इमेजिंग 3DISCO द्वारा एक सेलुलर स्तर पर बरकरार बायोलॉजिकल सिस्टम मंजूरी

Neuroscience
 

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Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO. J. Vis. Exp. (89), e51382, doi:10.3791/51382 (2014).

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Abstract

Introduction

जैविक ऊतकों की ऊतकीय परीक्षा उनके प्राकृतिक संदर्भ में अणुओं / कोशिकाओं की प्रकृति को समझने में एक मौलिक दृष्टिकोण है. आदर्श रूप में, पूरे अंग के उच्च संकल्प इमेजिंग सबसे जानकारीपूर्ण और वांछित है. प्रकाश 1 बिखरने की वजह से एक सीमित प्रवेश गहराई, क्योंकि, तय अंगों उच्च संकल्प सूक्ष्म इमेजिंग प्रदर्शन करने के क्रम में sectioned किया जाना है. इसलिए, ऊतक विज्ञान के अध्ययन के अधिकांश अंग के केवल एक छोटे से हिस्से का प्रतिनिधित्व कुछ ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन कर रहे हैं. कुछ अध्ययनों में, उदाहरण के लिए, मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी में neuronal कनेक्शन को ट्रेस करने के लिए लक्ष्य उन, लक्ष्य अंगों से सभी ऊतक वर्गों एकत्र कर रहे हैं और एक 3 डी पुनर्निर्माण के लिए imaged. हालांकि, ऊतक सेक्शनिंग और अलग अलग वर्गों के बाद इमेजिंग विभिन्न सीमाएं हैं. ये होने के कारण यांत्रिक विकृतियों को समय लगता है और ऊतकों की एक अधूरी 3D पुनर्निर्माण के लिए अग्रणी और मुश्किल में शामिलजिसके परिणामस्वरूप छवियों के संरेखण में एँ.

हाल ही में, समाशोधन और इमेजिंग बरकरार पारदर्शी अंगों इस कमी 2,3 करने के लिए एक महत्वपूर्ण समाधान के रूप में विकसित किया गया है. समाशोधन करने पर, संपूर्ण अंग प्रदान की गई है पारदर्शी इमेजिंग प्रकाश यात्रा करने की अनुमति अंत करने के लिए अंत इस तरह के एक बहु फोटान या प्रकाश चादर खुर्दबीन के रूप में एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग unsectioned अंग के उच्च संकल्प छवियों का उत्पादन करने के लिए (चित्रा 1) ( चित्रा 2). विभिन्न अनुसंधान समूहों विभिन्न प्रयोजनों के लिए उनके हित के ऊतक छवि के लिए सक्षम होने के लिए नए ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल विकसित किया है. ये कार्बनिक विलायक 2-5, 8 समाशोधन प्रोटोकॉल आधारित पानी 6,7 और वैद्युतकणसंचलन शामिल हैं. उनमें से, विलायक के 3 आयामी इमेजिंग अंगों को मंजूरी दे दी या 3DISCO केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) अंगों, प्रतिरक्षा अंगों और ठोस ट्यूमर सहित जैविक नमूने की एक किस्म पर एक तत्काल लागू प्रोटोकॉल है. Addit मेंआयन, यह इस तरह के प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM), बहु फोटॉन और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के रूप में विभिन्न माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है. 3DISCO ऐसे 4 tetrahydrofuran (THF) और dibenzyl आकाश (DBE) के रूप में आसानी से उपलब्ध है और सस्ती अभिकर्मकों के साथ समाशोधन पर आधारित है. पूरे प्रोटोकॉल 3-4 घंटा के रूप में के रूप में कम ले जा सकते हैं. इस प्रकार, 3DISCO 9 को पूरा करने के लिए महीने के लिए सप्ताह का समय लग सकता है कि परंपरागत ऊतकीय तरीकों की तुलना में एक मजबूत और तेजी से तकनीक है.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों ~ 3-5 महीने पुरानी चूहों पर IACUC (संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति) के नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा की.

1. पशु छिड़काव और ऊतक तैयारी

समय: माउस + के बाद निर्धारण प्रति 30-60 मिनट (कुछ घंटे के लिए रातोंरात).

  1. पशु वजन और ketamine (80-200 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (7-20 मिलीग्राम / किग्रा) या 2.5% Avertin (0.5 ml/25 जी शरीर के वजन आईपी) का उपयोग कर anesthetize.
  2. पूर्ण प्रभाव में लाने के लिए संज्ञाहरण के लिए कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें.
  3. जानवर पूरी तरह से anesthetized है कि सुनिश्चित करने के लिए जानवर के पैर के अंगूठे और पूंछ चुटकी.
  4. रक्त पूरी तरह से ऊतक से निकाले जाने तक 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पंजाब) या 5-10 मिनट के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ आरटी पर पहली पशु छिड़कना.
  5. लगानेवाला समाधान के लिए छिड़काव स्विच: 0.1 एम पी बी (या 0.1 एम पीबीएस) में 4% पीएफए ​​और छिड़काव जारी रखें/ मिनट 3 मिलीलीटर की रफ्तार से 30-40 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ.
  6. Puncturing और विच्छेदित किया जा रहा है कि ऊतक फैलाएंगे से बचने, हानिकारक है, जैसे बिना ध्यान से ब्याज का अंग / एस काटना.
  7. पीबीएस के साथ भरा एक पेट्री डिश में अंगों (संयोजी ऊतक, तानिका या ड्यूरा बात) आसपास के अतिरिक्त ऊतक निकालें.
  8. कुछ घंटे या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 4% पीएफए ​​में अंगों परसर्ग पीएफए ​​संकेत बुझाना या विशेष रूप से GFP चैनल के लिए autofluorecense ओवरटाइम 10 (लाल और दूर लाल चैनलों में एक कम समस्या है) बढ़ सकता है, क्योंकि लंबे समय बाद नियतन से बचें.
  9. बस समाशोधन प्रक्रिया शुरू करने से पहले आरटी पर पीबीएस के साथ अंगों 2-3X धो लें.

2. ऊतक समाशोधन

समय: बड़े अंगों के लिए छोटा सा अंग है और 1-4 दिनों के लिए 2-3 घंटे.

नोट: transgene अभिव्यक्ति द्वारा ऊतकों का फ्लोरोसेंट लेबलिंग, वायरल अभिकर्मक, डाई अनुरेखण या विरोधीशरीर लेबलिंग समाशोधन से पहले पूरा किया जाना चाहिए. सभी ऊतक समाशोधन कदम आरटी पर प्रदर्शन कर रहे हैं. समाशोधन समाधान THF, DBE, Babb (1 भाग बेंजाइल अल्कोहल और 2 भाग बेंजाइल बेंजोएट) और dichloromethane (आचरण ठीक से हवादार धूआं हुड में प्रयोगों) और त्वचा के साथ सीधे संपर्क (प्रयोग Nitrile दस्ताने) से बचा जाना चाहिए विषाक्त और साँस लेना हैं.

  1. 50% (/ खंड खंड), 70%, और के रूप में अलग कांच की बोतलों में आसुत जल में 80% THF dilutions तैयार: 50% THF के लिए, जैसे, मात्रा के साथ एक कांच की बोतल में 25 मिलीलीटर THF और आसुत पानी की 25 मिलीलीटर मिश्रण की 50 मिलीलीटर की तुलना में बड़ा है.
  2. धीरे एक 1-2 मिनट के लिए बोतल झटकों से समाधान मिलाएं.
  3. स्पष्ट रूप से कांच की बोतल लेबल.
  4. सुरक्षित बोतलों को बंद करने और एक अंधेरे कैबिनेट में काम कर समाधान रखना. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक ही काम कर समाधान अब 1-2 सप्ताह से अधिक का उपयोग नहीं करते. इसलिए, सक्षम उपयोग ताजा स्टॉक अभिकर्मकों होने के लिए उपलब्ध सबसे छोटी मात्रा के रूप में समाशोधन के समाधान के आदेश.
  5. पहले समाशोधन समाधान, 50% THF साथ कांच की शीशियों (जैसे, 2-3 एमएल) भरें, और समाशोधन शुरू करने के लिए कांच की शीशियों में पीबीएस से अंगों हस्तांतरण.
  6. सुरक्षित रूप से उनके lids के साथ कांच की शीशियों को बंद करने और क्रियाशीलता के लिए एक रोटेटर (जैसे, एक पहिया दोषी) का उपयोग करें.
  7. अंधेरे में कांच की शीशियों को कवर और रखने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी का प्रयोग करें. एक स्थिर गति (~ 30 आरपीएम) में संकेत समय (तालिका 1) के लिए कांच की शीशियों में नमूने हलचल को रोटेटर प्रारंभ करें.
  8. समाशोधन समाधान निकालें और 1 टेबल में समय पूरा हो गया है जब प्रोटोकॉल में अगले एक जोड़ें.
  9. एक डाकू में रखा जाता है कि गिलास बेकार कंटेनरों में समाशोधन अपशिष्ट लीजिए.
    अंत तक प्रोटोकॉल में प्रत्येक समाशोधन समाधान के लिए पिछला चरण दोहराएँ. एक नए समाशोधन समाधान (DBE को THF से बदल रहा है, उदाहरण के लिए) जोड़ा जाता है जब एक नया पाश्चर पिपेट का उपयोग करें.
  10. Babb या DBE साथ अंतिम समाशोधन चरण में, ऊष्मायन बार बढ़ाया या श किया जा सकता हैनमूने (यह मस्तिष्क की तरह एक बहुत बड़े ऊतक है अगर पारदर्शी / या पीले रंग) पूरी तरह से दृश्य प्रकाश में पारदर्शी हो जब तक ortened.
  11. इमेजिंग कदम सहित हर समय अंतिम समाशोधन समाधान में मंजूरी दे दी अंगों रखें.

3. इमेजिंग के लिए मंजूरी दे अंगों की तैयारी

समय: 5-15 मिनट.

नोट: छवि को मंजूरी दे दी अंगों के रूप में जल्द ही एक पूर्ण समाशोधन हासिल की है. यह अंत करने के लिए, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी (जैसे, Ultramicroscopy) या confocal / बहु photon माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करने के लिए अगले चरणों का पालन करें.

नोट: मंजूरी अंगों समय के साथ उनके प्रतिदीप्ति ताकत उठ जाएगा (विशेष फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे, GFP, एंटीबॉडी लेबलिंग अधिक प्रतिरोधी है और यहां तक कि अब incubations के साथ बेहतर परिणाम दे सकता है). इमेजिंग के लिए, विभिन्न फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी तकनीक clea में अंगों के समुचित से निपटने के रूप में लंबे समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैरिंग समाधान हासिल की है.

  1. प्रकाश पत्र माइक्रोस्कोपी के लिए
    1. जगह या उचित नमूना माउंट.
    2. मैन्युअल रूप नमूना धारक 4 के पेंच मोड़ से मंजूरी दे दी अंग ठीक करें.
    3. अंतिम समाशोधन कदम पर इस्तेमाल किया गया था, जो भी Babb या DBE, से भर जाता है कि thelight पत्र खुर्दबीन के (वरीयत कांच के बने) इमेजिंग कक्ष में नमूना डुबकी.
  2. बहु फोटॉन / confocal माइक्रोस्कोपी के लिए
    1. आम तौर पर तेल या पानी डूब उद्देश्यों का उपयोग जो एक बहु फोटान या confocal माइक्रोस्कोपी, साथ छवि के लिए सक्षम होने के लिए अंतिम इमेजिंग समाधान के साथ एक इमेजिंग स्लाइड (या एक इमेजिंग चैम्बर) पर नमूना माउंट.
    2. ऊतक के चारों ओर एक सीमा बनाने के लिए दंत सीमेंट का प्रयोग करें.
    3. दंत सीमेंट पूरी तरह से कठोर हो जाता है बस से पहले Babb या DBE साथ पूल भरें.
      नोट: दंत सीमेंट जल्दी से solidifies; वास्तविक नमूने प्रयास करने से पहले इसे से परिचित पाने के लिए एक बार कुछ अभ्यास करेंगे.
    4. तुरंत जगहपूल के बीच में और एक गिलास को कवर के साथ कवर मंजूरी दे दी नमूना.
    5. यह पूरी तरह से दंत सीमेंट द्वारा सील और confocal / बहु photon माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिकतम इमेजिंग गहराई तक पहुँचने की अनुमति होगी जो मंजूरी दे दी अंग, की सतह पर छू लेती है जब तक कवर कांच दबाएँ.
      नोट: यह कोई समाशोधन समाधान इमेजिंग के दौरान गिरा दिया जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है. यह Babb / DBE के लिए प्रतिरोधी है या एक सुरक्षा कवर है जब तक लेंस को नुकसान पहुँचा सकता है, समाशोधन समाधान में सीधे इमेजिंग लेंस सूई से बचें.

4. इमेजिंग मंजूरी अंग

समय: 15-45 मिनट.

  1. माइक्रोस्कोप वितरित कर सकते हैं कि सबसे अच्छा प्रस्ताव पर (प्रयुक्त लेंस की अनुमति देता है) पूरे मंजूरी दे दी ऊतक कवर Z स्कैन लीजिए.
  2. उच्च संकल्प छवियों को इकट्ठा करने के लिए हित के क्षेत्रों पर ज़ूम.

सॉफ्टवेयर Amira के साथ डेटा की 5. परीक्षा

  1. छवि वीडियो लोड करेंResolveRT मॉड्यूल के साथ सॉफ्टवेयर अमीरा के लिए है.
  2. "छवि पढ़ें पैरामीटर" खिड़की और ठीक प्रेस में सही voxel आकार दर्ज करें.
  3. 'मल्टी प्लेनर देखें "उप आवेदन का चयन करें. फिर 2 डी और 3 डी मूल्यों का समायोजन, ग्रे मूल्यों के लिए अधिकतम सीमा का चयन करने के लिए "मोटाई" स्लाइडर का उपयोग करें.
  4. विभिन्न 2D झुकाव में स्लाइस ब्राउज़िंग और 3 डी दृश्य में फसल कोने मॉड्यूल का उपयोग करके नमूना कल्पना.
    नोट: प्रोटोकॉल की एक विस्तृत समस्या निवारण गाइड Ertürk एट अल 4 में पाया जा सकता है.

Representative Results

न्यूरॉन्स अत्यधिक अत्यंत लंबे आकारिकी साथ कोशिकाओं polarized हैं. उनके कार्य वे एक दूसरे के बीच और अन्य ऊतकों के साथ कि फार्म कनेक्शन पर निर्भर करता है. इसलिए, न्यूरॉन्स की संरचनात्मक संगठन मानचित्रण वे स्वास्थ्य और बीमारी में कैसे कार्य को समझने के क्रम में अत्यंत महत्वपूर्ण है. हालांकि, पूरे तंत्रिका तंत्र, हाल ही में नामित connectomics 11 के दौरान इस तरह के भारी neuronal कनेक्शन अनुरेखण - अभी तंत्रिका विज्ञान में सबसे कठिन चुनौतियों में से एक बना हुआ है. इस प्रयोजन के लिए यूरोपीय संघ के 12 और अमेरिका में 13 दोनों मानव मस्तिष्क मैप करने के लिए बड़ी परियोजनाएं शुरू की है.

3DISCO विभिन्न अंगों पर नियोजित किया जा सकता है, यह रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क में लंबे neuronal कनेक्शन का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. उदाहरण के लिए, बड़े मंजूरी दे दी रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों के Ultramicroscopy स्कैन का उपयोग कर, axonal कनेक्शन कृंतक रीढ़ की हड्डी (सेंटीमीटर से अधिक का पालन किया जा सकता हैचित्रा 2). इसी तरह रास्ते में, पूरे मंजूरी दे दी माउस मस्तिष्क (चित्रा 3 ए) और हिप्पोकैम्पस (चित्रा 3 बी) मस्तिष्क में neuronal कनेक्शन का पालन करने के लिए imaged किया जा सकता है.

Confocal या बहु photon माइक्रोस्कोपी मंजूरी दे दी अंगों पर प्रयोग किया जाता है, इमेजिंग संकल्प काफी विशेष रूप से Z-आयाम में सुधार किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, GFP-M लाइन चूहों (चित्रा -4 ए) से मंजूरी दे दी रीढ़ की हड्डी डोरियों की बहु फोटॉन इमेजिंग रीढ़ की हड्डी की पूरी गहराई (~ 1.5-2 मिमी) भर में एक सहज छवि को प्राप्त होता है. मंजूरी दे दी रीढ़ की हड्डी पर Confocal microcopy एक समान तरीके (आंकड़े 4 बी और सी) में सुधार के प्रस्ताव बचाता है. मंजूरी दे दी दिमाग की मल्टी फोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग वृक्ष के समान spines (चित्रा 5) सहित neuronal संरचनाओं के ठीक विवरण कल्पना करने के लिए बहुत उच्च संकल्प छवियों को बचाता है. 3DISCO के लिए नमूने वीर, transgene अभिव्यक्ति सहित विभिन्न तरीकों से लेबल किया जा सकताअल अभिकर्मक, डाई ट्रेसिंग और एंटीबॉडी लेबलिंग. उदाहरण के लिए, यह रक्त मस्तिष्क बाधा अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो लेक्टिन संयुग्मित फ्लोरोसेंट tracers 4 का उपयोग कर मस्तिष्क (आंकड़े 6a और ख) और रीढ़ की हड्डी (आंकड़े 6c और घ), (BBB के पूरे vasculature लेबल करने के लिए संभव है ) स्वास्थ्य और रोग में.

Microglia और astrocytes दोनों अत्यधिक अल्जाइमर रोग और दर्दनाक चोटों 14,15 सहित neurodegeneration की विकृति में फंसा रहे हैं. 3DISCO का उपयोग करना, उनके घनत्व और रीढ़ की हड्डी में वितरण (चित्रा 7) या मस्तिष्क का अध्ययन किया जा सकता है.

गैर neuronal ऊतकों भी imaged किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, पूरे कृंतक फेफड़ों में क्लारा कोशिकाओं एंटीबॉडी के साथ immunolabeled किया जा सकता है और एक एकल कोशिका स्तर (8 चित्रा) पर सेक्शनिंग बिना imaged. इसी प्रकार, यह स्पष्ट करने के लिए संभव है और छवि कोशिकाओं जैसेunsectioned अग्न्याशय के ऊतकों (9 चित्रा) में अल्फा कोशिकाओं.

चित्रा 1
चित्रा 1. 3DISCO ऊतक समाशोधन गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए पारदर्शी unsectioned ऊतकों प्रदान करता है. दृश्य प्रकाश के रूप में देखा (एक) साफ़ नहीं किया है और मंजूरी दे दी (ख) रीढ़ की हड्डी के ऊतकों. समाशोधन पर, गहरी ऊतक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी संभव हो जाता है. (ग) साफ़ नहीं किया है और मंजूरी दे दी रीढ़ की हड्डी के ऊतकों 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे. ए, बी = 0.5 मिमी और ग = 100 माइक्रोन में स्केल सलाखों.

चित्रा 2
चित्रा 2. Axonal एक्सटेंशन का पालन करने के लिए रीढ़ की हड्डी की 3DISCO इमेजिंग. तेरा -1 GFP ट्रांसजेनिक माउस लाइन (GFP एम) से विच्छेदित रीढ़ की हड्डी ~ (छोटे टुकड़ों में विभाजित है4 मिमी). छोटे ऊतकों (तालिका 1) के लिए समाशोधन प्रोटोकॉल के बाद के बाद पारदर्शी रीढ़ की हड्डी डोरियों Ultramicroscopy उपयोग करते हुए कल्पना कर रहे थे. क्षैतिज में एक ~ 4 मिमी रीढ़ की हड्डी खंड के 3D पुनर्निर्माण (एक), राज्याभिषेक (ख) और बाण के समान दृश्य (ग). (घ) प्रतिनिधि axons (लाल) का पता लगाया स्केल पारदर्शी दृश्य में दिखाया गया है. (घ) में संकेत क्षेत्र (ई) उच्च बढ़ाई देखें. ए, बी, सी, डी = 0.5 मिमी और = 20 माइक्रोन ई में स्केल सलाखों.

चित्रा 3
मंजूरी दे दी मस्तिष्क और हिप्पोकैम्पस के चित्रा 3. 3DISCO इमेजिंग. मंजूरी दे दी दिमाग और GFP एम चूहों की हिप्पोकाम्पी के उदाहरण एक ultramicroscope साथ imaged थे. Neuronal netwo का प्रदर्शन पूरे मस्तिष्क (एक) और हिप्पोकैम्पस (ख) के 3D visualizationsimaged पारदर्शी ऊतकों में RKS. एक = 2 ​​मिमी में और बी में स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन.

चित्रा 4
चित्रा 4. ऊतक समाशोधन बहु फोटान और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त संकल्प को बढ़ाता है. बहु फोटान (एक) या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged GFP-M चूहों से पारदर्शी रीढ़ की हड्डी खंड (ख, ग). काफी समाशोधन axons और dendrites के ठीक संरचना खुलासा संकल्प और इमेजिंग गहराई में सुधार पर ध्यान दें. एक = 100 माइक्रोन में और बी में स्केल सलाखों, सी = 20 माइक्रोन.

चित्रा 5
चित्रा 5. वृक्ष के समान spines के 3DISCO इमेजिंग. बहु फोटॉन ने उतारी GFP-M चूहों से पारदर्शी मस्तिष्क के ऊतकों. देखें में प्रस्तुत स्कैन प्रांतस्था क्षेत्र की 3 डी visualizations(क) राजनैतिक और क्षैतिज दृष्टिकोण (ख). (ग) ~ में संकेत के स्तर से 50 माइक्रोन प्रक्षेपण (क, ख). (ग) वृक्ष के समान spines (तीर) सहित neuronal संरचनाओं के ठीक विवरण प्रदर्शन में संकेत क्षेत्र (घ) उच्च बढ़ाई. बी में एक = 50 माइक्रोन में स्केल सलाखों, सी = 25 माइक्रोन, डी में = 5 माइक्रोन.

चित्रा 6
16 के रूप में वर्णित चित्रा 6. Vasculature की 3DISCO. पूरे अंगों में रक्त वाहिकाओं को लेबल करने के लिए, लेक्टिन-FITC डाई (समाशोधन से पहले) छिड़काव के दौरान इस्तेमाल किया गया था. यह हम दरियाफ्त की पूंछ नस इंजेक्शन दरियाफ्त की हृदय छिड़काव पर बेहतर संकेत देता है कि पाया उल्लेख है कि उल्लेखनीय है. तय दिमाग और रीढ़ की हड्डी डोरियों इकट्ठा करने के बाद, वे को मंजूरी दे दी और मैं गयाUltramicroscopy द्वारा maged. हीटमैप में पूरे माउस मस्तिष्क vasculature की 3 डी दृश्य (एक) और ग्रे पैमाने पर (एक). एक माउस रीढ़ की हड्डी हीटमैप में खंड (ग) और ग्रे पैमाने (डी) की वाहिका संरचना (ख) 3 डी दृश्य. heatmaps लेक्टिन धुंधला की तीव्रता के आधार पर निर्मित किया गया; ब्लू: कम तीव्रता (पृष्ठभूमि) और लाल: उच्च तीव्रता (वाहिका संरचना). एक = 2 ​​मिमी, बी = 1 मिमी, और में डी सी, = 250 माइक्रोन में स्केल सलाखों.

चित्रा 7
मंजूरी दे दी सीएनएस के ऊतकों में glia कोशिकाओं के चित्रा 7. 3DISCO. Microglia TGH (CX3CR1-EGFP) या astrocytes TGN (hGFAP-ECFP) में GFP व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों की रीढ़ की हड्डी डोरियों को मंजूरी दे दी और बहु photon माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे. Microglia की 3 डी प्रतिपादन सतह मात्रा दृश्य (एक) और पारदर्शी दृश्य (के रूप में दिखाया गया है (ग) एक ऑप्टिकल प्रक्षेपण (~ 50 माइक्रोन) रीढ़ की हड्डी में microglia के विवरण को दिखाने के लिए प्रस्तुत किया है. Astrocytes के 3 डी प्रतिपादन सतह मात्रा दृश्य (एक) और पारदर्शी दृश्य (ख) के रूप में दिखाया गया है. (च) एक ऑप्टिकल प्रक्षेपण (~ 50 माइक्रोन) रीढ़ की हड्डी में astrocytes के विवरण को दिखाने के लिए प्रस्तुत किया है. = 50 माइक्रोन च ए, बी, डी, ई = 100 माइक्रोन में और सी में स्केल सलाखों,.

8 चित्रा
क्रम में क्लारा कोशिकाओं के एंटीबॉडी धुंधला के साथ एक पूरे माउंट फेफड़ों पालि की संख्या 8. 3DISCO. फेफड़ों lobes के पूरे माउंट एंटीबॉडी धुंधला के लिए, 10 सप्ताह पुरानी BALB / सी मादा चूहों पीबीएस के साथ सही वेंट्रिकल के माध्यम से perfused थे फेफड़ों से रक्त को निकालने के. फेफड़े बाद कम से कम तीन बार वीं की मात्रा 4% पीएफए ​​के साथ फुलाया और लगानेवाला में आर टी ओ / एन तय किया गयाई ऊतक. अगले दिन, फेफड़ों संक्षेप में पीबीएस में rinsed थे और सही पालि 48 घंटे के लिए permeabilization के लिए या ऊतक डूब गया जब तक पीबीएस में 1% ट्राइटन X-100 के 5 मिलीलीटर में रखा गया था. सभी stainings 5% FBS और 2% BSA युक्त पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 में प्रदर्शन किया और rinses पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 में थे. विरोधी CC10 साथ धुंधला हो जाना लगभग 6 घंटे के लिए व्यापक washes के द्वारा पीछा 4 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए किया गया था. प्राथमिक एंटीबॉडी के फ्लोरोसेंट लेबलिंग 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 6 घंटे के लिए रात भर के लिए व्यापक washes के द्वारा पीछा विरोधी बकरी एलेक्सा Fluor-594 माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ हासिल की थी. अगले दिन, दाग पालियों में 30 मिनट के लिए 50%, 70%, और 80% THF के माध्यम से मंजूरी दे दी थी DBE में 30 मिनट के द्वारा पीछा डीसीएम में 20 मिनट के द्वारा पीछा 100% THF में तीन से 30 मिनट washes, इसके बाद प्रत्येक. ए और बी = 1 मिमी और ग = 100 माइक्रोन में स्केल सलाखों.

9 चित्रा
आंकड़ा 9. अग्न्याशय की 3DISCO. प्रोटोकॉल में ऊपर वर्णित के रूप में चूहों के छिड़काव के बाद, अग्न्याशय विच्छेदित किया गया था और कम प्रोटोकॉल के साथ मंजूरी दे दी है. प्रतिदीप्ति ग्लूकागन की ATG में डाला CreERT2 साथ अंतर्जात माउस ग्लूकागन ठिकाना फैले 200 KB बीएसी transgene ले चूहों की tamoxifen उपचार से प्रेरित ROSA26 LSL tdTomato पुनर्संयोजन से ली गई है. तीर आइलेट में फ्लोरोसेंट लेबल अल्फा कोशिकाओं के कुछ निशान. ए, बी और सी = 1 मिमी और घ = 500 माइक्रोन में स्केल सलाखों.

तालिका 1
तालिका 1. विभिन्न ऊतकों के लिए ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल. विभिन्न ऊतकों के लिए ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल के उदाहरण हैं. प्रत्येक चरण के लिए समाशोधन समय छोटा या समाशोधन प्रदर्शन में सुधार की जरूरत के रूप में बढ़ाया जा सकता है ध्यान दें. छोटे ऊतकों की लगभग वजन 20-100 मिलीग्राम और मस्तिष्क ~ 300-500 मिलीग्राम है ~ है.TTPs :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

ऊतक समाशोधन तरीकों को मंजूरी दे दी अंगों में अलग ऊतक परतों के अपवर्तक सूचकांक मिलान करके इमेजिंग प्रकाश के प्रकीर्णन को कम करना है. नतीजतन, इमेजिंग प्रकाश गहरी ऊतकों में घुसना और लेबल की कोशिकाओं / अणुओं को प्रोत्साहित कर सकते हैं. 17 समाशोधन ऊतक की इस पुरानी अवधारणा Dodt और उनके सहयोगियों द्वारा 2 बरकरार माउस दिमाग पर तकनीक का पहली परिष्कृत आवेदन के बाद से बढ़ ध्यान प्राप्त किया है. तब से, 3DISCO, एससीए / ई, ClearT2, स्पष्टता और SeeDB 3,4,7,18-20 सहित नई समाशोधन तरीकों की एक तेजी से बढ़ती हुई सूची में नहीं है. संक्षेप में, वे सब फ्लोरोसेंट लेबल के संरक्षण से गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए पारदर्शी अंगों प्रस्तुत करना करना है. उनमें से, 3DISCO सबसे सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के तरीकों में से एक के रूप में बाहर खड़ा है. यह अपेक्षाकृत तेजी से अन्य समाशोधन उपर्युक्त विधियों (1-5 दिनों बनाम वयस्क दिमाग के लिए 2-3 सप्ताह, क्रमशः) 21 की तुलना में है. यह पहले से ही सफलता की गई हैपूरी तरह से इस तरह के मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी, लिम्फ नोड्स, तिल्ली, फेफड़े, ठोस ट्यूमर, अग्न्याशय, और स्तन ग्रंथियों 3,4,9 के रूप में विभिन्न अंगों के लिए आवेदन किया. इसके अलावा, स्वतंत्र अनुसंधान समूहों द्वारा कई प्रकाशनों पहले से ही इमेजिंग 22,23 परिणाम प्राप्त करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया. फिर भी, अलग ऊतक समाशोधन प्रक्रियाओं अलग स्थितियों के लिए फायदेमंद हो सकता है. एससीए / ई और SeeDB भ्रूण ऊतकों 6,7 पर सबसे लागू कर रहे हैं, जबकि उदाहरण के लिए, वे इमेजिंग के दौरान संभालना आसान हो सकता है, जो पानी आधारित समाशोधन तरीके हैं. इसके विपरीत, स्पष्टता एक जटिल और महंगा समाशोधन विधि है. लेकिन यह विशेष रूप से इस तरह के मस्तिष्क के रूप में 8 बड़े ऊतकों में, एंटीबॉडी लेबलिंग के संदर्भ में फायदेमंद हो सकता है.

3DISCO से सबसे अच्छा इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम ऊतक समाशोधन से पहले पूरा किया है जो ऊतक लेबलिंग, है. यह संभव मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत के साथ शुरू करने के लिए आवश्यक है. यह ख कर सकते हैंई सिंथेटिक रंगों, वायरल अभिकर्मक या एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा अनुरेखण, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति सहित विभिन्न तरीकों से हासिल की. यह किसी भी समाशोधन प्रक्रिया के ऊतकों के फ्लोरोसेंट संकेत कम हो जाएगा कि ध्यान में रखा जाना चाहिए. फ्लोरोसेंट संकेत शुरुआत में काफी मजबूत नहीं है इसलिए, अगर - इसे मंजूरी दे दी ऊतकों के समाशोधन इमेजिंग से पहले आसानी से detectable नहीं है यानी गरीब परिणाम होगा.

सुधार के लिए इंतजार कर रहे हैं तरीकों कि समाशोधन की कुछ सीमाएं हैं. एक महत्वपूर्ण सीमा समाशोधन अभिकर्मकों को मंजूरी दे दी अंगों की संरचना में परिवर्तन के बाद से, वे रहते ऊतक पर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है. इसलिए, इस तरह के photoactivatable mEos2 24 के साथ ही प्रयोगों फिक्सिंग और समाशोधन से पहले किया जाना चाहिए. समाशोधन पर, उज्ज्वल और photostable प्रोटीन से फ्लोरोसेंट संकेत के सुपर संकल्प इमेजिंग संभव हो जाता है. इसके अलावा, क्योंकि समाशोधन प्रोटोकॉल घटता हैफ्लोरोसेंट प्रोटीन की तीव्रता को मंजूरी दे दी अंगों लंबी अवधि के लिए जमा नहीं किया जा सकता है. यह कुछ अंगों को मंजूरी दे दी जानी करने के लिए कठिन हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है. विच्छेदित अंगों रक्त कोशिकाओं (जैसे, तिल्ली, जिगर) की उच्च मात्रा बरकरार रहती है, तो विशेष रूप से, वे स्पष्ट और छवि को अपेक्षाकृत कठिन हैं. यह ऐसे वयस्क कृंतक मस्तिष्क के रूप में बड़े ऊतकों, के लिए एक पूर्ण समाशोधन प्राप्त करने के लिए भी अपेक्षाकृत कठिन है. इस तरह के ऊतकों, दूसरी ओर, फ्लोरोसेंट संकेत को कम कर सकता है, जो लंबे समय तक ऊष्मायन बार पड़ सकता है. इसके अलावा, माइक्रोस्कोपी तरीकों का विकास छवि बड़े पारदर्शी अंगों पर एक बार एक उच्च संकल्प पर संबोधित किया जाना एक का इंतजार कर रहा है जरूरत है कि कर सकते हैं. तकनीक का एक अन्य महत्वपूर्ण सीमा ऊतक लेबलिंग है. आनुवंशिक या वायरस अभिव्यक्ति के माध्यम से एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत आदर्श है, नहीं हर कोशिका या अणु आनुवंशिक रूप से या virally लेबल किया जा सकता. दूसरी ओर, मोटी ऊतकों की एंटीबॉडी लेबलिंग एक सरल प्रक्रिया या भी नहीं पीओ नहीं हैज्यादातर मामलों में ssible. यह 3 (एक कुछ हफ्तों के लिए कई दिनों) विशेष permeabilization प्रोटोकॉल और लंबी ऊष्मायन बार पड़ सकता है. यह ऊतकों के कारण निर्जलीकरण और delipidation के लिए मुख्य रूप से साफ़ करने के बाद (रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के लिए मापा) प्रत्येक आयाम में ~ 20% हटना है कि मन में रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है. इस संकोचन ratiometrically होता है और मात्रा का ठहराव चरणों में सही किया जाना चाहिए. प्रस्तुत परिणामों में मनाया के रूप में, fluorescently लेबल संरचनाओं को मंजूरी दे दी ऊतकों में प्रोटीन अखंडता का संकेत है, जो बरकरार रहेगा. जैसे, Focusclear जो स्पष्टता या 80% ग्लिसरॉल में प्रयोग किया जाता है क्योंकि अंतिम मंजूरी दे दी ऊतक के हाइड्रोफोबिक प्रकृति के कारण, यह आगे एंटीबॉडी के साथ दाग नहीं किया जा सकता या पानी युक्त समाधान में एम्बेडेड. अंत में, यह इमेजिंग डेटा की भारी आकार का विश्लेषण करने के लिए एक चुनौती है. एक पूरी murine मस्तिष्क एक सेलुलर संकल्प पर स्कैन किया जाता है जब उदाहरण के लिए, यह वांछित Str का पता लगाने और यों तो बहुत मुश्किल होगाuctures (जैसे, neuronal या glia नेटवर्क) और एक स्वचालित तरीके से विभिन्न नमूनों से अधिक की तुलना करें. शोधकर्ताओं ने नए समाशोधन तरीकों बाहर खोजने के उद्देश्य जबकि सारांश में,, (विविध ऊतकों समाशोधन की कठिनाई, बड़े क्षेत्रों के उच्च संकल्प इमेजिंग, और जटिल डेटा विश्लेषण) ऊपर विभिन्न चुनौतियों समानांतर में सुधार किया जाना चाहिए.

अंत में, 3DISCO सहित हाल ही में विकसित ऊतक समाशोधन तकनीक, सुंदर ढंग से बरकरार अंगों के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग अब संभव है कि प्रदर्शित करता है. इन विधियों का प्रयोग, वैज्ञानिकों बरकरार अंग में कोशिकाओं और अणुओं की संरचनात्मक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं. पारदर्शी अंगों पर इन अग्रणी 3 डी इमेजिंग अध्ययन जटिल शारीरिक और स्वास्थ्य और रोग में ऊतकों / अंगों की आणविक संगठनों समझने के लिए शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या को प्रेरित.

Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम Lectin डाई की पूंछ नस में इंजेक्शन के साथ बेहतर vasculature इमेजिंग के अनुभव साझा करने के लिए स्क्रिप्ट कथन, एन बिएन-ly में भाग लेने के लिए, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए बी bingol (Genentech) सी. Hojer धन्यवाद, और एम Solloway (Genentech ) अग्न्याशय इमेजिंग में इस्तेमाल चूहों के लिए. GFP-M रेखा आर Littman (NYU) द्वारा जे Sanes (सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय) और CX3CR1-GFP चूहों द्वारा बनाया गया था. काम Genentech, इंक द्वारा समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thy-1 GFP (GFP-M) mouse Can be obtained from Jackson.
CX3CR1 GFP mouse Can be obtained from Littman lab at NYU.
TgN(hGFAP-ECFP) mouse Can be obtained from Jackson.
Paraformaldehyde Sigma P6148
Na2HPO4 Mallinckrodt 7917-16
NaH2PO4 Mallinckrodt 7892-04
2-2-2 Tribromoethanol Sigma T48402
2-Methyl-2-butanol Sigma 152463 Used to prepare Avertin solution.
Saline Braun
Tetrahydrofuran Sigma 186562-12X100ML
Dichloromethane Sigma 270997-12X100ML
Dibenzyl ether Sigma Sigma, 108014-1KG
Benzyl alcohol Sigma 305197-100ML
Benzyl benzoate Sigma B6630-250ML
Lectin FITC Sigma L0401-1MG
anti-CC10 Santa Cruz SC-9772 0.388888889
Heparin APP pharmaceuticals 504001 Used in perfusion.
Glass vials VWR 548-0554
Forceps FST 11251-10
Mini Rotator VWR 100498-878
Aluminum Foil Fisherbrand 01-213-104
100 ml Media Storage Bottles Kimax Media Bottles EW-34523-00
Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head Gilson, Inc F110701 and F117606
Microscopy slide VWR 48311-703
FastWell Grace Bio-Labs FW20
Cover slip Corning 2940-245
Glass petri dish Corning Pyrex 3160-101
Dental cement Lang Dental 1223PNK
Quantofix Peroxide Test Strips Sigma 37206
Amira with RT resolve microscopy module Visage Imaging image analysis software
Imaris Bitplane imaging image analysis software
ImageJ NIH freeware

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References

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Comments

1 Comment



  1. Conventionally we are limited in the knowledge of biology and science due to lack of resources and researches. But now as we are moving in new era, researchers are getting great benefit to study developmental problems and disease. Now various medical devices are out there whose example is available at http://www.ilexmedical.com/products.php?act=cat helping researchers to look inside an organism and figure out what exactly went wrong and when. Researchers can thoroughly look tissues, organs and even an entire body without any trouble. Certainly such techniques are practical for many fields in biology!!!!

    Reply
    Posted by: Isabella L.
    March 25, 2015 - 8:13 AM

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