseaux de dissection; et plusieurs feuilles de papier autoclave hydrofuge.
    NOTE: Pour chaque personne qui assiste le processus de dissection, (2) poignées de scalpel, (1) pince (de type selon les préférences personnelles), (1) des ciseaux de dissection, et (5-10) feuilles de papier autoclave hydrofuge sontsuffisante.
  9. En plus des articles ci-dessus autoclave, assembler 70% d'éthanol, un équilibre de poids, des tubes coniques de 50 ml de stériles (nombre dépend de la taille de la culture), et de la glace.

2. Dissection des tissus

  1. Avant de commencer, assurez-vous que d'un stock suffisant de poissons est disponible.
    NOTE: L'âge du poisson à être utilisé est d'une importance critique. Alors que le poisson de deux espèces différentes peuvent être de poids similaires, un jeune poisson d'une espèce possédera plus que PPM un poisson plus d'une autre espèce. En règle générale, les jeunes poissons, en particulier lorsque vous travaillez avec les salmonidés, sont les meilleurs. Pour danionins, poissons aussi vieux qu'un an peut être utilisé de façon optimale, tandis que les salmonidés de l'âge de 4-6 mois ou moins (jusqu'à 15 g) sont optimales.
  2. Pour chaque 5 g de tissu d'être disséqué, aliquote de 25 ml de milieu d'isolement dans un tube conique de 50 ml stérile.
  3. Peser, la masse d'enregistrement, et le numéro du tube (s). Placer les tubes sur la glace.
  4. Euthanasier 2-3 poissonsà la fois par immersion dans de> 300 mg / L de bicarbonate de sodium tamponnée au méthanesulfonate de tricaïne. Permettre le mouvement des opercules de cesser de> 5 minutes puis plonger les poissons dans 70% d'éthanol (contenues dans les béchers stériles) pendant 30 secondes.
  5. Retirer le poisson de 70% d'éthanol et placer sur papier autoclave hydrofuge. Directement derrière l'opercule, utiliser un scalpel pour faire une superficielle, incision peu profonde. Enlevez les écailles et la peau en le saisissant par la peau à l'incision précitée et tirez vers la queue de poisson.
  6. Après le retrait de la peau, l'excision de la epaxial, rapide glycolytique musculaire "blanc" du poisson des deux côtés (en évitant le muscle lent oxydatif "rouge" situé près de la ligne latérale) et le lieu dans un milieu d'isolement. Jeter le reste du poisson tel que requis par l'institution.
    Cellules S'il est tout à fait possible de PPM de culture provenant de muscle rouge, presque chaque publication à l'aide téléostéens PPM a utilisés isolés du m epaxial: NOTEyotome.
  7. Répéter les étapes 02.04 à 02.06 jusqu'à ce qu'une quantité suffisante de muscle est obtenu. Au cours de la dissection, en sorte que le tissu musculaire groupé reste sur de la glace pour maintenir la viabilité des cellules.

3. Dissociation mécanique

  1. Verser un tube de 25 ml / 5 g de tissu de muscle dans une boîte de Pétri en verre. L'utilisation de deux poignées avec scalpel attaché # 10 lames de bistouri, mince tissu pour obtenir une consistance de pâte ou purée. Une motion "va-et-vient" de tirer les lames de bistouri passé de l'autre qui fonctionne le mieux.
    NOTE: Bien que homogénéisateurs de tissus peut sembler approprié, le nombre de cellules viables sera considérablement réduite, si elle n'est pas abolie.
  2. L'utilisation d'un 25 ml pipette sérologique et pipette sérologique, enlever le tissu en suspension et remplacer dans le tube d'origine conique.
  3. Répétez les étapes 3.1 à 3.2 jusqu'à ce que tous les tissus dans tous les tubes a été dissocié mécaniquement.
  4. tissu Centrifuger pendant 5 minutes à 300 x g et à 10 ° C.
  5. Follen raison centrifugation, éliminer les 25 ml de surnageant de médias avec une pipette 25 ml sérologique, aspirateur à vide, ou par décantation attention.
  6. Ajouter 25 ml de milieu de lavage à chaque tube de tissu, remettre en suspension et recentrifuger comme ci-dessus.
  7. Laver deux fois avec du milieu de lavage, en éliminant le surnageant à chaque fois.

4. Dissociation enzymatique

  1. Lors de l'étape 3.4, de préparer une solution de collagénase en combinant 0,22 g de la collagénase de type IV et de 44 ml de milieu de base (ou une quantité suffisante à 0,11 g/0.22 ml).
  2. Mélanger dans un bécher pendant 10-15 minutes à 4 ° C. Stériliser par filtration avec une seringue de 50 ml et un filtre à seringue de 0,45 um.
    NOTE: Plus d'un filtre à seringue peut être nécessaire, en fonction de la préparation de collagénase. Collagénase obtenue auprès de fournisseurs autres que Worthington Biochemical soulève plus de difficultés lors de la filtration. Collagénase est utilisée pour dissocier les liaisons peptidiques du collagène qui constituent l'endomysium. Cedigestion supprimer cette barrière protectrice des fibres musculaires.
  3. Pour chaque gramme de tissu musculaire, le tissu remettre en suspension dans une solution de collagénase à 0,2%. Pour 5 g de tissu de muscle, ajouter 10 ml de solution de collagénase et de 15 ml de milieu de base.
  4. Ajouter 10 ul de PSF par ml de milieu de solution de collagénase / base (par exemple, 250 ul à 25 ml). Assurez-vous que le tissu est bien suspendu, comme cela va affecter l'efficacité de la digestion enzymatique.
  5. Incuber le tissu musculaire dans la collagénase pendant 60 minutes à 18 ° C avec agitation légère. Selon le degré de dissociation et des espèces mécanique, digestion à la collagénase peut être porté à 90 minutes, bien que cela peut affecter la viabilité des cellules.
  6. Après tubes digestion à la collagénase, centrifugeuse coniques à 300 g pendant 5 minutes à 12 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans un tissu de 25 ml de milieu de lavage.
  7. Recentrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 126; C. Répéter l'opération avec fluide de lavage une seconde fois.
  8. Après lavage deux fois le tissu, remettre en suspension les tissus musculaires dans 25 ml de milieu de lavage et trituration avec une pipette sérologique de 10 ml jusqu'à ce que le tissu / homogénat milieu passe dans et hors de la pipette avec une relative facilité. 5-10 triturations est généralement suffisant.
    1. Répéter l'opération avec une pipette sérologique de 5 ml et ensuite une canule métallique de calibre 16 fixée à une seringue.
  9. Tubes centrifugeuse coniques à 300 g pendant 5 minutes à 12 ° C. Décanter le surnageant.
  10. Au cours de la centrifugation 5 minutes au-dessus, de préparer la solution de trypsine de digestion en combinant 0,25 g de trypsine avec 5 ml de milieu de base.
  11. On agite à 4 ° C pendant 10 à 15 minutes et filtrer stériliser avec une seringue de 20 ml et filtre de 0,45 um de seringue.
  12. Récupérer des tubes coniques et ajouter 100 ul de solution de trypsine et 4,9 ml de milieu de dissociation pour chaque 1 g de tissu musculaire à chaque tube. Pour EXAmple, ajouter 500 ul de solution de trypsine et de 24,5 ml de milieu de dissociation de 5 g de tissu de muscle.
    REMARQUE: La trypsine est une serine protease qui séparera les cellules précurseurs myogéniques de la lame basale.
  13. tissu Remettre en suspension dans la trypsine / dissociation milieu bien. Incuber pendant 20 minutes à 18 ° C.
  14. Après la première incubation de la trypsine, des tubes coniques à centrifuger à 300 g pendant 1 min à 12 ° C.
  15. Neutraliser la trypsine en combinant les surnageants avec le milieu d'isolement, à une concentration de 1 volume de surnageant à 4 volumes de milieu d'isolement. Conserver à 4 ° C pendant la seconde digestion par la trypsine.
  16. Pour le culot restant de tissu, répétez les étapes 4.12 à 4.15, combinant le surnageant après l'étape 4.15 avec le milieu surnageant / d'isolement de la première digestion de la trypsine.
  17. Alternative: Les collagénase et la trypsine digestions peuvent être combinés pour maximiser les rendements cellulaires. <ol>
  18. Pour ce faire, triturer la collagénase digère l'aide d'une canule métallique (6 en longueur et en calibre 16 qui fonctionne le mieux) fixée à une seringue de 20 ml jusqu'à ce que l'homogénat passe facilement à travers la canule.
  19. Pour l'homogénat, ajouter 500 ul de solution de trypsine (préparé à l'étape 4.10) et incuber à 18 ° C pendant 20 minutes.
  20. Après les tubes d'incubation, centrifuger coniques à 300 g pendant 1 minute à 12 ° C.
  21. Neutraliser la trypsine en combinant les surnageants avec le milieu d'isolement, à une concentration de 1 volume de surnageant à 4 volumes de milieu d'isolement.
  22. Conserver à 4 ° C pendant la seconde digestion par la trypsine.
  23. Passez à l'étape 4.18, avec le protocole standard.
  • Distribuer le surnageant / isolement final mélange moyen dans 50 ml tubes et centrifuger coniques à 300 g pendant 10 minutes à 12 ° C.
  • Retirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber la cellulepastilles. Introduire à la pipette 2 ml de milieu complet dans chaque tube, de dissolution de chaque culot cellulaire.
  • Combiner les cellules en suspension dans un milieu complet dans un Tube de 50 ml conique.
  • Rincer chaque tube avec 1 ml de milieu complet, en combinant avec le pool de cellules remises en suspension précédemment.
  • Triturer avec une canule métallique et la seringue 5-10 fois.
  • Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis de 100 um de la cellule, en rinçant avec du milieu complet.
  • On filtre la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 pm.
  • Ajouter suffisamment de milieu complet à 50 ml et centrifuger à 300 xg pendant 10 minutes à 15 ° C.
  • 5. Comptage, de dilution, et l'ensemencement des cellules

    1. Suite à la centrifugation finale à l'étape 4.25, enlever le surnageant par décantation attention ou avec une pipette sérologique. Remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de milieu complet.
    2. Avec des cellules complètement remises en suspension, retirez 20 pi; De la suspension cellulaire et le placer dans un tube de centrifugation de 1,5 ml.
    3. Ajouter 5 ul de colorant bleu Trypan et attendez 5 minutes. L'utilisation d'un hémocytomètre, déterminer le nombre de cellules viables.
    4. Lors de la détermination, diluer les cellules à la concentration nécessaire. Teleost PPM sont les mieux ensemencées à 150.000-200.000 cellules par cm 2. Pour une stratégie en six et placage, la dilution de cellules à 1,5 x 10 6 à 2,0 x 10 6 par ml soutient la prolifération et la différenciation suffisante.
    5. Récupérer les poly-L-lysine-traitée, des plaques revêtues de laminine et des cellules de semence. (Voir le tableau 5 pour les dilutions spécifiques à la plaque et les volumes de placage.) NOTE: Le tableau 6 illustre le nombre moyen de cellules isolées par gramme de tissu musculaire isolé à partir de diverses espèces de poissons téléostéens. Ciel (O. mykiss) présentent moins de PPM par gramme de tissu musculaire de faire le poisson-zèbre (D. rerio) et de ce fait exiger plus de poissons à isoler pour l'ensemencement bon.
    6. Sceller les plaques avec du ruban de laboratoire et le placer dans l'incubateur de refroidissement à la température appropriée. PPM de toutes les espèces inscrites ici (sauf pour les souris) peuvent être incubées dans des conditions atmosphériques normales, sans dioxyde de carbone (CO 2) de la supplémentation. (Voir le tableau 7.)
    7. Alternative: Certains laboratoires ont adopté un protocole qui appelle pour permettre PPM à adhérer à des substrats de culture pendant 40 minutes.
      1. Ensuite, rincer les plaques avec les médias de lavage pour enlever les cellules lâchement et non-adhérentes. Avertissement: Cette étape est très importante pour éviter l'adhésion "non spécifique" d'autres cellules (fibroblastes par exemple) pour les substrats de culture.
      2. Ajouter le média complètes et les cellules de lieu dans l'incubateur et de soins pour que détaillé ci-dessous.

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    Representative Results

    Vingt-quatre heures après l'ensemencement, les cellules précurseurs myogéniques (PPM) doivent être visibles fixé au substrat de laminine (voir les figures 1a et 1d). Après ensemencement, les cellules (PPM) adoptent une forme de broche-like, indicative de ce type de cellule (figure 1) et sont MyoD1 + (figure 2). En espèces Danio, PPM semblent être plus compact avec des processus bipolaires petites que ne le font les PPM de Oncorhynchus et Salmo. Cependant, plus de quatre jours de culture, PPM de toutes les espèces examinées Piscine adoptent des morphologies similaires et semblent nettement comme des myoblastes (figures 1b et 1e). Milieux complets doivent être enlevés, et PPM doivent être lavées deux fois avec du milieu de lavage. Myofibroblastes peuvent contaminer les cultures myogéniques et se distinguent facilement des PPM / myoblastes par leur morphologie semblable à une étoile (par rapport à la forme de la broche de la myoblastes). Le lavage des plaques grandement improves l'élimination de ces fibroblastes.

    Dans les espèces décrites ici (voir le tableau 7), les changements de supports quotidiens produisent les meilleurs résultats. PPM et leur descendance (myoblastes et les myotubes naissantes) doivent être lavés une fois ou deux avant l'ajout de milieu complet frais. Sinon, les changements de supports peuvent être réduites à un jour après que les cellules ont atteint le stade de myoblastes définitif (environ 4 jours de culture). Myotubes devraient former dans les 2-3 jours (figures 1c et 1f) et être myogénine + (figure 2), en particulier quand elles sont cultivées dans un milieu de différenciation (voir ci-dessous). Bien que les périodes de semaines à quelques mois ont été signalés dans plusieurs espèces de mammifères, PPM Piscine et myoblastes ne semblent pas tolérer de telles périodes de temps. Cellules prolifèrent pour les six premiers jours de culture (Figure 3), avec une différenciation ultérieure entre les jours 7 et 9-11 de la culture. Ensuite, les cellules de la sénescence ou unepoptose.

    La nature myogénique des PPM et leur descendance isolé en utilisant ce protocole a été déterminé 3,32,33 basé sur l'expression des gènes. Contrairement aux systèmes de culture de mammifères, la prolifération des PPM et des myoblastes progéniture est relativement faible pendant les premiers jours de culture (par rapport aux systèmes utilisant des myoblastes murins primaires ou C2C12), avec des augmentations rapides détectés comme les cellules forment des myotubes immatures pendant les jours 6-9 de la culture en espèces Danio 32. Rapports de la truite arc ont utilisé un moyen de différenciation (commun dans les cultures de myoblastes de mammifères, mais pas requise dans les systèmes Piscine) et indiquer que les indices de prolifération diminuent comme prévu avec myotube formation 33. Dans nos mains, les myotubes obtenus peuvent rester dans la culture jusqu'à 9-11 jours (espèces Danio) et 11-13 jours (espèces Oncorhynchus) avant la sénescence cellulaire ou apoptose se produit.

    Réactif Société (Preferred v suppléant) Numéro de catalogue (Preferred v suppléant) Quantité par Culture
    γ-irradiation de poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomédical) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (taux élevé de glucose) Sigma-Aldrich (Cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminine BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Bicarbonate de sodium (NaHCO 3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1,51 g
    HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9,53 g
    Antibiotique / antimycotique Thermo Scientific (SIGMA-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 ml
    Le sulfate de gentamicine Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 3.2 ml
    Donneur Sera Hippique Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 ml
    Veau fœtal Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 ml
    La collagénase (type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0,44 g
    La trypsine (à partir de pancréas) MP Biomédical (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g

    Tableau 1. Liste de réactif détaillée avec le fabricant préféré et le numéro de catalogue.

    Consommable Outils Équipement
    Culture cellulaire Plaques Forceps (normal) Pipette sérologique
    50 ml stériles Tubes coniques Forceps (Beaux) pH-mètre
    Laboratoire bande Poignées de bistouri Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 Systèmes de stérilisation um à vide Lames de scalpel (# 10, # 11) Hotte à flux laminaire
    Hydrofuge papier autoclave Ciseaux chirurgicaux Vide Manifold
    Pipettes sérologiques Plats en verre de Pétri Microosmolality compteur
    12-16 G canules Luer Serrures

    Tableau 2. Consommables, les outils et le matériel nécessaire pour la culture cellulaire.

    Plate Taille cm 2 par bien Poly-L-lysine * Laminine **
    6 bien 9.5 1,6 ml 1
    24 bien 1.9 0,32 0,2
    48 bien 0,95 0,16 0,1
    96 puits 0,32 0,06 0,03
    * Une concentration de 0,1 mg / ml ** Concentration 0,020 mg / ml

    Tableau 3. Volumes optimisé pour le revêtement de plaques de culture de cellules de poly-L-lysine et de laminine.

    Réactif Isolement Laver Dissociation Compléter
    Milieu de base 419,25 ml 395,40 ml 297,00 ml 178,00 ml
    PSF * 5,00 ml 4.00 ml 3.00 ml 2,00 ml
    Le sulfate de gentamicine ** 0,75 ml 0,60 ml - -
    Donneur sérum de cheval 75,00 ml - - -
    Sérum bovin fœtal *** - - - 20,00 ml
    * PSF: pénicilline / streptomycine / fongizone cocktail (100x); ** 50 mg / ml de concentration; Caractérisé ***

    Tableau 4. Différentes préparations des médias pour l'isolement et la culture de cellules précurseurs myogéniques (PPM).

    <td> 9.5
    Plate Taille cm 2 par bien Dilution Volume placage
    6 bien 1,5 - 2,0 x 10 cellules / ml 6 1 ml
    24 bien 1.9 1,5 - 2,0 x 10 cellules / ml 6 250 pl
    48 bien 0,95 1,5 - 2,0 x 10 cellules / ml 6 150 pl
    96 puits 0,32 1,5 - 2,0 x 10 cellules / ml 6 50-100 ul

    Tableau 5. Dilutions recommandées et les volumes de placage selon la taille de cellule et plaque de culture.

    Espèce Moyenne tissu # cellules / g
    Danio rerio 6400000
    Danio dangila 1783000
    Devario aequipinnatus 1797000
    Oncorhynchus mykiss 66800

    . Tableau 6 Nombre moyen de cellules précurseurs myogéniques isolés à partir de 1 gramme de tissu musculaire provenant de diverses espèces de poissons téléostéens: Danio rerio (poisson zèbre), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (danio géant), et Oncorhynchus mykiss (truite arc).

    Espèce Température
    Danio / Devario spp. De 26 à 28 ° C
    Oncorhynchus / Salmo spp. 10 * - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum 18 ° C
    * Des températures inférieures supportent des taux de prolifération inférieurs.

    Tableau 7. Recommandé températures d'incubation pour piscine et d'amphibiens p myogéniquecellules recursor (PPM).

    Figure 1
    Figure 1. Des images lumineuses représentatives sur le terrain de PPM (à gauche), les myoblastes (au milieu), et au début des myotubes (plus à droite) de deux espèces, arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss, en haut) et le poisson-zèbre (Danio rerio, en bas).

    Figure 2
    Figure 2. Coloration immunocytochimique représentant de PPM (A, C) et les myotubes (B, D) isolées et cultivées de danio géant (Devario aequipinnatus, en haut) et arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss, en bas). Dans la culture, les myoblastes sont MyoD1 + positif (a, c)comme révélé par le commerce MYOD1 + anticorps (Danio: C-20, Santa Cruz Biotechnology, la truite: NB100-80899, Novus Biologicals). En outre, comme les myoblastes différencier, ils expriment myogénine (b, d) comme visualisé à l'aide d'anticorps disponibles dans le commerce myogénine (Danio: M-225; la truite: SC-567, tous deux de Santa Cruz Biotechnology).

    Figure 3
    Figure 3. Des données de prolifération cellulaire en utilisant le BrdU représentatifs de mesurer le taux de prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les données obtenues à partir de PPM isolées et cultivées à partir de danio géant 67.

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    Discussion

    Le programme myogénique, quelle qu'en soit les espèces examinées, peut être le plus facilement étudiée à travers un système in vitro. En effet, lors de l'isolement, des cellules précurseurs myogéniques (PPM) chez les poissons ou les cellules myosatellite (MSC) chez les mammifères pénètrent facilement ce processus hautement régulé impliquant la prolifération, le retrait du cycle cellulaire et la différenciation terminale des myoblastes et la fusion de ces myoblastes en myotubes naissantes. Le manque général de souches transgéniques rapporteurs de gène d'espèces Piscine (à l'exception possible du poisson zèbre 67 et la truite arc-69) contraint à des travaux in vivo de l'activation MPC / MSC, la prolifération et la différenciation, et donc le système in vitro présenté ici est un plate-forme attrayante pour les études des espèces de poissons.

    Culture réussie de MPC / CSM, peu importe l'espèce, est fortement dépendante d'un) une attention rigoureuse à la stérilité; b) dissociation mécanique approfondie de muscle squelettique tquestion; et c) l'optimisation de la digestion enzymatique. Pendant les étapes initiales de l'isolement de tissu musculaire, un grand soin doit être pris pour s'assurer que la quantité nécessaire de tissu est excisé sans contamination. Il est de la plus haute importance que les poissons (ou des animaux étant utilisés, d'ailleurs) sont convenablement désinfectés éthanol à 70% et pendant une durée suffisante. Dans nos mains, 30 secondes fonctionne mieux; des périodes de temps plus courtes peuvent entraîner une contamination et plus, une perte d'intégrité des tissus et de la viabilité cellulaire. L'éthanol peut être utilisé comme fixateur, donc il faut prendre soin de ne pas se déshydrater le poisson avant la dissection. La dissection peut être fait en dehors d'une hotte de culture de cellule à écoulement laminaire; Cependant, nous recommandons que ce processus soit fait dans un capot pour réduire la contamination bactérienne ou fongique potentiel.

    Bien que la dissociation mécanique décrit ci-dessus peut sembler brut et / ou fastidieux à première vue, il est essentiel de la procédure d'isolement. Deux grandes lames de bistouri, passé tirél'autre dans un mouvement de glissement (comme indiqué dans le protocole vidéo), produit les meilleurs résultats. Une fois terminé, la cohérence de l'homogénat doit être celle d'une bouillie ou en purée, et facilement recueillies avec une pipette sérologique large de l'alésage (soit 25 ml). Simplement, meilleure est la dissociation mécanique est élevée, plus la / le rendement en MSC MPC et le meilleur de la culture résultante. Mauvais dissociation entraver la digestion enzymatique et diminuer le rendement de la cellule. Bien qu'il puisse être tentant de considérer l'utilisation de homogénéisateurs de tissus électriques réduit considérablement la viabilité des cellules malgré sa commodité évidente, du moins avec PPM Piscine.

    Comme avec tous les protocoles, l'optimisation de la procédure décrite ci-dessus est souvent nécessaire. Cela s'est avéré vrai dans notre travail avec plusieurs espèces danionin. Les résultats de notre laboratoire indiquent que les petites danionins (par exemple, le poisson-zèbre) donnent plus de PPM par gramme de muscle squelettique que faire de plus grandes espèces (par exemple giDanio fourmi ou moustachu). Cependant, cela est uniquement réalisée si une concentration plus élevée de la collagénase (0,3%) est utilisé avec des tissus à partir de plus petites espèces. Dans nos mains, une concentration de 0,2% est approprié pour les espèces de salmonidés (par exemple, la truite arc-en-; la truite fardée [Oncorhynchusclarki], le saumon quinnat [Oncorhynchustschawytscha]), les danionins grandes, axolotl (Ambystomamexicanum) membre et la queue, et même le muscle squelettique de souris. De même, il faut veiller à sélectionner la collagénase appropriée. Dans notre expérience, collagénase de type IV préserve la viabilité des cellules beaucoup mieux que les collagénases recommandées pour les tissus fibreux tels que les os et les muscles (c'est à dire de la collagénase de type II) 70. Bien que la digestion peut être plus complète dans une période de temps plus courte, de l'intégrité du récepteur de la membrane cellulaire est susceptible compromise par augmentation de l'activité trypsique dans ces préparations. En ce qui concerne la trypsine, notre laboratoire a toujours utilisé la plus grossière trypsine préparation purified de pancréas de porc, plutôt que les préparations «purs» disponibles. Dans nos activités de culture avec différentes espèces, nous avons remarqué que peu d'effet bénéfique de la concentration de la trypsine différentes.

    La trituration est essentiel à ce protocole. Il se dissocie à la fois la matrice fibreuse du muscle squelettique et augmente la zone de surface de la digestion trypsique tout en perturbant manuellement l'intégrité de la structure des fibres musculaires. Lorsque vous effectuez les triturations, en utilisant successivement plus petites pipettes d'alésage et canules est beaucoup plus facile que d'utiliser la canule et la seringue immédiatement. En procédant directement à triturations avec une canule et la seringue peut se traduire par des canules branchés et / ou une pression excessive est appliquée à des cellules. Application de digestion tryptique sans trituration adéquat permet de réduire considérablement les rendements des cellules.

    Une fois isolé, le processus de culture est assez simple. La plupart des publications à ce jour ont utilisé un esprit de protocoleh un média à la fois la prolifération et la différenciation 33,71-75, y compris la nôtre; Cependant, les articles les plus récents écrits par plusieurs enquêteurs français ont décrit un protocole deux médias, médias basés distincts et contenu sérum pour prolifération et la différenciation 33. Ce protocole 'nouvelle' imite de plus près ceux qui sont utilisés dans la culture de cellules souches mésenchymateuses murines et myoblastsand semble améliorer la prolifération des myoblastes en début de 33 et peut-être plus approprié de contrôler la prolifération et / ou la différenciation des cellules. Cependant, sans une caractérisation de l'expression des gènes, il est difficile de déterminer si une telle médias 'de prolifération »conserve aussi un état plus« des myoblastes comme «que fait la méthodologie d'un média traditionnel. Publications antérieures décrivant l'expression des gènes, que ce soit à la transcription ou la teneur en protéines, ont déclaré utiliser le traditionnel protocole un média 3. Alternativement, un seul média (DMEM décrit ici) peut être complété avec des concentrations différentes de sérum bovin fœtal (FBS): 10% pour la prolifération et la différenciation de 2%.

    Même si les enquêteurs utilisant des systèmes de culture de cellules de mammifères peuvent être acclimatés à l'aide des atmosphères de dioxyde de carbone pour la culture de ces cellules, les différences intrinsèques entre les appels d'échange de gaz terrestre et aquatique pour une approche différente lors de la culture piscine ou cellules urodèles confinée à l'eau, y compris les pays partenaires méditerranéens. Média décrits ici sont tamponnées avec un dérivé pipérazine, zwitterioniques composés organiques [HEPES: acide 4 - (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthane sulfonique] et du bicarbonate de sodium (NaHCO 3). Ainsi, un incubateur avec l'injection de gaz n'est pas nécessaire ou requis pour la culture de ces cellules. Plus important encore, ces incubateurs doivent posséder la capacité de refroidir plutôt que de la chaleur, comme les températures nécessaires à la culture piscine et urodèles PPM varient entre 18-26 ° C. En outre, PPM de salmonidés peuvent être cultured à des températures inférieures si nécessaire, soulignant en outre la nécessité d'un incubateur de refroidissement. En outre, nous avons constaté (comme l'ont fait d'autres chercheurs, comme communiqué précédemment) que l'étanchéité des plaques de culture est nécessaire pour préserver la viabilité cellulaire. Il suffit d'emballage de l'interface entre le couvercle de la culture et de la plaque avec du ruban de laboratoire standard est suffisant pour atteindre cet objectif.

    Alors que des passages de deux PPM / MSC / myoblastes primaires est commun dans la culture de cellules de mammifères, il ne semble pas être possible avec des cellules Piscine, au moins avant la fin du stade Mo (environ 6 jours de culture). Par conséquent, le nombre approprié de cellules suffisantes pour soutenir la prolifération et à atteindre les objectifs de l'expérience doit être ensemencée au début de la culture. En outre, si au moins prévu rendements cellulaires sont obtenues, il n'est pas possible de propager les cellules et ensuite Réensemencement la descendance ultérieure. Nous avons attribué cette caractéristique de la dépendance accrue à l'extracellulairematrice lular (ECM) de Piscine MPC / myoblastes. En variante, il est possible que ce soit un artefact du substrat de laminine et donc en outre la détermination empirique de composants de l'ECM nécessaires pour piscine MPC / Mb prolifération et la différenciation est justifiée. Nous notons, toutefois, que plusieurs de nos collaborateurs ont réussi à retirer les myoblastes à un stade avancé (~ 6 jours de culture) du substrat de culture et replaquées ces cellules (JM Froehlich et PR Biga, communication personnelle).

    En utilisant ce protocole ou un semblable, expérimentation impliquant RT-PCR 3,71-74,76-78, Western blot 32,79-81, immunocytochimie 32,33, tests de prolifération 32,33,59, la transfection du gène 15, morphométriques analyse 78, toxicologie dépistage 82, et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP; JM Froehlich et PR Biga, résultats non publiés) a été fait. Cependant, d'autres descriptions de plus en vitprotocoles ro, notamment celles qui impliquent des passages et la propagation clonale, sont très nécessaires. En effet, le laboratoire Rodgers 15 fait des progrès significatifs dans la culture de la Piscine PPM / myoblastes par l'optimisation d'un protocole pour induire la transfection de rainbow myoblastes de truites. Sur la base de cette méthodologie, d'autres enquêtes portant sur l'ARNi ou surexpression des objectifs spécifiques du muscle squelettique, en particulier ceux postulé pour être impliqué dans les trajectoires de croissance pour la vie de poissons téléostéens, sont non seulement possibles, mais peuvent conduire à des progrès significatifs dans le aquaculture et des sciences biomédicales de la science.

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    Disclosures

    Il n'y a rien à divulguer.

    Acknowledgments

    Les auteurs tiennent à exprimer un grand merci à MM. Josep Planas et Juan Castillo pour leur expertise professionnelle dans le développement et l'application de ce protocole de culture de petits poissons et d'amphibiens. Merci également aux innombrables personnes qui ont inlassablement assisté à la dissection et la dissociation du tissu musculaire de nombreux poissons (à la fois en espèces et nombre), y compris Matthew charge, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, et Sinibaldo Romero. Ce travail a été soutenu par l'Université de l'Alabama à Birmingham Département de fonds de démarrage biologie, Centre pour la recherche de la protéase NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH Grant NIAMS # R03AR055350, et NDSU Advance AVANT NSF Grant # DRH-0811239 de PRB. Appui a été fourni par l'UAB nutrition obésité Research Center attribution # P30DK056336, NIH NIDDK. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairementreprésenter les points de vue officiels de la NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

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